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Bioengineering

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

doi: 10.3791/50474 Published: May 8, 2013

Summary

Biocapteurs de phages lytiques et des perles d'anticorps sont capables de discriminer entre résistant à la méthicilline (SARM) et les bactéries de staphylocoque sensibles. Les phages ont été immobilisés par une méthode de Langmuir-Blodgett sur une surface d'un capteur à microbalance à cristal de quartz et a travaillé comme Large gamme des sondes de staphylocoque. perles d'anticorps reconnaissent SARM.

Abstract

Un bactériophage lytique structurellement transformée ayant un large spectre d'hôte des souches de Staphylococcus aureus et une protéine liant à la pénicilline (PBP 2a) anticorps billes de latex conjuguées ont été utilisées pour créer un biocapteur conçu pour discrimination résistant à la méthicilline (SARM) et sensible (SASM) S . espèces de Staphylococcus 1,2. Les phages lytiques ont été transformés en sphéroïdes phages par le contact avec l'interface eau-chloroforme. Phage monocouches sphéroïde ont été déplacés sur une surface du biocapteur par Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. Les biocapteurs créés ont été examinés par une microbalance à cristal de quartz avec un suivi de dissipation (QCM-D) pour évaluer les interactions bactéries-phages. Interactions bactéries-sphéroïde conduit à la fréquence de résonance réduite et une augmentation de la dissipation d'énergie pour les deux souches de SARM et SASM. Après la liaison bactérienne, ces capteurs ont été plus exposées à l'anticorps protéine liant à la pénicilline perles de latexs. Capteurs analysés par le SARM ont répondu à PBP 2a perles d'anticorps, bien capteurs inspectés avec MSSA donné aucune réponse. Cette distinction expérimentale détermine une discrimination claire entre résistant à la méthicilline et S. sensible souches de Staphylococcus. Également liées et non liées bactériophages supprimer la croissance bactérienne sur les surfaces et dans les suspensions de l'eau. Une fois phages lytiques sont changés en sphéroïdes, ils conservent leur activité lytique forte et montrent une grande capacité de capture bactérienne. Les phages et les phages sphéroïdes peuvent être utilisés pour les essais et la stérilisation des micro-organismes résistant aux antibiotiques. D'autres applications peuvent inclure l'utilisation en thérapie bactériophage et surfaces antimicrobiennes.

Introduction

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Souches résistantes à la méthicilline de Staphylococcus aureus ont été suggérés comme un facteur dans les infections et les épidémies nosocomiales essentielles 4-8. Les moyens ordinaires de la reconnaissance de la résistance à la méticilline, comme la diffusion test de disque d'oxacilline d'agar écran, ou microdilution, s'appuient sur des conditions de culture adaptées pour améliorer l'expression de la résistance. Les modifications comprennent l'utilisation de l'oxacilline, incubation à 30 ou 35 ° C plutôt qu'à 37 ° C, et l'ajout de NaCl dans le milieu de croissance. En outre, pour la détection correcte par ces types de techniques, une longue période d'incubation de 24 heures au lieu de 16 à 18 heures est nécessaire. Techniques rapides avec le niveau approprié (> 96%) de la sensibilité pour l'identification de la résistance à la méticilline comprennent des techniques de microdilution automatisés tels que le Vitek carte GPS-SA, le système Rapid ATB Staph, et le système de panneau Microscan rapide qui produisent des résultats après 3-11 h 9-11. The Crystal MRSA système ID est une méthode rapide basée sur la reconnaissance de la croissance de S. aureus, en présence de 2% de NaCl et 4 mg d'oxacilline par litre avec un détecteur de fluorescence sensible à l'oxygène. Sensibilités réclamés varient entre 91 à 100% après 4 h d'incubation 12-14. Ces méthodes phénotypiques sont limités dans leurs exactitudes par l'impact des souches prévalentes qui expriment la résistance hétérogène. Par conséquent, les méthodes les plus largement acceptée pour la reconnaissance de la résistance à la méticilline est l'hybridation du gène mecA 15 PCR ou de l'ADN. Cependant cette technique nécessite l'ADN purifié et est extrêmement sensible à divers adjuvants (impuretés), qui comprennent 16 débris cellulaires.

