Summary
Die Konstruktion und Montage von Mikroantriebe für in vivo elektrophysiologischen Aufnahmen von Gehirn Signale von der Maus beschrieben. Durch das Anbringen Mikroelektroden Bundles robust fahrbare Träger erlauben diese Techniken für die langfristige und stabile neuronale Aufnahmen. Das leichte Design ermöglicht uneingeschränkte Verhaltensleistung durch das Tier folgende Laufwerk Implantation.
Abstract
State-of-the-art elektrophysiologischen Ableitungen aus den Gehirnen von frei lebenden Tier den Forschern erlauben, gleichzeitig zu untersuchen lokalen Feldpotentiale (LFPs) aus Populationen von Neuronen und Aktionspotentiale von einzelnen Zellen, wie das Tier greift in experimentell relevanten Aufgaben. Chronisch implantierten Kleinstantrieben ermöglichen Gehirn Aufnahmen über einen Zeitraum von mehreren Wochen dauern. Miniaturisierte Antriebe und Leichtbau-Komponenten erlauben für diese langfristige Aufnahmen in kleinen Säugetieren, wie Mäusen auftreten. Durch die Verwendung Tetroden, die aus dicht geflochtenen Bündeln von vier Elektroden in der jeder Draht einen Durchmesser von 12,5 um bestehen, ist es möglich, physiologisch aktiven Neuronen in oberflächlichen Hirnregionen wie der Großhirnrinde, dorsalen Hippocampus und subiculum isolieren, sowie als tiefere Regionen wie dem Striatum und der Amygdala. Darüber hinaus gewährleistet diese Technik stabil, high-fidelity neuronalen Aufnahmen als das Tier mit einem Sorten in Frage gestellt wirdty von Verhaltens-Aufgaben. Dieses Manuskript beschreibt verschiedene Techniken, die optimiert wurden, um aus dem Gehirn der Maus aufzeichnen. Zuerst zeigen wir, wie man Tetroden herzustellen, laden Sie sie in fahrbaren Rohre und Gold-Platte ihre Tipps, um ihre Impedanz von MOhm reduzieren kOhm Bereich. Zweitens zeigen wir, wie Sie eine benutzerdefinierte Microdrive Montage zum Tragen und Bewegen der Tetroden vertikal, mit dem Einsatz von kostengünstigen Materialien zu konstruieren. Drittens zeigen wir die Schritte zur Montage eines handelsüblichen Microdrive (Neuralynx VersaDrive) die entworfen, um unabhängig bewegliche Tetroden tragen wird. Schließlich präsentieren wir repräsentative Ergebnisse der lokalen Feldpotentiale und Single-Unit-Signale in der dorsalen subiculum von Mäusen erhalten. Diese Techniken können leicht modifiziert werden, um verschiedene Arten von Elektroden-Arrays und Aufzeichnungsschemata im Gehirn der Maus unterzubringen.
Introduction
Die Nutzung der Mikroelektroden-Technik zum Aufzeichnen extrazelluläre neuronale Signale in vivo hat eine lange und geschätzte Tradition in der Neurowissenschaft 1, 2. Die Fähigkeit, elektrische Aktivität von vielen Hirnregionen in frei lebenden Tier aufzunehmen ist allerdings eine neuere Technologie, die immer häufiger als der Software-Pakete für die Erfassung, Analyse und Diskriminierung von neuronalen Signalen wird immer ausgefeilter und benutzerfreundlicher 3, 4. Die technologischen Fortschritte auf der Software-Seite sind auch durch Reduzierung des Gewichts und der Großteil der implantierbare Geräte, die festgelegt wurden, ausreichend für die Aufnahme in kleine Säugetiere wie Mäuse skaliert begleitet. Durch die Verwendung von leichten (meist aus Kunststoff)-Komponenten, sind die Forscher in der Lage, die für Kleinstantrieben unabhängige Positionierung der Elektroden oder Tetroden, um eine Vielzahl von Hirnregionen 5-7 gezielt erlauben konstruieren. Selbst tiefe Strukturen des Gehirns, wie derAmygdala 6 und das Striatum 5, kann routinemäßig mit der Auswahl eines entsprechend langen Antriebsschraube ausgerichtet sein. Diese Aufnahmetechnik Forschern erlauben, High-Fidelity-neuronale Signale zu erhalten und sind im Register mit der elektrischen Aktivität einzelner Neurone aufgezeichnet intrazellulär 8, 9. Mit diesen Arten von Mikroantriebe, haben wir erfolgreich ein-Einheiten von Mäusen aufgezeichnet für bis zu zwei Monate nach der Implantation 10. Darüber hinaus hat die leichte Art der Geräte (ca. 1,5-2,0 g) in Verhaltensleistung, die vergleichbar mit nicht-implantierten Mäuse in vielen Verhaltensstörungen Aufgaben geführt. Insbesondere haben wir gezeigt, dass Mäuse implantiert normale Leistung zeigen in dem Roman Objekterkennung Aufgabe 10 und dem Objekt Platz Task (unveröffentlichte Daten).
