Summary
Lytisk phage biosensorer og antistoffkuler er i stand til å diskriminere mellom meticillinresistent (MRSA) og sensitive Staphylococcus bakterier. De phages ble immobilisert ved en Langmuir-Blodgett metoden på en overflate av en kvartskrystall mikrovekt sensor og jobbet så bredt spekter Staphylococcus sonder. Antistoffkuler gjenkjenne MRSA.
Abstract
Et strukturelt transformert lytisk bakteriofag ha en bredde i vertsområde av Staphylococcus aureus-stammer og en penicillin-bindende protein (PBP 2a) antistoff konjugert latekskuler har blitt benyttet for å lage en biosensor beregnet for diskriminering av meticillinresistent (MRSA) og følsom (MSSA) S . aureus arter 1,2. Lytisk phages har blitt konvertert til fag-sfæroider ved kontakt med vann-kloroform grensesnitt. Phage sfæroide monolayers har blitt flyttet på en biosensor overflate ved Langmuir-Blodgett (LB) teknikk tre. Den opprettede biosensorer har blitt undersøkt av en kvartskrystall mikrovekt med utskeielser sporing (QCM-D) for å evaluere bakterier-fag-interaksjoner. Bakterier-sfæroide interaksjoner ført til redusert resonans frekvens og en økning i spredning energi for både MRSA og MSSA stammer. Etter bakteriell binding, har disse sensorene er videre utsatt for penicillin-bindende protein antistoff lateks vulstens. Sensorer som analyseres med MRSA svart på PBP 2a antistoffkuler, selv om sensorer inspisert med MSSA ga ingen respons. Denne eksperimentelle skillet bestemmer en entydig skille mellom meticillin resistente og sensitive S. aureus stammer. Like bundet og ubundet bakteriofager undertrykke bakterievekst på overflater og i vann suspensjoner. Når lytisk phages blir alle forvandlet til sfæroider, beholder de sin sterke lytisk aktivitet og viser høy bakteriell fangst evne. Fagen og phage sfæroider kan benyttes for testing og sterilisering av antibiotikaresistente mikroorganismer. Andre anvendelser kan omfatte bruk i bakteriofag terapi og antimikrobielle overflater.
Introduction
Meticillin resistente stammer av Staphylococcus aureus har blitt foreslått som en faktor i essensielle infeksjoner og nosokomiale utbrudd 4-8. Vanligste måtene anerkjennelse av meticillin resistens, for eksempel disk diffusjon Oxacillin agar skjermen test, eller kjøttkraft microdilution, er avhengige av skreddersydde kultur vilkår for å forbedre uttrykk for motstand. Endringer omfatter utnyttelse av oksacillin, inkubering ved 30 eller 35 ° C i stedet for 37 ° C, og inkluderingen av NaCl til vekstmediet. Videre, for korrekt deteksjon ved disse typer teknikker, en lang inkubasjonstid på 24 timer i stedet for 16-18 timers er nødvendig. Raske teknikker med passende (> 96%) følsomhet for identifisering av meticillin resistens inkluderer automatiserte microdilution teknikker som Vitek GPS-SA-kort, Rapid ATB Staph system, og Rapid Microscan Panel system som produserer resultater etter 3-11 timer 9-11. The Crystal MRSA-ID-systemet er en hurtig metode basert på erkjennelsen av veksten av S. aureus i nærvær av 2% NaCl og 4 mg av oksacillin per liter med en oksygen-sensitive fluorescenssensorutstyret. Hevdet følsomhet varierer mellom 91 til 100% etter 4 timer med inkubasjon 12-14. Disse fenotypiske metoder er begrenset i sine nøyaktigheter ved virkningen av utbredte stammer som uttrykker heterogen motstand. Derfor er de beste mest aksepterte metoder for anerkjennelse av meticillin resistens PCR eller DNA hybridisering av mecA genet 15. Men denne teknikken krever rensede DNA og er ekstremt følsomme for forskjellige tilsetninger (urenheter), som inkluderer celleavfall 16..
Videre er disse teknikkene trenger lang tid å utføre. Strategier til anerkjennelse av mecA genproduktet, protein PBP 2a, kunne brukes til å bestemme motstand og kan være mer pålitelig i forhold til standard test teknikker 17.
