Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

Published: May 8, 2013 doi: 10.3791/50474
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University, 2Clinical Research Laboratory, 81st Medical Group, Keesler Air Force Base

Summary

Biosensores fagos líticos y los granos de anticuerpos son capaces de discriminar entre resistente a la meticilina (MRSA) y la bacteria estafilococo sensibles. Los fagos se inmovilizaron mediante un método de Langmuir-Blodgett sobre una superficie de un sensor de microbalanza de cristal de cuarzo y trabajaron como amplias sondas estafilococo gama. Perlas de anticuerpos reconocen SARM.

Abstract

Un bacteriófago lítico estructuralmente transformado que tiene una amplia gama de huéspedes de cepas de Staphylococcus aureus y una proteína de unión a penicilina (PBP 2a) de anticuerpos conjugados con perlas de látex se han utilizado para crear un biosensor diseñado para la discriminación de resistente a la meticilina (SARM) y sensible a la meticilina (SASM) S . especies aureus 1,2. Los fagos líticos se han convertido en esferoides de fagos por el contacto con la interfase agua-cloroformo. Fagos monocapas esferoide se han movido en una superficie biosensor de Langmuir-Blodgett (LB) Técnica 3. Los biosensores creados han sido examinados por una microbalanza de cristal de cuarzo con seguimiento de disipación (QCM-D) para evaluar las interacciones bacteria-fago. Interacciones bacteria-esferoide llevaron a la reducción de la frecuencia de resonancia y un aumento de la disipación de la energía, tanto para las cepas de SARM y SASM. Después de la unión bacteriana, estos sensores han sido expuestos más al anticuerpo de proteína de unión a penicilina perla de látexs. Sensores analizados con MRSA respondieron a PBP 2a cuentas de anticuerpos, aunque sensores inspeccionados con SASM dieron ninguna respuesta. Esta distinción experimental determina una discriminación inequívoca entre resistente a la meticilina y S. sensible cepas de Staphylococcus. Igualmente consolidados y no consolidados bacteriófagos suprimen el crecimiento de bacterias en las superficies y en suspensiones de agua. Una vez que los fagos líticos se transforman en esferoides, que conservan su fuerte actividad lítica y muestran una alta capacidad de captura bacteriana. Los esferoides de fago y los fagos se pueden utilizar para la prueba y la esterilización de los microorganismos resistentes a los antibióticos. Otras aplicaciones pueden incluir el uso en la terapia de bacteriófagos y las superficies antimicrobianas.

Introduction

Cepas resistentes a la meticilina de Staphylococcus aureus se han sugerido como un factor en las infecciones esenciales y los brotes nosocomiales 4-8. Las formas más comunes de reconocimiento de la resistencia a la meticilina, tales como la prueba de difusión en disco oxacilina agar pantalla, o de microdilución en caldo, se basan en las condiciones de cultivo a medida para mejorar la expresión de la resistencia. Las alteraciones incluyen la utilización de oxacilina, incubación a 30 o 35 ° C en lugar de 37 ° C, y la inclusión de NaCl al medio de crecimiento. Por otra parte, para la detección correcta de estos tipos de técnicas, en lugar de 16 a 18 horas se requiere un largo período de incubación de 24 h. Técnicas rápidas con nivel apropiado (> 96%) de la sensibilidad para la identificación de la resistencia a la meticilina incluyen técnicas de microdilución automatizados tales como la tarjeta Vitek GPS-SA, el sistema Rapid ATB Staph, y el sistema Rapid Panel de Microscan que producen resultados después de 3-11 hr 9-11. El Crystal MRSA sistema de identificación es un método rápido que se basa en el reconocimiento de crecimiento de S. aureus en presencia de 2% de NaCl y 4 mg de oxacilina por litro con un sensor de fluorescencia sensible al oxígeno. Sensibilidades reclamados varían entre el 91 y el 100% después de 4 horas de incubación 12-14. Estos métodos fenotípicos están limitados en sus exactitudes por el impacto de las cepas prevalentes que expresan resistencia heterogénea. Por lo tanto, los mejores métodos aceptados para el reconocimiento de la resistencia a la meticilina es PCR o hibridación de ADN del gen mecA 15. Sin embargo, esta técnica requiere ADN purificado y es extremadamente sensible a varias mezclas (impurezas), que incluyen restos de células de 16.