En outre, ces techniques ont besoin de temps pour réaliser. Stratégies pour la reconnaissance du produit du gène mecA, la protéine PBP 2a, pourraient être utilisés pour déterminer la résistance et peuvent être plus fiable par rapport aux techniques de test standard 17.

de Staphylococcus aureus, y compris ceux ayant une résistance à la méthicilline 1,2,18. Dans ce travail, nous avons proposé une nouvelle technique dans la détection et l'identification spécifique de SARM, comme la reconnaissance des bactéries avec conformation du SARM en temps réel. A cet effet, un spécifique S. bactériophage aureus avec un large spectre d'hôtes (y compris les souches de SARM) combiné avec un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine (PBP 2a) ont été utilisés. PBP 2a est une protéine de paroi cellulaire et elle est la cause de la résistivité de l'antibiotique SARM. Cependant anticorps 2a PBP n'est pas spécifique à S. aureus depuis quelques autres bactéries ont des protéines de liaison aux antibiotiques avec une similarité de séquence PBP 2a 19,20. Par conséquent, dans ce travail, S. bactériophage aureus et des anticorps contre la protéine PBP 2a ont été utilisées. Pour être en mesure de développer un biocapteur de spécificationquement détecter et identifier SARM un dispositif à deux temps, a été utilisée. La première étape a utilisé un S. aureus bactériophage monocouche en tant que sonde de détection, tandis que la seconde étape utilise PBP 2a anticorps spécifiques. Par conséquent, la première étape comprendra S. la bactérie Staphylococcus, comme l'autre seront sensibles à la protéine antibiotique contraignant. Lorsque les signaux reçus des deux étapes sont positifs, cela indique la détection spécifique de SARM.

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Protocol

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1. Préparer le terrain

  1. Obtenir souche de type S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 et Bacillus subtilis ATCC 6051. Souches résistantes à la méthicilline de S. aureus - MRSA1, le SARM 2, le SARM 5, 13 SARM, le SARM 26, 34 SARM, le SARM 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Le phage lytique 12600.
  2. Obtenir PBP 2a anticorps billes de latex conjuguées.
  3. Préparer NZY moyen comme décrit 21.
  4. Procurez-phosphate solution saline tamponnée (PBS).
  5. Préparez de l'eau déminéralisée comme sous-phase de Langmuir-Blodgett (LB) de dépôt de la monocouche.

2. Propagation de bactériophages et la titration

  1. Incuber 5 ml de culture de nuit de S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 unités formant colonies (UFC) / ml) avec 500 pi de phage (3 x 10 9 </ Sup> UFP / ml) dans 500 moyen de NZY ml à 2 L Flack sur agitateur-incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
  2. Centrifugeuse culture à 4,424 g pendant 10 min à 4 ° C.
  3. Surnageant re-centrifugé à 11.325 g pendant 10 min à 4 ° C.
  4. Surnageant filtrer à travers un filtre Millipore 0,22 um.
  5. Centrifuger le filtrat à 75 395 g pendant 1,5 heures.
  6. Dissoudre le culot dans 100 ul d'eau distillée.
  7. Préparer des dilutions de 10 fois de suspension de phages dans le milieu NZY.
  8. Plaque 1 ml de culture de la nuit (ON) de S. aureus ATCC 12600 sur chacun des 2 plaques avec de l'agar NZY pour s'assurer que toute la surface est couverte. Enlevez l'excédent de la culture et de laisser sécher la surface pendant 30 min.
  9. Détecter un échantillon (10 ul) de la dilution appropriée de phage sur la surface de la plaque et incuber à 37 ° C pendant 18 à 24 h.
  10. Examiner la formation de plaques et de calculer le titre des phages. Les titres bactériophages (T) sont estimés sur la base du nombre de pLaques (N) formé par le volume 10 ul (v) de la suspension de phages et le facteur de dilution (F). Le titre a été calculé par la formule:. T = N / (vxf) Par exemple, pour le nombre de plaques 75 à la dilution 10 -7 et le volume de 10 pi (10 x 10 -3 ml), le titre est égal 75 / (10 x 10 -3 x 10 -7) = 7,5 x 10 10 unités formant des plages (pfu) par ml de suspension.