Die Verwendung von Microdrives gekoppelt mehrere Tetroden ermöglicht es den Forschern zu überwachen und zu analysieren neuronale Aktivität auf der Netzebeneaber auch die Aufnahme von mehreren Single-Einheiten innerhalb des Gehirns. Recording mit diesen Tetroden hat mehrere große Vorteile für Einheit Zwecke der Identifizierung und ermöglicht die hohe Genauigkeit Erwerb und Diskriminierung von mehreren Single-Einheiten 11. Wir beschreiben, wie zu fabrizieren und Gold-Platte tetrode bündelt und anschließend laden Sie sie in fahrbaren Elektrode Träger. Eine Art von Antrieb Träger beschreiben wir im Handel erhältlich ist und das andere ist ein einfaches, aber leicht erweiterbar, Antriebskonzept, dass mehrere Träger und tetrode Regelungen ohne eine signifikante Investition von Ressourcen aufnehmen kann.
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Protocol
1. Tetrode Fabrication
- Starten Sie durch mit isolierten 12,5 um (0,0005 ") Kerndurchmesser Platin-Iridium-Draht von California Fine Wire. Die Länge des Drahtes sollte auf die passende Länge für die Zielstruktur geschnitten werden. Beispielsweise den Draht auf mindestens 30 cm lang für die Ausrichtung der Rückenflosse subiculum oder Hippocampus.
- Falten Sie den Draht über in der Mitte, so dass es zwei parallele Drähte, die 15 cm lang sein wird sind. Hängen Sie den Mittelpunkt dieses Drahtes über einen horizontalen Arm zu vier parallele Drähte von 7,5 cm in der Länge zu bilden. Weiter befestigen gummierte Clip in der Nähe der Unterseite des drapierten Draht, wodurch ein Bündel von vier Adern.
- Legen Sie die Gummi-Clip in der motorisierten Tetrode Spinner, darauf achten, dass der Draht straff, aber nicht zu straff oder Gewicht Lager, wie es während der Spinnverfahren brechen.
- Schalten Sie die Tetrode Spinner auf "Manual"-Modus und drücken Sie den Joystick, um "Rechts", um den Draht im Uhrzeigersinn drehen. Der Spinnerwird bei etwa 2 Hz zu drehen, wodurch ein enges Bündel von vier Drähte, die tetrode bilden.
- Bewerben 80 Umdrehungen im Uhrzeigersinn dann stoppen, indem Sie "Up" auf dem Joystick. Dies unterbricht die motorisierte spinner. Weiter gelten 20 entgegen dem Uhrzeigersinn ("Links"), Drehungen, um die Spannung auf der tetrode freizugeben. Die endgültige Zahl der Drehungen pro Länge des Drahtes zu 8 Umdrehungen pro Mikrometer sein.
- Verwenden Sie die Heißluftpistole auf der unteren Stufe 1, die ein Maximum von 400 Grad erreicht, um die Drähte miteinander verschmelzen durch Schmelzen des VG Bindeüberzug. Halten Sie die Heißluftpistole ~ 2 cm aus dem Draht und führen Sie die Waffe nach oben und unten die gerade Länge des Drahtes für ca. 5 sec aus verschiedenen Blickwinkeln. Achten Sie darauf, ständig fegen die Heißluftpistole und es nicht halten jede einzelne Stelle, da dies die HML Isolierung schmelzen und bewirken, dass die Drähte miteinander zu verschmelzen innerhalb des Bündels.
- Machen Sie einen Schnitt an der Spitze der tetrode (in der Nähe der horizontalen Arm) und dann die tetrode aus dem Clip an der Unterseite. Schneiden der einzelnen Schleife, so dass es vier separate Leitungen an einem Ende der Tetrode sind, werden diese Leitungen elektrisch mit Gold Stifte oder einer Leiterplatte in einem späteren Schritt verbunden werden.
- Legen Sie das ausgefüllte tetrode in einem staubfreien Betrieb zur Aufbewahrung, bis das Laufwerk abgeschlossen ist.