Staphylococcus aureus-stammer innbefatter de som har meticillin 1,2,18. I dette arbeidet foreslo vi en ny teknikk i den spesifikke gjenkjenning og påvisning av MRSA, slik som gjenkjennelse av bakteriene sammen med konformasjon av MRSA i sanntid. For dette formålet en S. aureus bakteriofag med et bredt spektrum av verter (inkludert MRSA stammer) i kombinasjon med monoklonalt antistoff mot protein (PBP 2a) har blitt benyttet. PBP 2a er et cellevegg protein og det er årsaken til antibiotikum resistivitet av MRSA. Men PBP 2a antistoff er ikke spesifikke for S. aureus siden noen andre bakterier har antibiotiske proteiner med sekvenslikhet til PBP 2a 19,20. Følgelig i dette arbeidet, S. aureus bakteriofag og antistoffer mot PBP 2a proteinet har blitt brukt. For å være i stand til å utvikle en biosensor for å spesifitisk oppdage og identifisere MRSA en enhet med en to-trinns handling har blitt utnyttet. Den første trinnet brukte en S. aureus bakteriofag monolaget som en sensor probe, mens det andre trinnet anvendes PBP 2a spesifikke antistoffer. Derfor går man vil gjenkjenne S. aureus bakterier, vil som den andre være følsomme for antibiotika-bindende protein. Når signaler mottatt fra to trinnene er positiv, betyr det at spesifikk påvisning av MRSA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Innstilling av Stage
- Skaff typestammen S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 og Bacillus subtilis ATCC 6051. Meticillin-resistente stammer av S. aureus - MRSA1, to MRSA, 5 MRSA, 13 MRSA, 26 MRSA, 34 MRSA, 45 MRSA, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882, The lytisk fag 12600.
- Skaff PBP 2a antistoff konjugert latekskuler.
- Forbered NZY medium som beskrevet 21.
- Innhent fosfatbufret saltoppløsning (PBS).
- Forbered ionisert vann ettersom subphase for Langmuir-Blodgett (LB) monolag deponering.
2. Bakteriofag forplantning og Titrering
- Inkuber 5 ml over natten kultur av S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 koloni-dannende enheter (CFU) / ml) med 500 pl av fagen (3 x 10 9 </ Sup> PFU / ml) i 500 ml NZY medium i 2 L flack på shaker-inkubator ved 37 ° C over natten.
- Sentrifuger kultur ved 4424 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Re-sentrifugerte supernatant ved 11.325 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Filter supernatanten gjennom et 0,22 um Millipore-filteret.
- Sentrifuger filtratet på 75 395 xg for 1,5 hr.
- Oppløs pelleten i 100 pl destillert vann.
- Forbered 10-fold fortynninger av fag-suspensjon i NZY medium.
- Plate 1 ml av natten (ON) kultur S. aureus ATCC 12600 på hver av to plater med NZY agar for å sørge for at alle overflaten er dekket. Fjern overflødig av kultur og la overflaten tørke i 30 min.
- Øye på en prøve (10 ul) av passende phage fortynning på overflaten av platen og inkuber ved 37 ° C i 18-24 timer.
- Undersøke dannelse av plakk og beregne fag titer. Bakteriofag-titere (t) er beregnet på grunnlag av det antall pLaques (N) som er dannet av 10, ul volum (V) av phage suspensjon og fortynningsfaktoren (F). Titeren ble beregnet ved formelen:. T = I / (vxF) For eksempel, for det antall plakk 75 ved fortynning 10 -7 og volumet 10 ul (10 x 10 -3 ml), er det titer lik 75 / (10 x 10 -3 x 10 -7) = 7,5 x 10 10 plakk forming units (PFU) per ml suspensjon.
3. Gold-immobilisert Phage
- Rene gull-belagte kvarts-stykker (60 mm 2) av plasma etsing i argon i 10 min og deretter sterilisere etter 6 timer under UV-lys i et sterilt kabinett.
- Legg 50 mikroliter av en 10 x 9 PFU / ml phage suspensjonen til gull overflate av hver bit i en steril petriskål, og deretter inkuberes over natten i et fuktig kammer ved romtemperatur.
- Fjern og titer de resterende fag suspensjon.
- Vask stykker med bundet fag fem ganger med PBS for å fjerne ubundetfag.
4. Testing av Immobilized Phage Smittsomhet på tørr overflate
- Spre en O / N kultur S. Aureus ATCC 12600 på en NZY agar plate og la tørke.
- Plasser en gullmynt med immobilisert fag på tallerkenen med ansiktet ned.