3. Phage or immobilisé

  1. Morceaux de quartz revêtues d'or propre (60 mm 2) par gravure plasma à l'argon pendant 10 min, puis stériliser pendant 6 heures sous la lumière UV dans une armoire stérile.
  2. Ajouter 50 microlitres de 1 x 10 9 PFU / ml suspension de phages à la surface d'or de chaque pièce dans une boîte de Pétri stérile, puis incuber pendant la nuit dans une chambre humide à température ambiante.
  3. Retirez et titrer la suspension de phages restant.
  4. Lavez morceaux avec phages liés 5 fois avec du PBS pour éliminer non liéephage.

4. Test de Immobilisé infectiosité du phage sur une surface sèche

  1. Étaler une culture de la S. Aureus ATCC 12600 O / N sur une plaque de gélose NZY et laisser sécher.
  2. Placer une pièce d'or avec des phages immobilisés sur la face de la plaque vers le bas.
  3. Respecter une zone de lyse après 12 heures d'incubation à 37 ° C qui indique infectiosité.
  4. Utilisez des morceaux couverts d'or sans phage dans des expériences de contrôle.

5. Test de l'activité lytique du phage libre et liée en liquide

  1. Ajoutez une culture de S. ON aureus ATCC 12600 à 10 ml de NZY dans tous les 300 ml de quatre flacons arme de poing (6 x 10 6 UFC / ml dans chaque flacon).
  2. Ajouter dans deux fioles 2 x 10 6 pfu / ml de phage libre.
  3. Utilisez les deux autres ballons comme témoins.
  4. Surveiller l'évolution temporelle de S. la lyse des cellules de Staphylococcus à 570 min par la mesure de la densité optique (OD 600) à intervalles de 30 min pour toutes les fioles.
  5. Prendre une mesure finale à 24 h.
  6. Répétez les étapes 5.1 à 5.5, mais utiliser des pièces d'or avec des phages liés au lieu de phages libres, et des pièces d'or sans phage dans des flacons de contrôle.

6. Perte de phages liés pendant l'incubation

  1. Ajouter 50 pi de 1 x 10 9 PFU / ml phage sur la surface de pièce d'or stérile dans une boîte de Pétri qui est placé dans une chambre humide pendant la nuit à température ambiante.
  2. Retirez la suspension de phage non lié à la surface d'or et le titre.
  3. Laver la pièce d'or avec phages liés 5 fois avec du PBS et les placer dans une solution à 1 NZY ml dans 15 ml tube dans un shaker-incubateur à 37 ° C pendant 8 heures.
  4. Déterminer le titre du phage détaché comme décrit dans 2.

7. Phage Spheroids Préparation

  1. La combinaison de 400 pi de stock phage 12600 suspension (10 11 PFU / ml) avec un volume égal de chloroforme qualité spectrophotométrique dans 1 ml flaconà la température ambiante.
  2. Doucement vortex la suspension de phages chloroforme 5-6 fois (intervalles de 5 secondes) sur une durée minute.
  3. Laisse la suspension se stabiliser pendant 30 secondes et ensuite la pipette de la phase supérieure contenant sphéroïdes a été prélevée à la pipette pour la préparation de la monocouche.
  4. Prendre quelques microlitres de la suspension des sphéroïdes pour la transmission et la microscopie électronique à balayage.
  5. Utilisez une suspension sphéroïde restant pour la fabrication de biocapteurs.