Además, estas técnicas necesitan mucho tiempo para llevar a cabo. Estrategias para el reconocimiento del producto del gen mecA, proteína PBP 2a, se podrían utilizar para determinar la resistencia y pueden ser más fiable en comparación con las técnicas de ensayo estándar 17.

Staphylococcus aureus incluso los que tienen resistencia a la meticilina 1,2,18. En este trabajo hemos propuesto una nueva técnica en el reconocimiento específico y la detección de MRSA, tales como el reconocimiento de las bacterias, junto con la conformación de MRSA en tiempo real. Para este propósito específico de una S. bacteriófago aureus con un amplio espectro de huéspedes (incluyendo cepas de SARM) en combinación con el anticuerpo monoclonal contra la proteína (PBP 2a) se han utilizado. PBP 2a es una proteína de la pared celular y que es la causa de la resistividad antibiótico de MRSA. Sin embargo anticuerpo PBP 2a no es específico para S. aureus, ya que algunas otras bacterias tienen proteínas de unión a los antibióticos con secuencia similar a PBP 2a 19,20. En consecuencia, en este trabajo, S. bacteriófago aureus y anticuerpos contra la proteína PBP 2a se han utilizado. Para ser capaz de desarrollar un biosensor que específicamentecamente detectar e identificar MRSA un dispositivo con una acción en dos etapas se ha utilizado. El paso inicial utilizó una S. aureus monocapa bacteriófago como un sensor de la sonda, mientras que el segundo paso emplea PBP 2a anticuerpos específicos. Por lo tanto, el primer paso será reconocer S. bacteria Staphylococcus, como el otro serán sensibles a la proteína de unión a los antibióticos. Cuando las señales recibidas de los dos pasos son positivos, que indica la detección específica de MRSA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparando el escenario

  1. Obtener la cepa de tipo S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 y Bacillus subtilis ATCC 6051. Cepas resistentes a la meticilina de S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, 13 MRSA, MRSA 26, 34 MRSA, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; El fago lítico 12600.
  2. Obtener PBP 2a anticuerpos conjugados con perlas de látex.
  3. Preparar medio NZY tal como se describe 21.
  4. Obtener solución tamponada con fosfato salino (PBS).
  5. Preparar agua desionizada como subfase de Langmuir-Blodgett (LB) deposición monocapa.

2. Propagación del bacteriófago y Titulación

  1. Incubar 5 ml de cultivo de una noche de S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 unidades formadoras de colonias (UFC) / ml) con 500 l de fago (3 x 10 9 </ Sup> PFU / ml) en 500 ml de medio NZY en 2 L de Flack en un agitador-incubador a 37 ° C durante la noche.
  2. Centrifugar cultivo a 4424 xg durante 10 min a 4 ° C.
  3. Sobrenadante se volvió a centrifugar a 11.325 xg durante 10 min a 4 ° C.
  4. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro Millipore de 0,22 micras.
  5. Centrifugar el filtrado a 75.395 xg durante 1,5 horas.
  6. Disolver el precipitado en 100 l de agua destilada.
  7. Preparar diluciones de 10 veces de la suspensión de fagos en medio NZY.
  8. Placa 1 ml de cultivo de una noche (ON) de S. aureus ATCC 12600 en cada una de 2 placas con agar NZY para asegurarse de cubrir toda la superficie. Retire el exceso de la cultura y deje que la superficie se seque durante 30 minutos.
  9. Detectar una muestra (10 l) de la dilución apropiada del fago sobre la superficie de la placa y se incuba a 37 ° C durante 18-24 horas.
  10. Examinar la formación de placas y calcular el título de fagos. Los títulos de bacteriófagos (T) se calcula sobre la base del número de pLaques (N) formadas por 10 l de volumen (V) de suspensión de fago y el factor de dilución (F). El título se calculó por la fórmula:. T = N / (vxf) Por ejemplo, para el número de placas 75 a la dilución 10 -7 y el volumen de 10 l (10 x 10 -3 ml), el título es igual 75 / (10 x 10 x 10 -3 -7) = 7,5 x 10 10 unidades formadoras de placa (UFP) por ml de suspensión.