- Observer en sone av lysis etter 12 timers inkubering ved 37 ° C som indikerer infektiviteten.
- Bruk gull dekket stykker uten fag i kontroll eksperimenter.
5. Testing av Lytisk aktivitet av fri og bundet Phage i flytende
- Legg en ON kultur S. aureus ATCC 12600 til 10 ml NZY i hver av fire 300 ml kolber sidearm (6 x 10 6 CFU / ml i hver kolbe).
- Legg I to kolber 2 x 10 6 PFU / ml gratis fag.
- Bruk de to andre kolber som kontroller.
- Overvåke tiden løpet av S. aureus cellelysis for 570 min med optisk tetthet måling (OD 600) med 30 minutters intervaller for alle flasker.
- Ta en siste måling på 24 hr.
- Gjenta trinn 05.01 til 05.05, men bruker gull stykker med bundet phages stedet for gratis phages og gull stykker uten fag i kontroll-kolber.
6. Tap av Bound phages under inkubasjon
- Tilsett 50 pl av en 10 x 9 PFU / ml fagen på overflaten av sterile gull stykket i en petriskål som er plassert i et fuktig kammer over natten ved romtemperatur.
- Fjern suspensjon med ubundet fag fra gullet overflaten og titer.
- Vask gull stykke med bundet fage 5 ganger med PBS og plasseres i 1 ml NZY oppløsning i 15 ml rør i shaker-inkubator ved 37 ° C i 8 timer.
- Bestem titer av den frittliggende fagen som beskrevet i 2..
7. Phage Spheroids Forberedelse
- Ved å kombinere 400 mL av lager phage 12600 suspensjon (10 11 PFU / ml) med et like stort volum kloroform spektrofotometriske karakter i 1 ml ampulleved romtemperatur.
- Forsiktig vortex fag-kloroform suspensjon 5-6 ganger (5 sek mellomrom) over ett minutt varighet.
- Tillates suspensjonen å stabilisere seg i 30 sek og deretter pipettere av den øverste fase sfæroider ble pipettert av for monolag preparatet.
- Ta noen få mikroliter av sfæroidene suspensjon av utsendelsen og scanning elektronmikroskopi.
- Bruk en gjenværende spheroid suspensjon for biosensor produksjon.
8. Biosensor Forberedelse
- Rene QCM-D sensorer med plasma etsning i argon i 10 min PDC-32G Harrick plasma renere.
- Skyll sensor med heksan for å fjerne eventuelle organiske urenheter.
- Utarbeide og rengjøre et trau av filmen balanse som beskrevet i 22..
- Fyll LB trau med en subphase løsning og rengjør den med et trau barriere og stabilisere bunnen ved 20 ± 0,1 ° C
- Spre 300 pl prøve av fag 12600 i vandig suspension (10 11 PFU / ml) på LB subphase.
- Forbered phage monosjikt på LB subphase løsningen ved at 300 pl alikvot av phage 12600 vandig suspensjon (10 11 PFU / ml) for å kjøre ned en skråstilt fuktbar glasstang som er delvis nedsenket i den subphase 22,23.
- Stabiliser fremstilte monolag i 10 min, og deretter komprimere den med en hastighet på 30 mm / min (45 cm 2 / min) fram til et konstant trykk 19 N / m oppnås.
- Utfør en vertikal film deponering på perpendikulært plassert QCM-D-sensor med en hastighet på 4,5 mm / min, ved gradvis å dyppe sensoren i og ut av monolaget syv ganger. Elektronmikroskopi av deponert phage monolag før eksponering for bakterielle prøver viste at lagene var sammenhengende, homogen og ensartet (data ikke vist).
- Gjenta trinn 04.05 til 04.08 med et fag spheroid suspensjon som er utarbeidet i tre.
- Bruk fabrikkert fag-biosensorer for MRSA-påvisning, elektronmikroskopi, og ellipsometry.
9. Biosensor Testing, Diskriminering av Meticillinresistente og Sensitive Staphylococcus bakterier
- I denne protokollen, er biosensorer med umodifisert og modifisert fag og fag-sfæroider forberedt. En kvartskrystall mikrovekt med fire sensor gjennomstrøm-ningskammere blir brukt til å overvåke binding av bakterier til fagen immobilisert på QCM sensorflaten. PBP 2a antistoff konjugert latekskuler anvendes for å diskriminere mellom meticillinresistent (MRSA) og sensitive Staphylococcus bakterier. Alle målinger utføres i flyten-modus (50 mL / min) ved 5 MHz.