8. Préparation biocapteur

  1. Nettoyer les capteurs QCM-D par gravure plasma à l'argon pendant 10 min PDC-32G Harrick propre plasma.
  2. Rincer capteur avec de l'hexane pour éliminer les impuretés organiques.
  3. Préparer et nettoyer une goulotte de l'équilibre du film tel que décrit dans 22.
  4. Remplissez creux LB avec une solution sous-phase et nettoyez-le avec une barrière de creux et de stabiliser le bac à 20 ± 0,1 ° C
  5. Étaler 300 aliquote de phage 12600 en suspensi aqueusele (10 11 PFU / ml) sur subphase LB.
  6. Préparer monocouche de phage sur une solution de sous-phase de LB en permettant à 300 aliquote de phage suspension aqueuse 12600 (10 11 PFU / ml) de descendre une tige de verre mouillable inclinée qui est partiellement immergé dans la sous-phase 22,23.
  7. Stabiliser la monocouche préparé pendant 10 min, et ensuite le comprimer à une vitesse de 30 mm / min (45 cm 2 / min), jusqu'à ce qu'une pression constante de 19 N / m est atteinte.
  8. Effectuer un dépôt de film sur la verticale positionnée perpendiculairement capteur QCM-D à une vitesse de 4,5 mm / min en trempant successivement capteur dans et hors de la monocouche sept fois. La microscopie électronique de dépôt de monocouches de phages avant l'exposition à des échantillons bactériens ont montré que les couches étaient continu, homogène et uniforme (données non présentées).
  9. Répétez les étapes 4,5-4,8 avec une suspension sphéroïde phage qui est préparé en 3.
  10. Utilisez biocapteurs de phages fabriqués pour la détection de SARM, d'électronsmicroscopie et ellipsométrie.

9. Test biocapteur, la discrimination de résistant à la méthicilline et bactéries Staphylococcus sensibles

  1. Dans ce protocole, les biocapteurs avec phage non modifié et modifié et sphéroïdes de phages sont préparés. Une microbalance à cristal de quartz avec les quatre chambres d'écoulement de capteur est utilisé pour surveiller la liaison de bactéries au phage immobilisé sur la surface du capteur QCM. PBP 2a anticorps billes de latex conjugués sont utilisés pour discriminer entre résistant à la méthicilline (SARM) et les bactéries de staphylocoque sensibles. Toutes les mesures sont effectuées en mode de débit (50 l / min) à 5 MHz.
  2. Établir une fréquence de résonance de ligne de base du capteur QCM dans l'eau (~ 30 min).
  3. Dessiner une suspension de cellules vivantes sensibles à la méthicilline staphylococcus bactériens dans l'eau (10 9 UFC / ml) à travers la cellule d'essai.
  4. Continue de surveiller les changements dans la fréquence de résonance des capteurs et de la dissipation de l'énergie pour la première harmonique, using le logiciel Q-Soft.
  5. Lorsque les changements dans la fréquence de résonance des capteurs et de la dissipation atteint des niveaux de saturation, ajouter la suspension de PBP anticorps billes de latex conjuguées (6,77 x10 10 billes / ml) à la circulation au cours de la surveillance continue de la fréquence et de la dissipation.
  6. Répétez les étapes 9.2-9.5 pour résistant à la méthicilline cellules bactériennes méthicilline (SARM).
  7. Définir un changement de fréquence à travers la variation de la masse dues à des bactéries de liaison par l'équation Sauerbrey 24,25 Af = xn-Δm / C,C est la sensibilité masse constante (C = 17,7 ng x cm -2 x -1 Hz à 5 MHz ), m est la masse, et n est le nombre d'harmonique (n = 1).
  8. Définir un changement de dissipation d'énergie (Δ D) à partir de l'enregistrement de la décroissance exponentielle de l'oscillation (la fréquence et de l'amplitude d'amortissement, ce qui a permis la quantification de l'énergie dissipée et stockée pendant une période d'oscillation,E dissipée et E stocké, respectivement: Δ D = E dissipée / 2 πE stocké. Δ D est mesuré en unités de dissipation (UA), l'un = 10 -6 unités relatives UA).

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Representative Results

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Le phage a démontré une activité lytique contre toutes les souches testées de S. aureus, y compris les souches de SARM, comme indiqué par le test de la goutte de phage. tailles de plaque variaient généralement de 5 à 15 mm. Aucune activité n'a été trouvée contre les autres-cultures d'essai (tableau 1).