3. Phage Oro-inmovilizada

  1. Piezas de cuarzo recubiertos de oro Limpio (60 mm 2) de grabado con plasma en atmósfera de argón durante 10 min y después se esterilizan durante 6 horas bajo luz UV en un gabinete estéril.
  2. Añadir 50 microlitros de 1 x 10 9 UFP / ml de suspensión de fagos a la superficie de oro de cada pieza en una placa de Petri estéril, y luego incubar durante la noche en una cámara húmeda a temperatura ambiente.
  3. Retire y título de la suspensión de fago restante.
  4. Lavar piezas con fago unido 5 veces con PBS para eliminar no unidofagos.

4. Las pruebas de infectividad fago inmovilizado sobre una superficie seca

  1. Difundir una cultura de O / N de S. Aureus ATCC 12600 en una placa de agar NZY y dejar secar.
  2. Coloque una pieza de oro con el fago inmovilizado en la placa frontal hacia abajo.
  3. Observe una zona de lisis después de 12 h de incubación a 37 ° C que indica la infectividad.
  4. Utilice piezas cubiertos de oro sin fagos en los experimentos de control.

5. Pruebas de actividad lítica de fagos libres y ligados en el líquido

  1. Añadir una cultura ON del S. aureus ATCC 12600 a 10 ml de NZY en cada uno de cuatro matraces de 300 ml brazo lateral (6 x 10 6 UFC / ml en cada matraz).
  2. Añadir en dos matraces de 2 x 10 6 PFU / ml de fagos libres.
  3. Utilice las otras dos frascos como controles.
  4. Vigilar la evolución temporal de la S. lisis celular aureus para 570 min por medición de la densidad óptica (DO 600) a intervalos de 30 min para todos los matraces.
  5. Tome una medición final a las 24 horas.
  6. Repita los pasos 5.1 a 5.5, pero el uso de piezas de oro con fagos unidos en vez de fagos libres, y piezas de oro sin fago en frascos de control.

6. La pérdida de los fagos unidos Durante la Incubación

  1. Añadir 50 l de 1 x 10 9 PFU / ml de fago sobre la superficie de la pieza de oro estéril en una placa de Petri que se coloca en una cámara húmeda durante la noche a temperatura ambiente.
  2. Extraiga la suspensión con el fago no unido de la superficie de oro y el título.
  3. Lave la pieza de oro con fagos unidos 5 veces con PBS y colóquelos en 1 ml de solución NZY 15 ml tubo de agitador-incubador a 37 º C durante 8 horas.
  4. Determinar el título del fago individual como se describe en 2.

7. Phage Spheroids Preparación

  1. La combinación de 400 l de suspensión de fago 12600 (10 11 UFP / ml) con un volumen igual de cloroformo espectrofotométrico grado en 1 ml frascoa temperatura ambiente.
  2. Suavemente vórtex con la suspensión de fago-cloroformo 5-6 veces (intervalos de 5 segundos) más de un minuto de duración.
  3. Con la suspensión de estabilizar durante 30 segundos y luego pipeta de la fase superior que contiene esferoides se pipeta para la preparación monocapa.
  4. Tómese unos microlitros de la suspensión esferoides para la transmisión y microscopía electrónica de barrido.
  5. Utilizar una suspensión esferoide restante para la fabricación de biosensores.