- Etablere en basislinje resonansfrekvensen til sensoren QCM i vann (~ 30 min).
- Tegn en suspensjon av levende methicillin sensitiv Staphylococcus bakterieceller i vann (10 ni CFU / ml) inn i testcellen.
- Kontinuerlig overvåke endringer i sensorer resonans frekvens og energi ødsling for første overtone, USIng Q-Soft programvare.
- Når endringene i sensorene resonansfrekvens og dissipasjon nådd metningsnivåer, tilsett suspensjon av PBP antistoff konjugert latekskuler (6,77 x10 10 kuler / ml) til strømmen i løpet av kontinuerlig overvåking av frekvens-og utladning.
- Gjenta trinn 9.2 til 9.5 for meticillinresistente Staphylococcus bakterieceller (MRSA).
- Definer en frekvens endring gjennom massen endringen skyldes bakterier bindende ved Sauerbrey ligningen 24,25 Af =-Δm xn / C, der C er masse følsomhet konstant (C = 17,7 ng x cm -2 x Hz -1 på 5 MHz ), m er massen og n er overtone antall (n = 1).
- Definer en energi dissipasjon endring (Δ D) fra opptaket den eksponensiell desintegrasjon av oscillasjon (frekvens og amplitude demper, som tillot kvantifisering av den energi som spres og lagret i løpet av en periode av oscillasjonen,E utsvevende og E lagret, henholdsvis: Δ D = E utsvevende / 2 πE lagret. Δ D måles i ødsling enheter (DU), en DU = 10 -6 relative enheter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den fag demonstrert lytisk aktivitet mot alle testede stammer av S. aureus, inkludert MRSA-stammer, som indikert av fag stikkprøve. Plakk størrelser generelt varierte fra 5 til 15 mm. Ingen aktivitet ble funnet mot andre test-kulturer (tabell 1).
En normal vekst av S. aureus ATCC 12600 i NZY medium på shaker-inkubator ved 37 ° C er vist i figur 1A (en kurve som er merket med tomme sirkler). Antallet bakterier økte fra 3,2 10 til 6 x 4,0 x 10 8 CFU / ml. Figur 1A (en kurve som er merket med fylte sirkler) viser resultatene av ko-dyrking av 2,0 x 10 6 PFU / ml fri phage tilsatt samtidig med den samme konsentrasjon av S. aureus ATCC 12600. Phage, immobilisert på overflaten gull, demonstrerte den lytisk aktivitet som kan sammenlignes med aktiviteten av fagen i suspensjon (figur 1A, kurve merket ved toppen og ned trekanter). Immobilisert phage forble infeksiøs da gullet stykke med phage ble først brukt i 24-timers eksperimentet vokser, den ble deretter vasket 5 ganger i PBS og lagret i 6 dager ved 4 ° C, og til slutt brukt om igjen med en ny bakteriell suspensjon. (Figur 1A, kurve merket av topp opp trekanter). Det virker som immobilisert phages injisere deres DNA i bakterier, slik void capsids, som er i stand til å infisere nye bakterier. Vi hypotese at immobilisert phages på en gull overflate fungert som primær "katalysatorer" for å infisere noen bakterier, som genererer gratis phages de i sving infisere nye bakterier og så videre. Derfor ble det meste av immobiliserte fager trolig ikke brukes i et første 24-timers eksperimentet vokser og derfor kan utnyttes for andre gang. Overflaten tettheten av phages avsatt av fysisk adsorpsjon var om ~ 0,7 fagpartikkelen / mikrometer to. Denne konsentrasjonen er høy, men det kan vokse opp til 10 ganger to. Derfor kan gull plate innlemme some av de gratis levedyktige phages utgitt av infiserte bakterier i den første 24-timers voksende eksperiment.
Figur 1B viser lysis sone rundt gull stykke, noe som indikerer at immobiliserte fager var i stand til å lysere bakteriecellene. I kontroll-eksperimenter, fant den tomme gull plate ikke hemme bakterievekst. Derav effektiv reduksjon av bakteriell vekst fant ved ko-kultur av bakterier og immobilisert phage er et resultat av interaksjon av primær vannsuspenderte bakterier og fag-bundet, som vist i figur 1C. Fagen løsgjøring fra gull-overflaten under koinkubering av bundet fage og bakterier var liten. For å anslå hvor mange fager ble løsrevet fra gull overflate under inkuberingen, ble prøvene med bundet fage nedsenket i NZY oppløsning, rystet i shaker-inkubator ved 37 ° C i 8 t, og en fri phage-konsentrasjonen i supernatanten ble målt. Vi bestemt at 4,1 x 10 7 PFU var bound til et 60 mm to gull stykket (~ 0.7 fagpartikkelen / um 2), da bare 3 x 10 PFU 4 ble frittliggende (0.007% løsgjøring).