Une croissance normale de S. aureus ATCC 12600 dans un milieu NZY sur agitateur-incubateur à 37 ° C est représenté en figure 1A (une courbe marquée par des cercles vides). Le nombre de bactéries a augmenté de 3,2 x 10 6 à 4,0 x 10 8 UFC / ml Figure 1A (une courbe marquée par des cercles pleins). Montre les résultats de la co-culture de 2,0 x 10 6 PFU / ml phage libre ajoutés simultanément avec le même concentration de S. aureus ATCC 12600. Phage, immobilisé sur la surface d'or, a démontré l'activité lytique comparable à l'activité du phage en suspension (figure 1A, la courbe marquée par de grands triangles vers le bas). Phages immobilisés est resté infectieux quand la pièce d'or avec des phages a été utilisé dans les expériences de 24 h de croissance, puis il a été lavé 5 fois et stocké dans du PBS pendant 6 jours à 4 ° C, et enfin réutilisé avec une suspension bactérienne fraîche. (Figure 1A, courbe marquée par de grands triangles en haut). Il semble que les phages immobilisés injectent leur ADN dans la bactérie, laissant capsides vides, qui sont incapables d'infecter de nouvelles bactéries. Nous émettons l'hypothèse que les phages immobilisés sur une surface d'or ont servi de "catalyseurs" primaires pour infecter un peu de bactéries, qui génèrent des phages libres ceux qui, à leur tour infecter de nouvelles bactéries et ainsi de suite. Par conséquent, la plupart des phages immobilisés n'ont probablement pas été utilisé dans un premier 24 heures expérience croissante et, par conséquent, peuvent être utilisés une seconde fois. La densité de surface des phages déposés par adsorption physique était d'environ ~ 0,7 particule de phage / um 2. Cette concentration est élevée, mais elle peut atteindre jusqu'à 10 fois 2. Par conséquent, la plaque d'or pourrait incorporer sertains des phages viables libres libérés par les bactéries infectées dans le premier 24 heures expérience croissante.

Figure 1B montre la zone lyse autour de la pièce d'or, ce qui indique que les phages immobilisés étaient capables de lyse des cellules bactériennes. Dans les expériences de contrôle, la plaque d'or vide n'a pas inhibé la croissance bactérienne. D'où la diminution effective de la croissance bactérienne trouvée à la co-culture de bactéries et phages immobilisé est un résultat de l'interaction primaire de bactéries en suspension de l'eau et le phage lié comme le montre la figure 1C. Le détachement phage à partir de la surface d'or lors de la co-incubation des phages liés et les bactéries était petit. Afin d'estimer combien de phages ont été détachées de la surface d'or lors de l'incubation, les échantillons avec des phages liés ont été immergés dans une solution NZY, secoué dans le shaker-incubateur à 37 ° C pendant 8 heures, et une concentration de phage libre dans le surnageant a été évaluée. Nous avons déterminé que 4,1 x 10 7 pfu étaient bound à un mm 2 pièces 60 d'or (~ 0,7 particule de phage / um 2), alors que seulement 3 x 10 4 PFU a été détaché (0,007% détachement).

La transmission et la microscopie électronique à balayage de phages lytiques intact 12600 sur la surface du substrat d'or est montré dans les Figures 2A et 2B. Lorsque la suspension de phages a été soumis au chloroforme traitement, l'apparence physique phage a été changé. La queue contracté en longueur et épaissi. La tête polygonale est devenu arrondi (figures 2D et 2E). Nous avons appelé le phage lytique structurellement modifié "sphéroïde" similaire au nom du chloroforme traité phage filamenteux 26. En dépit des changements structurels importants résulté de traitement au chloroforme, l'activité lytique sphéroïde mesurée par le nombre de plaque n'a pas changé (figures 2C et 2F). L'activité lytique moyenne de phage et sphéroïdes étaient (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (N = 4) et (7,5 ± 1.0 (SD)) x 10 10 (n = 7), PFU / ml. Au niveau de 0,05, les activités de phage et sphéroïdes n'étaient pas significativement différentes (figure 2C et 2F).

Les capteurs QCM avec phages lytiques immobilisés montré aucun changement significatif dans la fréquence de résonance ou de dissipation d'énergie quand ils ont été exposés au SARM (figure 3A). Ces données indiquent que l'interaction MRSA / phage a abouti à un non changement de masse selon le QCM, et pourtant les micrographies électroniques de poste biocapteurs analysés ont révélé significative la liaison des bactéries à la surface du capteur (figure 3B).