2. Individuelle Microdrive Versammlung
- Zuerst bauen die Basis mit dem Microdrive (n) halten wird. Die Basis des implantierten Microdrive ist in der Regel am stabilsten, wenn sie gesichert ist und entlang der Mittellinie des Schädels. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, um eine Basis mit einem einzigen Microdrive bis vier Polyamidrohr Träger halten bauen. Zusätzliche Kleinstantrieben und Röhren können leicht hinzugefügt werden, wie gebraucht.
- Beginnen Sie mit einer ca. 20 mm quadratisches Stück Plexiglas Acrylglas (5 mm dick) und Sand das Acryl in einer Form, die es der Maus frei bewegen mit dem Laufwerk, nachdem es auf dem Kopf implantiert wird.
- Anschließend montieren Sie die Antriebseinheit. Verwenden Sie maßgeschneiderte 30,3 x 6,3 mm Messing Führungen, die das Laufwerk Schraube tragen wird. Erstens, löten zwei Messing Führungen zusammen senkrecht. Die vertikale Führung Messing hält das Laufwerk Schraube und Elektroden, während die horizontale Stück in den Acryl-Basis verklebt werden.
- Nach dem Löten das Messing Stücke zusammen, beginnen Montage des Antriebs selbst, indem ein Linsenkopf Messing Schraube durch das obere Ende der Führung und in einem Block Delrin Kunststoff. Der quadratische Block ist so ausgelegt, dass die Gewindebohrung etwas außerhalb der Mitte (0,2 mm) ist, die sich in einer Fläche des Blocks vorsteht sehr leicht aus der Führung. Dies ist die Seite, wo die Polyamidröhre Tragen der Elektroden sitzen.
- Mit dem Delrin Block innerhalb der Führung und der Schraube den ganzen Weg durch, fädeln ein hex Messing Mutter, bis die Mutter fast berühren wird die Unterseite der Führung. Ziehen Sie die Mutter voll, sondern schmelzen eine kleine Menge von Lot auf das Ende, um die Mutter und die Schraube kommen, aber darauf achten, nicht zu löten anytHing auf der Führung. Nun sollte Drehen der Schraube bewegen Sie den Block Delrin oben (im Uhrzeigersinn) und nach unten (gegen den Uhrzeigersinn) vertikal entlang dem Gewinde. Abgeschnitten Thread, vorbei an der Lötmutter vorsteht.
- Sobald das Laufwerk montiert worden ist, gehen Sie zurück auf die Acryl-Basis und schneiden Sie einen 3 mm breiten Schlitz, wo die Elektrode Antrieb sein wird. Übergeben Sie die horizontale Messing Führung durch den Schlitz und dann cryanoacrylate Leim, um das Stück an der Basis zu sichern.
- Setzen Sie den Acryl-Basis in einen Schraubstock, um sie zu sichern. Legen Sie eine elektronische Schnittstellenkarte (EIB) auf der Oberseite der Base und markieren Sie die Stellen der beiden Bohrungen. EIBS sind Mikrochips, die ein Signal zwischen den Elektroden Drähte und einen Vorverstärker headstage bieten. Mit einem 1,5 mm Spitze Bohrer bohren sorgfältig an den Markierungen Löcher für Schrauben, die die EIB in Position zu halten, auf der Oberseite der Basis wird. Legen Sie die EIB und Faden zwei Messing-Schrauben in die Löcher.
- Verwenden Mikro Präparierscheren zu vier 7 mm lange Stücke geschnitten Polyamide Schlauch. Linie die vier Rohre nebeneinander auf einem Stück gefaltete Band Labor. Bewerben Cyanacrylat zum Zentrum, um sie miteinander zu verbinden, sondern nehmen Sie vorsichtig nicht zu kleben innerhalb der Rohre selbst zu bekommen. Lassen Sie die verbundenen Rohre vollständig trocknen.
- Drehen Sie das Laufwerk Basis 90 Grad, so dass die EIB-Chip vertikal ist und der Antrieb ist horizontal mit dem vorstehenden Delrin Block nach oben positioniert. Blick durch ein Binokular, eine kleine Menge Sekundenkleber auf der Delrin Gesicht vorsichtig abtupfen dann die vier verbundenen Rohre auf den Leim. Lassen Sie den Kleber vollständig eingestellt werden, bevor Sie versuchen, das Laufwerk zu verschieben.
- Testen Sie, ob die Polyamid-Rohre sicher befestigt sind und dass die gesamte Baugruppe bewegt reibungslos ohne Berührung der Anleitung oder auf Widerstand.