Transmisjonen og scanning elektron mikrografer av intakt lytisk phage 12600 på gull substratoverflaten er vist i figurene 2A og 2B. Når fagen suspensjon ble underkastet kloroformbehandling ble fagen fysiske utseende endres. Halen kontrakt i lengde og fortykket. Den polygonal hode ble avrundet (Tall 2D og 2E). Vi kalte den strukturelt modifisert lytisk fag "spheroid" lik navnet på kloroform behandlet trådformede fag 26. Til tross for de betydelige strukturelle endringer resulterte fra kloroform behandling, har spheroid lytisk aktivitet målt ved plakk tallene ikke endret (Tall 2C og 2F). Den midlere lytisk aktivitet av fagen og sfæroider var (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (n = 4) og (7.5 ± 1.0 (SD)) x 10 10 (N = 7), PFU / ml. På 0,05 nivå, var virksomheten i fag og sfæroider ikke signifikant forskjellig (figur 2C og 2F).
De QCM sensorer med immobilisert lytisk phages viste ingen signifikante endringer i resonans frekvens eller energi utskeielser når de ble utsatt for MRSA (figur 3A). Disse dataene indikerer at MRSA / fag samspill resulterte i en ingen masse endring i henhold til QCM, og likevel elektronet mikrografer av Post analysert biosensorer avdekket betydelig bakteriell binding ved sensoren overflaten (Figur 3B).
Når MRSA suspensjoner ble injisert inn i flyten celle med fag-sfæroide biosensorer, en betydelig reduksjon i frekvensen (Δ f ≈ -105 Hz) og en økning i spredning (DD-≈ 26 DU) ble observert (Figur 3C). Etter fag-spheroid-bakterielle (MRSA) binding interaksjoner, analysert sensors ble utsatt for PBP2a antistoff konjugert latex perler suspensjoner. Disse MRSA analysert biosensorer reagert på PBP2a antistoff-konjugerte latekskuler suspensjoner, siden en ytterligere reduksjon i frekvensen (f Δ ≈ -45 Hz) og en økning i ødsling (DD-≈ 15 DU) ble observert (figur 3C). Binding av MRSA til fag-prober og PBP2a antistoff konjugert latex perler ble bekreftet ved hjelp av skanning elektron mikroskopi undersøkelser (Figur 3D).
Når fag spheroid biosensor ble utsatt for MSSA suspensjoner, en betydelig reduksjon i frekvensen (Δ f ≈ -200 Hz) og en økning i spredning (DD-≈ 55 DU) ble observert (Figur 3E). Etter fag-spheroid-MSSA binding interaksjoner, ble analysert sensorer utfordret med PBP2a antistoff konjugert latex perler suspensjoner. Utgangspunktet, MSSA analysert biosensor viste korte transienter avøker i frekvens og reduksjon i utladning. Etter noen få minutter av MSSA og PBP2a antistoff konjugert latex perler interaksjoner, returnerte frekvens å legge PBP2a antistoff innføring nivåer, men avledende energi økt (Figur 3E). Binding av MSSA til fag-prober ble bekreftet med scanning elektron mikroskopi, men ingen binding mellom MSSA og PBP2a antistoff konjugert latekskuler ble observert (Figur 3F). Ellipsometric tykkelse profil, 3D tykkelse kartet lytisk phages og Staphylococcus bakterier er vist i Utfyllende Tall S1 og S2.