8. Preparación biosensor

  1. Limpiar sensores QCM-D por plasma grabado en argón durante 10 min PDC-32G limpiador plasma Harrick.
  2. Enjuague sensor con hexano para eliminar las posibles impurezas orgánicas.
  3. Preparar y limpiar un canal de la balanza película como se describe en el 22.
  4. Rellene través LB con una solución subfase y limpiarlo con una barrera a través y estabilizar el canal a 20 ± 0,1 ° C
  5. Extienda 300 l alícuota de fago 12600 en Suspensiòn acuosaen (10 11 UFP / ml) en subfase LB.
  6. Prepare monocapa fago sobre una solución subfase LB al permitir 300 l alícuota de fago 12600 suspensión acuosa (10 11 PFU / ml) a correr por una varilla de vidrio mojable inclinado que está parcialmente sumergido en la subfase de 22,23.
  7. Estabilizar la monocapa preparada durante 10 min, y luego comprimir a una velocidad de 30 mm / min (45 cm 2 / min), hasta que una presión constante se alcanza 19 N / m.
  8. Realizar una deposición de película vertical sobre posicionado perpendicular sensor de QCM-D a una velocidad de 4,5 mm / min por inmersión sucesiva sensor de dentro y fuera de la monocapa siete veces. La microscopía electrónica de depositado monocapas de fagos antes de la exposición a muestras de bacterias mostró que las capas estaban continua, homogénea y uniforme (datos no mostrados).
  9. Repetir los pasos 4.5 a 4.8 con una suspensión de esferoide fago que se prepara en 3.
  10. Utilice biosensores fagos fabricados por MRSA detección electrónicamicroscopía, y elipsometría.

9. Prueba biosensor, la Discriminación de la meticilina resistente y bacterias estafilococos sensibles

  1. En este protocolo, se preparan biosensores con fago no modificado y modificado y esferoides de fagos. Una microbalanza de cristal de cuarzo con cuatro cámaras de flujo de sensor se utiliza para monitorizar la unión de las bacterias a los fagos inmovilizada en la superficie del sensor QCM. PBP 2a anticuerpos conjugados con perlas de látex se utilizan para discriminar entre resistente a la meticilina (SARM) y bacterias estafilococos sensibles. Todas las mediciones se llevan a cabo en el modo de flujo (50 l / min) a 5 MHz.
  2. Establecer una línea de base de la frecuencia de resonancia del sensor QCM en agua (~ 30 min).
  3. Dibuje una suspensión de células vivas sensibles a meticilina de estafilococos bacterianas en el agua (10 9 UFC / ml) a través de la celda de ensayo.
  4. Un seguimiento continuo de los cambios en la frecuencia de resonancia de sensores y la disipación de la energía para el primer armónico, using el software Q-Soft.
  5. Cuando los cambios en la frecuencia de resonancia de sensores y la disipación alcanzaron niveles de saturación, añadir la suspensión de PBP de anticuerpos conjugados con perlas de látex (6,77 x10 10 perlas / ml) para el flujo durante el monitoreo continuo de la frecuencia y la disipación.
  6. Repita los pasos de 09.02 a 09.05 para las células bacterianas por estafilococos resistentes a la meticilina (MRSA).
  7. Definir un cambio de frecuencia a través de la variación de la masa debido a las bacterias de unión por la ecuación de Sauerbrey 24,25 Df = xn-Delta M / C, donde C es la sensibilidad masa constante (C = 17,7 ng x cm x -2 -1 Hz a 5 MHz ), m es la masa y n es el número de armónicos (n = 1).
  8. Definir un cambio de disipación de energía (Δ D) a partir de la grabación de la disminución exponencial de oscilación (frecuencia y amplitud de amortiguación, lo que permitió la cuantificación de la energía disipada y se almacena durante un período de oscilación,E se disipó y E almacenada, respectivamente: Δ D = E disipada / 2 πE almacenada. Δ D se mide en unidades de disipación (DU), uno DU = 10 -6 unidades relativas).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

El fago demostró actividad lítica contra todas las cepas ensayadas de S. aureus, incluyendo cepas de MRSA, tal como se indica por la prueba de la mancha fago. Tamaños de placa generalmente variaron de 5 a 15 mm. No se encontró actividad contra otros-cultivos de ensayo (Tabla 1).