- Als nächstes bereiten die Erdungsschraube und verbinden Sie das Erdungskabel an die EIB. Machen Sie eine Erdungsschraube, indem sie eine Schraube aus Messing (3/32 ") und Abschleifen die Fäden, bis nur noch 1-2 Fäden bleiben. Dieser sollte ~1 mm als dieser Schraube wird innerhalb des Schädels sitzen und ist nicht für die Gehirngewebe eindringen.
- Schneiden Sie ein 30 mm Länge von Kupferdraht (die genaue Länge hängt davon ab, wo auf dem Schädel des Tieres Boden zu setzen). Der Kupferdraht sollte 100 sein - 500 um (0,004 bis 0,02 ") im Durchmesser, ist dies entspricht in etwa 38 AWG bis 24 AWG Draht Übernehmen Flussmittel an beiden Enden der Kupferdraht An einem Ende, löten die Erdungsschraube an.. der Draht. Am anderen Ende, löten ein EIB-Nadel in Gold. Dieses Erdungskabel kann aufgehoben werden und mit dem EIB später während der Implantation Chirurgie.
- Der nächste Schritt ist, um die Elektroden durch die Polyamid-Rohre leiten und schließen Sie sie an den Kanal Löcher auf dem EIB-Chip. Schalten Sie das Laufwerk Schraube komplett, so dass die Rohre an ihren oberen Position sind im Uhrzeigersinn.
- Für einzelne Elektroden, schneiden Sie ein 50 mm Länge Stableohm 50 uM Draht und führen sie durch ein Polyamid-Rohr, so dass sie mindestens 2,0 mm über das Rohrende erweitern (für die Ausrichtung subiculum oderHippocampus). Tragen Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber an der Spitze des Rohres, die Anbringung der Draht an der Röhre und die Verhinderung jeglicher Draht Bewegung. Dann verbinden Sie das lose Ende des Drahtes an einer EIB-Kanal Loch mit einer Nadel in Gold. Schneiden Sie das überschüssige Draht mit einer feinen Schere. Wiederholen Sie für andere Mikroelektroden.
- Für den Anschluss Tetroden, nehmen Sie eine abgeschlossene tetrode aus der Aufbewahrungsbox. Führen Sie das Ende des fusionierten tetrode durch ein Polyamid Rohr und lassen Sie es mindestens 2,0 mm über das Rohrende (für subiculum oder Hippocampus) erstrecken. Tragen Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber an der Spitze des Rohres, die Anbringung der tetrode mit dem Rohr und verhindert jede Bewegung. Nehmen Sie die vier lose Drähte am anderen Ende des tetrode und verbinden Sie jeden Draht auf ein EIB-Kanal Loch mit einer Nadel in Gold. Schneiden Sie das überschüssige Draht. Wiederholen Sie dies für die anderen Tetroden.
3. VersaDrive Versammlung
- Beginnen Sie den Bau einer vier tetrode VersaDrive; diese besteht aus einer Basis, Gehäuse und Kappe pieces.
- Schneiden einer Polyamidschlauch bis 10 mm und führen sie durch das kleinste Loch auf einer Tetrode Träger. Lassen Sie das Rohr in der Vergangenheit die Träger sehr leicht (0,5 mm) zu verlängern. Mit 5-min Epoxy zu kleben die Polyamidrohr im Ort, wobei Sie darauf achten, nicht zuzulassen, das Epoxidharz in die Röhre selbst gehen. Wiederholen Sie dies für drei weitere Rohre und Träger.
- Nachdem das Epoxid vollständig festgelegt ist, führen jeweils Polyamid Rohr durch eines der vier Löcher auf der Basis VersaDrive. Wenn alle vier Rohre durch ihre Löcher sind, schieben ein Insekt Stift durch das äußere Loch, das die Tetrode Träger ausgerichtet zu halten, und dient als Schiene für den Träger, auf Reisen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die drei anderen Trägern.
- Nehmen Sie eine Kappe und richten Sie es mit den vier Insektennadeln so dass die Kappe die Basis abdeckt und die tetrode Träger innerhalb der Kappe befinden. Thema ein 1 mm x 5 mm Maschine Schraube durch das entsprechende Loch in der Kappe und in den tetrode Träger. Dies wird die Antriebsspindel zum Bewegen des Trägers nach oben und unten. Repessen diese für die anderen drei Schrauben.