Etter kontakt av sensorer med LB immobiliserte fager eller sfæroider til suspensjonen av 10 9 celler / ml av MRSA eller MSSA ble bakteriene observert å binde fager eller sfæroider ved tetthet (ρ) på 9,1 x 10 7 (MRSA / intakte fager), 7,9 x 10 7 (MRSA / sfæroider), og 7,2 x 10 7 (MSSA / sfæroider) celler / cm 2. Ived bruk av 5 forskjellige lytiske fager og 2 vert bakterier 27, forskere underkastet phages immobilisert ved kovalent binding til metoden 10 9 celler / ml bakterier, og bestemmes fagen fangst effektivitet i en rekke (2.5 til 8.9) 5 x 10 celler / cm 2 . Fag-fangst effektivitet presentert i dette arbeidet er ~ 100 ganger høyere.
| Host | Sil | Strain detaljer | Meticillin følsomhet | Fag følsomhet |
| S. aureus | 12600 | ATCC | S | + |
| S. aureus | 27690 | ATCC | S | + |
| S. aureus | 10292 | IA | S | + |
| 10378 | IA | S | + | |
| S. aureus | 10497 | IA | S | + |
| S. aureus | 10686 | IA | S | + |
| S. aureus | MRSA 1 | AU | R | + |
| S.aureus | MRSA 2 | AU | R | + |
| S. aureus | MRSA 5 | AU | R | + |
| S. aureus | MRSA 13 | AU | R | + |
| S.aureus | MRSA 26 | AU | R | + |
| S. aureus | MRSA 34 | AU | R | + |
| S. aureus | MRSA 45 | AU | R | + |
| B. anthracis | Sterne | AU | NA | - |
| Salmonella typhimurium | LT2 | AU | NA | - |
| Shigella flexneri | ukjent | AU | NA | - |
| Yersinia enterocolitica | ukjent | AU | NA | - |
| Proteus mirabilis | ukjent | AU | NA | - |
| Klebsiella pneumoniae | 13882 | AU | NA | - |
| Bacillus subtilis | 6051 | ATCC | NA | - |
Tabell 1. Phage 12600 følsomhet for bakteriell stog IA - isolert fra dyr;. AU - bakteriekultur samling av Auburn University, NA - ikke aktuelt, a - lytisk aktivitet av fag ble definert av plakk dannelse, +, følsom, -, ikke sensitive. Overnattingsturer kulturer av testede isolatene ble platet ut på platene med NZY agar. Etter at overflaten tørket, ble en prøve (10 ul) av 10 11 PFU phage suspensjon flekket på overflaten av platen. Plater ble inkubert ved 37 ° C i 18-24 timer. Lytisk aktivitet av fager ble detektert ved dannelsen av plakk.
Figur 1. Infeksiøse egenskaper av bundet og fri fage. A. bakterievekst i fravær (tomme sirkler) og nærvær (fylte sirkler) av fri phage, i nærvær av fagen bundet til gull overflate (topp opp triangles), og i nærvær av fag-bundet til gull overflate etter 6 timer ved 4 ° C (topp ned trekanter). Sett: Linjen (1) viser en lineær tilpasning av de ingen fag-vekst eksperimentelle data til ligning (4) (R = -0,99, p <0,0001). Linjen (2) viser en tilpasning av de eksperimentelle data for bakterievekst ved den frie phage tilstedeværelse til den samme ligning. Bakterievekst konstant (k) i fravær og nærvær av fri phage, er lik 0,88 og 0,64, (-0,048, nedgang fase). Representative data for tre uavhengige eksperimenter er vist i panel A. en midlere relative feilen OD 600 målinger ikke overstige 5%. B. Phage immobilisert til gull-overflaten er infeksiøs som indikert ved lysis sone rundt gull stykke. 1 - fragmentet på agarplate med bakterier, 2 - gullet stykke med immobilisert phage,. 3 - hemningssonen rundt gull stykket C. Skjematisk representasjon av bakterien lysering av phage festet til gull overflate. 1 -gull-belagt kvarts stykke, 2 - fag bundet til gull overflate, 3 - bakterien forankret ved bundet phages, 4 - gratis phages har utgitt ved sprengning smittet bakterien. Brukt med tillatelse fra: Guntupalli, R., et al 2012.. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Egenskapene til intakt og modifisert fag A og B - Transmission og skanning elektronmikroskop mikrografer av intakt fag, henholdsvis;.. C - fag lytisk aktivitet på en agar plate med MRSA D og E - Transmission og skanning elektronmikroskop mikrografer av intakte fag-sfæroider, henholdsvis; F - phage sfæroider lytisk enctivity på en agar plate med MRSA. Den midlere aktivitet av fagen og sfæroider er (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (n = 4) og (7,5 ± 1,0 (SD)) x 10 10 (N = 7) PFU / ml. T-test: t = 0,15682, p = 0,87851. På 0,05 nivå, aktivitetene til fag og sfæroider er ikke signifikant forskjellig. Barer: A, B, D og E: 200 nm. Brukt med tillatelse fra:. Guntupalli, R., et al 2012.