Lorsque des suspensions SARM ont été injectés dans la cellule d'écoulement avec le phage biocapteurs sphéroïde, une diminution importante de la fréquence (Δ f ≈ -105 Hz) et une augmentation de la dissipation (Dd ≈ 26 DU) ont été observées (figure 3C). Après phages sphéroïde-bactériennes interactions de liaison (SARM), doser soinsors ont été exposés à PBP2a anticorps conjugué latex perles suspensions. Ces SARM dosé biocapteurs ont répondu aux PBP2a anticorps conjugué latex perles suspensions, depuis une nouvelle diminution de la fréquence (Δ f ≈ -45 Hz) et une augmentation de la dissipation (Dd ≈ 15 DU) ont été observées (figure 3C). La liaison de SARM au phage sondes et PBP2a anticorps billes de latex conjuguées a été confirmée par balayage investigations en microscopie électronique (figure 3D).

Lorsque le sphéroïde biocapteur de phage a été exposé à des suspensions SASM, une diminution importante de la fréquence (Δ f ≈ -200 Hz) et une augmentation de la dissipation (Dd ≈ 55 DU) ont été observées (figure 3F). Après phages interactions de liaison sphéroïde-SASM, capteurs testés ont été contestées avec PBP2a anticorps conjugué latex perles suspensions. Initialement, le SASM dosé biocapteur a montré transitoires courtesaugmentation de la fréquence et de diminuer la dissipation. Après quelques minutes de MSSA et PBP2a anticorps conjugués interactions perles de latex, la fréquence est retourné à poster niveaux d'introduction d'anticorps PBP2a, mais l'énergie dissipative a augmenté (figure 3F). La liaison de MSSA aux sondes de phages a été confirmé par microscopie électronique à balayage, mais aucune liaison entre MSSA et PBP2a anticorps billes de latex conjuguées a été observée (figure 3F). Profil d'épaisseur ellipsométrique, carte d'épaisseur 3D de phages lytiques et des bactéries de staphylocoque sont présentés dans les figures complémentaires S1 et S2.

Après le contact des capteurs avec LB phages ou sphéroïdes immobilisés à la suspension de 10 9 cellules / ml de MRSA ou MSSA, ont été observés aux bactéries de se lier phages ou sphéroïdes à la densité (ρ) de 9,1 x 10 7 (MRSA / phages intacts), 7,9 x 10 7 (MRSA / sphéroïdes), et de 7,2 x 10 7 (MSSA / sphéroïdes) cellules / cm 2. Enles tests à l'aide de 5 phages lytiques différents et deux bactéries hôtes 27, les chercheurs ont soumis des phages immobilisés par un procédé de liaison covalente à 10 9 cellules / bactéries ml, et déterminer l'efficacité de capture de phage dans une plage de (2.5 à 8.9) x 10 5 cellules / cm 2 . L'efficacité de capture de phage présentée dans ce travail est environ 100 fois plus élevé.

Host Egouttez détails de contrainte Sensibilité à la méticilline sensibilité de Phage
S. aureus 12600 ATCC S +
S. aureus 27690 ATCC S +
S. aureus 10292 IA S +
10378 IA S +
S. aureus 10497 IA S +
S. aureus 10686 IA S +
S. aureus MRSA 1 UA R +
S. aureus MRSA 2 UA R +
S. aureus MRSA 5 UA R +
S. aureus MRSA 13 UA R +
S. aureus MRSA 26 UA R +
S. aureus MRSA 34 UA R +
S. aureus MRSA 45 UA R +
B. anthracis Sterne UA NA -
Salmonella typhimurium LT2 UA NA -
Shigella flexneri inconnue UA NA -
Yersinia enterocolitica inconnue UA NA -
Proteus mirabilis inconnue UA NA -
Klebsiella pneumoniae 13882 UA NA -
Bacillus subtilis 6051 ATCC NA -

Tableau 1. Phage 12600 sensibilité de s bactériennetrains IA - isolés à partir d'animaux;. UA - collection bactérienne de la culture de l'Université d'Auburn, NA - Non applicable, une - activité lytique du phage a été définie par la formation de plaques, +, sensible, - et non sensibles. Cultures d'une nuit de souches testées ont été étalées sur des plaques avec agar NZY. Après avoir séché la surface, un échantillon (10 pi) de 10 11 PFU suspension phage a été repéré à la surface de la plaque. Les plaques ont été incubées à 37 ° C pendant 18-24 h. Activité lytique des phages a été détectée par la formation de plaques.