- Drehen Sie alle Schrauben im Uhrzeigersinn, bis tetrode Träger an ihren oberen Position befinden und die Polyamid-Schläuche sind sichtbar durch das Öffnen der Kappe. Mit feinen Mikro Sezieren Schere, schnitt den Schlauch direkt unter (1 mm) die Basis, so dass alle vier Polyamid Rohre gleicher Länge sind.
- Mit einem Binokular, sorgfältig einfädeln einem tetrode durch eine Polyamid-Rohr. Es ist wichtig, die tetrode Draht perfekt gerade, wie es Fortschritte halten durch das Rohr wie keine Knicke oder Biegungen machen es sehr schwierig, völlig den Faden in die tetrode durch. Wiederholen Sie dies für drei weitere Tetroden.
- Sobald alle Tetroden in ihre Röhren sind, sorgfältig anwenden einen kleinen Tropfen Sekundenkleber an die Spitze jeder Röhre, die Sicherung der Tetroden innerhalb ihrer jeweiligen Rohre. Seien Sie vorsichtig, keine Cyanacrylat zwischen den Trägern oder auf dem losen tetrode Drähte, die durch die Kappe hervorstehen bekommen.
- Schneiden Sie die Tetroden so dass sie an den Rohren nur verlängern2,0 mm (für subiculum oder Hippocampus). Dann legen Sie das Laufwerk Basis (mit den vier Insektennadeln eingesetzt) in den VersaDrive jig. Die andere Hälfte der Vorrichtung hält die VersaDrive Kappe, die alle Aufnahmeöffnungen für die Herstellung der Kanal-Verbindungen hat.
- Schalten Sie das Laufwerk Schraube komplett, so dass die Tetroden in ihrer niedrigsten Position sind gegen den Uhrzeigersinn.
- Vor dem Anschließen der Kabel an die tetrode gold Aufnahmen, zuerst das Erdungskabel an der Kappe. Die Kappe hat VersaDrive zwei Stiftlöcher für Masseverbindungen an der mittleren Position der beiden Reihen von Löchern. Schneiden Sie ein Kupferdraht von mindestens 30 mm (abhängig, wo auf dem Schädel, den Boden zu legen) und führen Sie es durch eines dieser Löcher Zentrum. Der Kupferdraht sollte 100 sein - 500 um (0,004 bis 0,02 ") im Durchmesser, ist dies entspricht in etwa 38 AWG bis 24 AWG Draht schieben einen goldenen Behälter durch das Loch, um den Kupferdraht an Ort und Stelle zu fangen und schneiden Sie überschüssigen Draht.. Am anderen Ende des Kupferdrahtes, Flussmittel und Anlötenr dieses Drahtende zu einer Erdungsschraube (siehe 2.11.). Wiederholen Sie für die zweite Erdungskabel.
- Als nächstes führen alle losen Drähte tetrode (es sollte sechzehn insgesamt) durch ihre jeweiligen Aufnahme Löcher auf der Kappe. Es ist am besten, um mit einem tetrode beginnen und fädeln die einzelnen Leitungen an die entsprechenden vier Löcher, die am Ende direkt über es. Die einzelnen tetrode Drähte sollten mit leichtem Druck behandelt werden, wie sie zerbrechlich und kann leicht quetschen, wenn gegriffen zu fest. Installieren Sie die Kappe durch Aneinanderreihung der Insektennadeln Löcher und drücken Sie passend zu der Basis.
- Mit den vorstehenden tetrode Drähte durch den Deckel, drücken Sie passen die goldenen Gefäße, die Drähte in tetrode Ort zu erfassen und die elektrischen Anschlüsse. Ungefähr 50% der Drähte aus befestigt werden (über dem Deckel), sobald die Gold Hülse nach unten gedrückt wird. Trim überschüssige Draht, der aus der Oberseite der Kappe bleibt. In seltenen Fällen (weniger als 5%), wird drängen auf den nach unten gold Aufnahme zerquetschen den Drahtund brechen sie unter Aufnahme, was in einem getrennten Kanal. Diese Trennung kann nicht bis zur Impedanz Tests und Galvanotechnik Schritte (siehe 4.7) realisiert werden.
- Wiederholen Sie das Einpressen Verfahren für die drei anderen Tetroden. Schalten Sie das Laufwerk Schrauben im Uhrzeigersinn, um sie zu bewegen nach oben und stellen Sie sicher, dass das Laufwerk Bewegung glatt ist.