Figur 3. Kombinerte QCM-D og EM-analyse av phage-bakterier interaksjoner. Bakteriene ble levert til sensoren i en konsentrasjon i 10 9 CFU / ml suspensjoner i vann ved en strømningshastighet på 50 mL / min. 1, 2 representerer endringer i resonans-frekvensen og energien ødsling, henholdsvis. A. Phage belagt QCM-D sensor respons på MRSA. Pilen viser than MRSA leveringstid til sensor overflaten. B. Scanning electron micrograph av post analysert MRSA bundet til lytisk fag immobilisert på QCM sensor. M-MRSA, p-fager på sensoroverflaten. C. Etterfølgende reaksjoner fra fagen belagte sfæroider QCM-D-sensor til MRSA først og deretter av PBP antistoffkuler. Piler indikerer MRSA og PBP antistoff leveringstid til sensor overflaten, henholdsvis. D. Scanning electron micrograph av post analysert biosensor med fag-sfæroider, MRSA, og PBP antistoff perler. Tykke og tynne pilene viser typisk MRSA celle og antistoff perle, henholdsvis. E. Etterfølgende reaksjoner fra fag-sfæroider belagt QCM-D sensor til S. aureus først og deretter til PBP antistoffkuler. Pilene viser S. aureus og PBP antistoff leveringstid til sensor overflaten, henholdsvis. F. Scanning electron micrograph av post analysert biosensor med fag-sfæroider, S. aureus, og PBP antistoffkuler. Tykke og tynne pilene viser typisk S. aureus-celler og antistoffet vulsten hhv. Brukt med tillatelse fra: Guntupalli, R., et al 2012.. Klikk her for å se større figur .
Utfyllende Tall
Figur S1. Supplerende Figur 1. (A) og (b) er en ellipsometric tykkelse profil og 3D tykkelse kart for et lytisk fag, henholdsvis (effektiv brytningsindeks = 1,05). Tykkelse profiler viser gjennomsnittet, RMS ruhet, minimum, og maksimal tykkelse på monolayer. En linje på tvers av tykkelsen kart ble trukket for å generere tykkelsesprofilen.
50474/50474figs2.jpg "/>
Figur S2. Supplerende Figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er velkjent at fager kan anvendes som prober for biosensor bakterielle patogener 28. Det er demonstrert i dette arbeidet som phage sammen med PBP 2a-antistoffer kan anvendes for å løse det gamle problemet: rapid diskriminering antibiotika resistente og sensitive stammer.
Man fant imidlertid de vanlige umodifiserte stafylokokkale fager er ikke egnet for bakterier deteksjon med QCM-enheter, selv om de binder bakterier. Den fag-hale er så lang at akustiske bølger ikke kan «strekke» bakterier bundet til enden av phage haler. Denne tilstand resulterte i en "manglende mass"-effekten 29 og manglende evne til å registrere resonansfrekvens og dissipasjon endring på tross av det viste signifikant binding av EM bilder (figurene 3A og 3B). Dette problemet var lett løses ved å erstatte den intakte fagen med sfæroider, fagen modifisert ved kloroform-vannbehandling. Denne behandlingen resulterte i fullt funksjonell phage med kort, tykk og ikke-fleksibel hale (figur 2D, 2E og 2F). Når phages ble erstattet med sfæroider i biosensorer, ble MRSA lett oppdages av QCM-D enhet.
Når fag-partikler ble bundet til gull overflater på en skikkelig orientering, var deres reseptorer tilgjengelig for verten bakterier. Dersom direkte fysisk kontakt mellom en fast overflate med fager og en tørket bakteriell sjikt forekommer, de immobiliserte fager er i stand til å injisere virale genomet inn i verts-bakterien (figur 1C). Disse resultatene stemmer godt overens med de som oppnås med lytisk phages immobilisert til glass disk overflater av en kovalent binding teknikk 27. Muligheten av bundet lytiske phages å fange vert bakterier ble også demonstrert ved anvendelse av et biotinylert phage immobilisering teknikk 30.. I kontrast, har en veldig enkel fysisk adsorpsjon metode for å feste ordentlig orienterte phages til faste overflater blitt utnyttet 31. Than høy phage sfæroide fangst effektivitet kan brukes til å lage effektive antimikrobielle overflater. En total tid før svar for den foreslåtte analysen er ca 16 min per prøve. Denne gangen kan bli dramatisk forkortet ved hjelp QCM enheter med et stort antall kamre. Den forventede holdbarhet for fag-sensorene er omtrent på 3-4 måneder ved romtemperatur. Med en biopolymer beskyttelse kan det forlenge opptil et par år 32. Påvisningsgrensen for S. aureus ble målt for denne fagen ved en overflate plasmon resonans-spektroskopi og funnet å være 10 4. CFU / ml 18.