Figure 1
Figure 1. propriétés infectieuses du phage liée et libre. A. croissance bactérienne en absence (cercles vides) et en présence (cercles pleins) de phage libre, en présence de phages liés à la surface de l'or (en sus de triangles), et en présence du phage lié à la surface d'or au bout de 6 heures à 4 ° C (top down triangles). Insérer: La ligne (1) montre un ajustement linéaire des phages pas la croissance des données expérimentales à l'équation (4) (R = -0.99, p <0,0001). La ligne (2) montre un ajustement des données expérimentales de la croissance bactérienne à la présence de phages libres de la même équation. Constant de la croissance bactérienne (k) en l'absence et la présence de phage libre, sont égaux 0,88 et 0,64 (-0.048, phase de déclin). Les données représentatives de trois expériences indépendantes sont montrées dans la partie A. Une moyenne erreur DO 600 mesures relatives ne dépassent pas 5%. B. Phage immobilisé à la surface de l'or est infectieux comme indiqué par la zone de lyse autour de la pièce d'or. 1 - le fragment de la plaque de gélose avec des bactéries, 2 - la pièce d'or avec des phages immobilisés;. 3 - la zone d'inhibition autour de la pièce d'or C. Représentation schématique de bactérie lyse par phage fixé à la surface d'or. 1 -pièce d'or revêtu de quartz, 2 - phage lié à la surface d'or, 3 - bactérie ancré par phages liés, 4 - phages libres ont sorti en éclatant bactérie infectée. Utilisé avec la permission de: Guntupalli, R., et al 2012.. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. Propriétés de phage intact et modifié A et B - de la transmission et microscopie électronique à balayage de phage intact, respectivement;.. C - phage activité lytique sur une plaque de gélose avec MRSA D et E - Transmission et microscopie électronique à balayage de sphéroïdes de phages intacts, respectivement; sphéroïdes de phage lytique a - Fctivité sur une plaque de gélose par le SARM. L'activité moyenne du phage et sphéroïdes sont (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (N = 4) et (7,5 ± 1,0 (SD)) x 10 10 (N = 7) PFU / ml. T-test: t = 0,15682, p = 0,87851. Au niveau de 0,05, les activités de phage et sphéroïdes sont pas significativement différentes. Bars: A, B, D et E: 200 nm. Utilisé avec la permission de:. Guntupalli, R., et al 2012.

Figure 3


Figure 3. Combiné QCM-D et à l'analyse des interactions EM phages des bactéries. Bactéries ont été livrés à la sonde à une concentration de 10 9 UFC / ml des suspensions dans l'eau à un débit de 50 l / min. 1, 2 représentent des changements dans la fréquence de résonance et de la dissipation d'énergie, respectivement. A. Phage revêtu réponse du capteur QCM-D à SARM. La flèche indique til délai de livraison SARM à la surface du capteur. B. Micrographie électronique de poste dosé SARM lié à phage lytique immobilisé sur le capteur QCM. M-MRSA, P-phages sur la surface du capteur. C. réponses successives des sphéroïdes de phages de capteur QCM-D revêtu de SARM d'abord, puis à PBP perles d'anticorps. Les flèches indiquent le SARM et PBP délai de livraison d'anticorps à la surface du capteur, respectivement. D. Micrographie électronique de poste dosé biocapteur avec sphéroïdes de phages, le SARM, et des perles d'anticorps PBP. Flèches épaisses et minces montre cellule typique SARM et d'anticorps perle, respectivement. E. réponses successives des sphéroïdes de phages capteur QCM-D enduit pour S. première aureus puis à PBP perles d'anticorps. Les flèches indiquent S. aureus et PBP délai de livraison d'anticorps à la surface du capteur, respectivement F. Micrographie électronique de poste. dosé biocapteur avec sphéroïdes de phages, S. aureus, et PBP perles d'anticorps. Flèches épaisses et minces montre typique S. Cellule aureus et anticorps perle, respectivement. Utilisé avec la permission de: Guntupalli, R., et al 2012.. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Les chiffres supplémentaires

Figure S1
Figure S1. Figure supplémentaire 1. (a) et (b) sont un profil d'épaisseur ellipsométrique et la carte d'épaisseur 3D d'un phage lytique, respectivement (indice de réfraction effectif = 1,05). profils d'épaisseur montrent rugosité RMS, minimum et maximum épaisseur moyenne, de la monocouche. Une ligne à travers la carte de l'épaisseur a été élaboré pour générer le profil d'épaisseur.