4. Vergoldung der Elektroden-Tipps
- Unabhängig davon, welche Art von Mikroelektroden verwendet wird, sollten die Spitzen der Elektroden vergoldet sein, um Spitze Impedanz zu reduzieren. Dies maximiert die Fähigkeit, sicher zu erfassen und zu unterscheiden Single-Unit-Aktionspotentiale. Testen Sie die Elektrode mit der Impedanz Neuralynx nanoZ Gerät. Die nanoZ ist ein Computer-basiertes Gerät, Impedanz misst und ermöglicht automatisierte Galvanotechnik.
- Zuerst drehen Sie die Schrauben Microdrive unten (gegen den Uhrzeigersinn) in die unterste Position. Dann sicheren Montage des Microdrive an einer Klammer, die es Absenken wirddie Elektrode in die Spitzen Goldplattierlösung.
- Füllen Sie einen Turm mit Delrin SIFCO Gold-Lösung und der andere Turm mit destilliertem Wasser. Senken Sie die Elektrode in die Spitzen gold Lösung.
- Stecken Sie das USB-Kabel in nanoZ einem Windows-basierten Computer und öffnen Sie dann die nanoZ Programm. Dieses Programm gibt Impedanz Lesungen und führen Vergoldung auf jeden angeschlossenen Kanal des Microdrive.
- Öffnen Sie den Gerätemanager Drop-Down und wählen Sie die nanoZ, nach dem es erscheint "Verbindung hergestellt" am unteren Rand des Fensters. Als nächstes wählen Sie den passenden Adapter für die Prüfung in der Drop-Down-Menü. Klicken Sie auf "Test Impedanzen" und setzen Sie den Test Frequenz bis 1004 Hz (40 Zyklen, 0 ms Pause). Klicken Sie auf "Test-Sonde", die die "Probe Report" Fenster, das alle verfügbaren Kanäle mit ihren Lesungen MOhm zeigt öffnen. Bewahren Sie diese Impedanz Werte durch Anklicken des Disketten-Symbol oder durch Auswahl von "File" und dann "Save report".
- Als nächstes wird auf "DC Galvanisieren" klicken und zuweisendie folgenden Werte: Mode = Spiel Impedanzen Galvanisierstrom = -1.0 uA, Target = 350 kOhm bei 1.004 Hz, 5 Pisten, 5 sec Intervall, 2 sec Pause.
- Klicken Sie auf "Autoplate". Das Programm wird zum ersten Mal las die Impedanz jedes Kanals, dann gelten die angegebenen Strom an diesen Kanal, Re-Test der Impedanz und die geltenden als bis das Ziel Impedanz (oder ein niedrigerer Wert) erreicht ist erforderlich. Während das Ziel ist Elektrodenimpedanz zu reduzieren, ist es möglich, dass Kanäle unter den Werten von 100 kOhm galvanisieren. In solchen Fällen ist es möglich, daß benachbarte Drähte auf der Tetrode sind miteinander kurzgeschlossen. Wenn dies geschieht, kehren Sie die aktuelle Polarität (+ 1,0 uA), um überschüssige Goldpartikel zu entfernen, Re-Test der Impedanz des Kanals, und wiederholen Sie die Galvanotechnik. Typische endgültige Impedanz Werte auf ein Bündel von vier 12,5 uM Drähte reichen von 150 bis 325 kOhm.
- Wenn es einen einzigen Kanal, der nicht unter 350 kOhm hat plattiert wiederholen galvanischen Prozess.Das Programm wird über Kanäle, die das Ziel bereits erreicht haben, springen und wird nur Plattenkanälen welche nicht.
- Sobald alle Kanäle auf ein akzeptables Impedanz überzogen worden, schließen Sie das Programm und nanoZ trennen Sie das Gerät. Heben Sie die Elektroden aus der Beschichtungslösung und senken Sie die Spitzen in dem destillierten Wasser Delrin Turm um abspülen überschüssige Goldpartikel.
- Schalten Sie das Laufwerk Schrauben im Uhrzeigersinn, bis die Elektroden, um ihre Top-Position angehoben werden. Nun ist die Microdrive und Elektroden sind bereit für die Implantation.
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Representative Results
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Discussion
Wir haben eine Reihe von Techniken zur Konstruktion leicht und kompakt microdrives für die Aufnahme von extrazellulärem Einheit und Feldpotential Aktivität bei Mäusen beschrieben. Durch den Aufbau von benutzerdefinierten Kleinstantrieben mit Basen aus Acrylglas (Methylmethacrylat) gestaltet, können die Core-System leicht für mehrere Laufwerke und für das Targeting von einer Vielzahl von neuronalen Regionen angepasst werden. Wir haben erfolgreich das System zur Aufzeichnung von mehreren Zielen und Gehirn mit größeren Arrays für Aufnahmen bei Mäusen verändert. Mit weiteren Modifikation kann motorischen Antrieb Elemente eingebaut, um für Remote ermöglichen und möglicherweise genauer Platzierung der Elektroden 7.