En av de viktigste forutsetningene for bruk av metodene som er beskrevet i denne artikkelen er å følge med rene og sterile forhold 33 krav til alle eksperimenter med phages og bakterier.
Vanlig brukte metoder for påvisning av MRSA, som for eksempel disk diffusjon Oxacillin agar skjermen test eller kjøttkraft microdilution ta normally opp til 24 timer for å gjennomføre prøven. Raske teknikker som inkluderer automatiserte teknikker som Vitek GPS-SA-kort, Rapid ATB Staph system, Rapid Microscan Panel system, og Crystal MRSA ID-system også produsere resultater etter 3-11 timer 9-14. PCR-eller DNA-hybridisering av mecA gen 15 er en forholdsvis rask og nøyaktig metode, men krever rensede DNA og er ekstremt følsomme urenheter. I motsetning til dette er den fremgangsmåte som beskrives i dette arbeidet hurtig, trenger ikke DNA-ekstraksjon, og den er ikke følsom for tilsetningsstoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Arbeidet rapporteres her ble støttet med tilskudd fra Auburn University AUDFS og USAF CRADA 07-277-60MDG-01. Synspunktene i denne artikkelen er de av forfatterne, og reflekterer ikke den offisielle politikk eller plasseringen av United States Air Force, Department of Defense, eller den amerikanske regjeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| spectrophotometric-grade chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 154733 | (99.8% A.C.S.) |
| Hexane-Anhydrous | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 29609-0 | (95%) |
| Ethyl Alcohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT | 64-17-5 | 190 Proof |
| Equipment | |||
| PBP 2a antibody conjugated latex beads | Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan | The MRSA-Screen test | |
| S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from | American Type Culture Collection (Manassas, VA); | ||
| MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 | The culture collection of Auburn University, Auburn, AL | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K Ultra Centrifuge | |
| KSV 2200 LB film balance | KSV Chemicals, Finland | ||
| Light microscope optical system | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| QCM-D | Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden | E4 | |
| Scanning electron microscope (SEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL-7000F SEM | |
| Transmitting electron microscopy (TEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL, JEM 2010 | |
| Stericup, Presterilized | Millipore Corporation, Billerica, MA | SCGPU05RE | 0.22 μm, GP Express PLUS membrane |
| Bio-Assay dish | NUNC A/S, Denmark | 240835 | Dimensions(mm), 245 x 245 x 25 |
| Pipettes | Gilson, Pipetman, France | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific, CT | Classic C24 | |
| Gold-coated quartz pieces | Auburn University, AL | Homemade | |
| Petri dishes | Fisher Brand, USA | 0875713 | 100 mmX15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, ME | SG403 | |
| Culture Growing Flasks | Corning Incorporated, NY | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks |
| Optical Spectrometer | Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. | 4001 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma, USA | PDC-32G | |
| Millipore water purification system | Millipore | Direct-Q | |
| Imaging Ellipsometer | Accurion, USA | nanofilm_ep3se | |
| Software | Q-Sense AB, Sweden | QSoft, QTools | |
References
- Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
- Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements. J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).
- Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films. Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).
- Barie, P. S. Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).
- Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).
- Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract. Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).
- Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations. J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).
- Knopf, H. J. Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus. Urologe A. 36, 248-254 (1997).
- Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).
- Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).
- Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).
- Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of BBL crystal MRSA ID system. J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).
- Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System. J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).
- Zambardi, G., Fleurette, J., et al. European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).
- Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
- Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).
- Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).
- Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).
- Popham, D. L., Young, K. D. Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis. Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).
- Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH. J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).
- Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).
- Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).
- Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Rapid and sensitive biosensor for Salmonella. Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).
- Sauerbrey, G. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing. Z. Phys. 155, 206-222 (1959).
- Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
- Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface. Cell. 23, 747-753 (1981).
- Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces. Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).
- Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. Missing mass" effect in biosensor's QCM applications. Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).
- Gervals, L., Gel, M., et al. Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).
- Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption. Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).
- Sorokulova, I., Watt, J., et al. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).
- Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