Un crecimiento normal de S. aureus ATCC 12600 en un medio NZY en un agitador-incubador a 37 ° C se muestra en la Figura 1A (una curva marcada por círculos vacíos). El número de bacterias aumentó de 3,2 x 10 6 a 4,0 x 10 8 UFC / ml. Figura 1A (una curva marcada por círculos rellenos) muestra los resultados de la co-cultivo de 2,0 x 10 6 PFU / ml libre de fago añadirse simultáneamente con la misma concentración de S. aureus ATCC 12600. Fago, inmovilizado sobre la superficie de oro, demostró la actividad lítica comparable con la actividad de fago en suspensión (Figura 1A, la curva marcada por triángulos superiores hacia abajo). Fago inmovilizado permaneció infecciosa cuando la pieza de oro con el fago se utilizó por primera vez en 24-hr creciente experimento, entonces se lavó 5 veces en PBS y se almacenó durante 6 días a 4 ° C, y finalmente reutilizados con una suspensión bacteriana fresca. (Figura 1, la curva marcada por los mejores triángulos arriba). Parece que los fagos inmovilizados inyectan su ADN en las bacterias, dejando cápsides vacías, que son incapaces de infectar nuevas bacterias. Se postula que los fagos inmovilizados sobre una superficie de oro sirvieron como "catalizadores" primarios para infectar unas pocas bacterias, que generan los fagos libres de los que a su vez infectar nuevas bacterias y así sucesivamente. Por lo tanto, la mayor parte de los fagos inmovilizados fueron probablemente no se utiliza en un primer experimento de 24 horas cada vez mayor y, por lo tanto, puede utilizarse una segunda vez. La densidad de superficie de fagos depositados por adsorción física fue de aproximadamente 0,7 ~ fago partículas / m 2. Esta concentración es alta, pero puede crecer hasta 10 veces 2. Por lo tanto, la placa de oro podría incorporar slgunos de los fagos viables libres liberados por las bacterias infectadas en el primer experimento de 24 horas cada vez.

La Figura 1B muestra la zona de lisis alrededor de la pieza de oro, lo que indica que los fagos inmovilizados fueron capaces de lisar las células bacterianas. En los experimentos de control, la placa de oro vacío no inhibió el crecimiento bacteriano. Por lo tanto la disminución efectiva del crecimiento bacteriano encontrado en el co-cultivo de bacterias y el fago inmovilizado es un resultado de la interacción primaria de las bacterias en suspensión de agua y fago unido tal como se muestra en la Figura 1C. El desprendimiento de fago a partir de la superficie de oro durante la co-incubación de los fagos unidos y bacterias era pequeña. Con el fin de estimar el número de fagos se separa de la superficie de oro durante la incubación, las muestras con fago unido se sumergieron en solución de NZY, se agitó en el agitador-incubador a 37 ° C durante 8 horas, y se evaluó una concentración fago libre en el sobrenadante. Se determinó que 4,1 x 10 7 PFU eran bound a una pieza de 60 mm 2 de oro (~ 0,7 fago partículas / m 2), cuando sólo 3 x 10 4 PFU se separaron (0,007% desapego).

La transmisión y micrografías electrónicas de barrido de intacta fago lítico 12600 en la superficie del sustrato de oro se muestran en las Figuras 2A y 2B. Cuando la suspensión del fago se sometió a tratamiento con cloroformo, la apariencia física del fago fue cambiado. La cola se contrajo en longitud y se espesó. La cabecera poligonal convirtió redondeada (Figuras 2D y 2E). Hemos denominado el fago lítico estructuralmente modificado "esferoide" similar al nombre del cloroformo tratado fago filamentoso 26. A pesar de los importantes cambios estructurales como resultado del tratamiento de cloroformo, la actividad lítica esferoide medido por los números de la placa no ha cambiado (Figuras 2C y 2F). La actividad lítica media de fago y esferoides fueron (7,4 ± 1,5 (SD)) 10 x 10 (N = 4) y (7.5 ± 1.0 (SD)) 10 x 10 (N = 7), PFU / ml. En el nivel de 0,05, las actividades de fago y esferoides no fueron significativamente diferentes (Figura 2C y 2F).