Wir möchten betonen, dass diese Aufnahmegeräte der Forscher Flexibilität bei der Nutzung entweder einzelne oder Mikrodrähte Drahtbündeln wie Tetroden geben. Größere Durchmesser einzigen Mikrodrähte sind robuster und besser geeignet für die Aufnahme von LFPs innerhalb Hirngewebe. While Tetroden auch zur LFPs aufzuzeichnen, sind sie für die Isolierung von Single-Unit-Aktionspotentiale 8, 11 optimiert. In unserem Labor haben stabile Aufnahmen von Single-Einheiten wurden bis zu 8 Wochen nach der Implantation erhalten. Allerdings sind diese Aufnahmen nicht von den gleichen vermeintlichen Einheiten während dieser ganzen Zeit. In unseren Händen, kann ein Single-Unit über mehrere Aufnahmen (je 30 Minuten), die einen Zeitraum von 3 Tagen erstrecken verfolgt werden, was eine inter-Sitzung 10 Stabilität. Auf der anderen Seite kann robust LFPs und Netzwerk Schwingungen über den gesamten nach der Implantation Zeitraum aufgezeichnet werden, vor allem bei der Verwendung von Draht mit größerem Durchmesser wie 50 um (0,002 ") Draht. Beachten, dass die hier beschriebenen Verfahren zur einseitigen Aufnahme anwenden Hirnstrukturen, aber sie können leicht für bilaterale Aufnahmen geändert werden. Zum Beispiel, wenn die Erstellung benutzerdefinierter Kleinstantrieben, muss der entsprechende Abstand zwischen den Antrieben vorher bestimmt werden, um zu stützennungsgemäß Ziel Hirnstrukturen bilateral.
Wie Microdrive Komponenten leichter geworden und die Software auf neuronale Signale analysieren verbessert, setzt die Bibliothek potentieller Gehirn Ziele und überprüfbare Hypothesen innerhalb Neurowissenschaften zu erweitern. Es ist klar, dass seit ihrer Gründung 1, 12, Aufnahmen von Gehirn wach verhaltenden Tier haben unser Verständnis davon, wie Neurone und Netzwerke von Neuronen kodieren verhaltensrelevanter Ereignisse 3, 4,13,14 fortgeschritten. Insbesondere haben Gehirn-Aufnahmen aus genetisch veränderten Mäusen die Identifizierung von molekularen Kaskaden, die entscheidend in neuronalen Kodierung 15-17 beteiligt sind erlaubt. Wichtig ist, dass die Technik erst in jüngster Zeit zu einer klinisch orientierten Fragen 17, 18 angewendet.
Fortschritte bei der Herstellung von Tetroden und erhöhte Verfügbarkeit der hergestellten Lösungen weiter erleichtern wird die Bewegung dieser technologischeny in Adressierung menschlichen Krankheiten und Beschwerden 19, 20. Und während das Eindringen von Elektroden ins Hirngewebe ist invasiv in der Natur, bieten diese Aufnahmen wertvolle Informationen von einzelnen Neuronen, die nicht mit Technologien wie der funktionellen Bildgebung gewonnen werden können. So wird in beiden Tiermodellen und beim Menschen, wird wach verhalten Aufnahmen mit beweglichen Kleinstantrieben weiterhin unverzichtbare Informationen zu neuronalen Ensembles, Neuronale Kodierung, topographische Spezifität und Netzwerk Oszillationen im Gehirn liefern.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken Daniel Carpi für seine Hilfe und frühen Beiträge zu diesem Projekt. Wir danken auch Lucrecia Novoa für ihre Unterstützung mit Kunstwerken und Bildern. Diese Arbeit wurde vom NIH / NIAID Programm Zuschuss 5P01AI073693-03 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.0005" (12.5 μM) diameter Platinum-Iridium wire | California Fine Wire | CFW#100-167 | HML VG insulated www.calfinewire.com |
| 0.002" (50 μM) diameter Stableohm 675 wire | California Fine Wire | CFW# 100-188 | HML insulated Ni-Cr |
| polyamide tubing | Polymicro Technologies | 1068150020 | 99 micron I.D., 166 micron O.D. www.polymicro.com |
| brass guides | World Plastics Inc | 3.3 x 6.6 mm | |
| Delrin blocks | World Plastics Inc | 3.13 x 2.5 mm | |
| Fillister head brass screws | J.I. Morris Co. | 00-90 x 1/2 | drive screw www.jimorrisco.com |
| hex brass nuts | J.I. Morris Co. | 00-90 | |
| Fillister head brass screws | J.I. Morris Co. | 000-120 x 3/32 | EIB mount and ground screw |
| plexiglass acrylic | Canal Street Plastics | 5 mm thick, clear, www.cpcnyc.com | |