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Figure S2. Figure supplémentaire 2.

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Discussion

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Il est bien connu que les phages peuvent être utilisés comme sondes de biocapteurs pour les bactéries pathogènes 28. Il est démontré dans ce travail que phage avec des anticorps 2a PBP peut être utilisé pour résoudre le vieux problème: les souches résistantes et sensibles aux antibiotiques discrimination rapides.

Il a été constaté cependant ces phages de staphylocoques non modifiés normales ne sont pas adaptés pour la détection des bactéries avec des dispositifs QCM, même si elles se fixent les bactéries. La queue de phage est si longue que les ondes acoustiques ne peuvent pas "atteindre" des bactéries liés à l'extrémité de la queue de bactériophages. Cette condition a donné lieu à un effet «matière» 29 et l'impossibilité d'enregistrer la fréquence de résonance et le changement de dissipation en dépit de la liaison significative a montré par EM images (figures 3A et 3B). Ce problème a été facilement résolu en remplaçant le phage intact avec sphéroïdes, le phage modifié par traitement au chloroforme-eau. Ce traitement a entraîné p pleinement fonctionnelHage à court, épais et non-flexible queue (figures 2D, 2E et 2F). Quand phages ont été remplacés par des sphéroïdes dans des biocapteurs, le SARM a été facilement détectée par le dispositif QCM-D.

Lorsque les particules de phages ont été liés à des surfaces d'or à une orientation correcte, leurs récepteurs étaient accessibles à la bactérie hôte. Si le contact physique direct entre une surface solide avec des phages et une couche bactérienne séchée se produit, les phages immobilisés sont capables d'injecter génome viral dans des bactéries hôtes (figure 1C). Ces résultats sont en bon accord avec ceux obtenus avec les phages lytiques immobilisées à des surfaces de disque de verre par une technique de liaison covalente 27. La capacité des phages lytiques liées à capturer des bactéries hôtes ont également été démontré en utilisant une technique d'immobilisation des phages biotinylé 30. En revanche, une méthode d'adsorption physique très simple pour fixer les phages orientées correctement sur ​​des surfaces solides a été utilisé 31. Til l'efficacité de capture de sphéroïde haute phage peut être utilisé pour la fabrication de surfaces antimicrobiennes efficaces. Un temps à répondre total pour le test proposé est d'environ 16 min par échantillon. Cette durée peut être considérablement raccourci en utilisant des dispositifs QCM avec un grand nombre de chambres. La durée de vie prévue pour les capteurs de phages est environ de 3-4 mois à température ambiante. Avec une protection de biopolymère il pourrait être prolonger jusqu'à quelques années 32. La limite de détection de S. aureus a été mesurée pour ce phage par une spectroscopie par résonance plasmonique de surface, et trouvé 10 4 CFU / ml 18.

L'une des conditions les plus importantes pour l'utilisation de méthodes décrites dans cet article est de se conformer aux conditions propres et stériles 33 exigences pour toutes les expériences avec les phages et les bactéries.

Méthodes couramment utilisées pour la détection du SARM, tels que le test de dépistage sur gélose oxacillin de diffusion de disques, ou microdilution prennent normally jusqu'à 24 h pour effectuer l'essai. Techniques rapides qui incluent des techniques automatisées telles que la Vitek carte GPS-SA, le système Rapid ATB Staph, le système de panneau Microscan rapide, et le système ID cristal SARM produisent également des résultats après 3-11 heures 9-14. Hybridation du gène mecA 15 PCR ou de l'ADN est une méthode relativement rapide et précise mais nécessite ADN purifié et impuretés extrêmement sensibles. En revanche, la méthode décrite dans ce travail est rapide, ne nécessite pas l'extraction d'ADN, et il n'est pas sensible aux adjuvants.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Les travaux rapportés ici ont été pris en charge par des subventions de l'Université d'Auburn AUDFS et USAF CRADA 07-277-60MDG-01. Les opinions exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas la politique ou la position officielle de l'Armée de l'Air des États-Unis, ministère de la Défense ou le gouvernement américain.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

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References

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Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants
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Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).More

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).

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