| cyanoacrylate | Krazy Glue | 2 g tube | |
| electronic interface board | Neuralynx | EIB-18 | www.neuralynx.com |
| non-cyanide gold solution | SIFCO | SIFCO 5355 | www.sifcoasc.com |
| VersaDrive 4 | Neuralynx | four tetrode model | |
| tetrode assembly station | Neuralynx | ||
| motorized tetrode spinner | Neuralynx | tetrode spinner 2.0 | |
| VersaDrive jig | Neuralynx | ||
| soldering iron | Radio Shack | 64-2802B | www.radioshack.com |
| nanoZ | Neuralynx | ||
| small bit drill/driver | Ram Products | Rampower 35 | with footpedal controller, www.ramprodinc.com |
| drill bits | Small Parts, Inc. | 3/32" bits, www.smallpartsinc.com | |
| dissecting microscope | Olympus | SZ-60 | www.olympusamerica.com |
| heat gun | Alphawire | Fit gun 3 | use setting "1" only, www.alphawire.com |
| 26 AWG copper wire | Arcor Electronics | F26 | for ground wires, www.arcorelectronics.com |
| soldering flux | Eagle | 2 oz, #205 | |
| 0.02" diameter solder | Kester | 24-6337-0010 | www.kester.com |
| benchtop vise | Vacu-Vise | Model 300 | |
| fiber optic light | Nikon | MKII | dual light arms, www.nikon.com |
| 5-min epoxy | Allied Electronics | 25 ml, www.alliedelec.com | |
| fine tweezers | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-4907, RS-5010 | INOX material, www.roboz.com |
| micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5880 | |
Table 1. Materials and reagents used for constructing tetrodes and microdrives. |
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References
- Recce, M. L., O'Keefe, J. The tetrode: a new technique for multi-unit extracellular recording. Soc. Neurosci. Abstr. 15, 1250 (1989).
- O'Keefe, J., Recce, M. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3, 317-330 (1993).
- Chen, G., Wang, L. P., Tsien, J. Z. Neural population-level memory traces in the mouse hippocampus. PLoS ONE. 4 (12), e8256 (2009).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents -- EEG, ECoG, LFP, and spikes. Nat. Rev. Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Tort, A. B., Kramer, M. A., et al. Dynamic cross-frequency coupling of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Seidenbecher, T., Laxmi, R., et al. Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval. Science. 301 (5634), 846-850 (2003).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Harris, K. D., Henze, D. A., et al. Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements. J. Neurophysiol. 84 (1), 401-414 (2000).
- Henze, D. A., Borhegyi, Z., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84 (1), 390-400 (2000).
- Chang, E. H., Huerta, P. T. Neurophysiological correlates of object recognition in the dorsal subiculum. Front. Behav. Neurosci. 6, 46 (2012).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., et al. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
- O'Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Res. 34 (1), 171-175 (1971).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
- Buzsáki, G. Rhythms of the Brain. , Oxford University Press. Oxford, U.K. (2006).
- McHugh, T. J., Blum, K. I., et al. Impaired hippocampal representation of space in CA1-specific NMDAR1 knockout mice. Cell. 87 (7), 1339-1349 (1996).
- Resnik, E., McFarland, J. M., et al. The effects of GluA1 deletion on the hippocampal population code for position. J. Neurosci. 32 (26), 8952-8968 (2012).
- Cacucci, F., Yi, M., et al. Place cell firing correlates with memory deficits and amyloid plaque burden in Tg2576 Alzheimer mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (22), 7863-7868 (2008).
- Sigurdsson, T., Stark, K. L., et al. Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia. Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).
- Engel, A. K., Moll, C. K., et al. Invasive recordings from the human brain: clinical insights and beyond. Nat. Rev. Neurosci. 6 (1), 35-47 (2005).
- Cash, S. S., Halgren, E., et al. The human K-complex represents an isolated cortical down-state. Science. 324 (5930), 1084-1087 (2009).