Los sensores QCM con fagos líticos inmovilizadas no mostraron cambios significativos en la frecuencia de resonancia o disipación de energía cuando fueron expuestos a SARM (Figura 3A). Estos datos indican que la interacción MRSA / fago resultó en un cambio ninguna masa de acuerdo con la QCM, y sin embargo, las micrografías electrónicas de correos biosensores ensayadas revelaron significativa la unión bacteriana a la superficie del sensor (Figura 3B).

Cuando las suspensiones de MRSA fueron inyectados en la celda de flujo con fagos biosensores esferoide, una disminución sustancial en la frecuencia (f Δ ≈ -105 Hz) y un aumento de la disipación (Dd ≈ 26 DU) se observó (Figura 3C). Tras esferoide-bacterianas interacciones de unión de fagos (MRSA), se ensayó en sínsors fueron expuestos a PBP2a de anticuerpos conjugados de látex perlas de suspensiones. Estos SARM ensayó biosensores respondieron a los conjugados de anticuerpos PBP2a suspensiones de perlas de látex, ya que una disminución en la frecuencia (f Δ ≈ -45 Hz) y se observó un aumento en la disipación (Dd ≈ 15 DU) (Figura 3C). La unión de MRSA al fago sondas y PBP2a anticuerpos conjugados con perlas de látex se confirmó mediante microscopía electrónica de barrido investigaciones (Figura 3D).

Cuando el esferoide biosensor fago fue expuesto a las suspensiones de SASM, una disminución sustancial en la frecuencia (f Δ ≈ -200 Hz) y un aumento de la disipación (Dd ≈ 55 DU) se observó (Figura 3E). Después de las interacciones de unión esferoide-SASM fagos, sensores ensayadas fueron desafiados con PBP2a anticuerpos conjugados de látex cuentas suspensiones. Biosensor Inicialmente, el SASM ensayó mostró transitorios cortos deaumento de la frecuencia y disminuir en la disipación. Después de unos minutos de SASM y PBP2a de anticuerpos conjugados de látex perlas de interacciones, la frecuencia volvió a publicar los niveles de introducción de anticuerpos PBP2a, pero aumentó la energía disipativa (Figura 3E). La unión de SASM a las sondas de fagos se confirmó con microscopía electrónica de barrido, pero no hay unión entre SASM y PBP2a anticuerpos conjugados con perlas de látex se observó (Figura 3F). Perfil de espesor elipsométricas, 3D mapa de espesores de los fagos líticos y bacterias estafilococos se muestran en las figuras suplementarios S1 y S2.

Después del contacto de los sensores con LB fagos o esferoides inmovilizados a la suspensión de 10 9 células / ml de MRSA o SASM, se observaron las bacterias para unirse fagos o esferoides en la densidad (ρ) de 9,1 x 10 7 (SARM / fagos intactos), 7,9 x 10 7 (MRSA / esferoides) y 7,2 x 10 7 (SASM / esferoides) células / cm 2. Enpruebas utilizando 5 fagos líticos diferentes y 2 bacteria huésped 27, los investigadores sometieron fagos inmovilizados por el método de unión covalente a 10 9 células / ml de bacterias, y se determinó la eficiencia de la captura de fago en un rango de 02.05 a 08.09 () x 10 5 células / cm 2 . La eficacia de la captura del fago se presenta en este trabajo es de ~ 100 veces mayor.

Anfitrión Colar Detalles Strain Sensibilidad a la meticilina Sensibilidad a fagos
S. aureus 12600 ATCC S +
S. aureus 27690 ATCC S +
S. aureus 10292 Iowa S +
10378 Iowa S +
S. aureus 10497 Iowa S +
S. aureus 10686 Iowa S +
S. aureus MRSA 1 AU R +
S.aureus MRSA 2 AU R +
S. aureus MRSA 5 AU R +
S. aureus MRSA 13 AU R +
S.aureus MRSA 26 AU R +
S. aureus MRSA 34 AU R +
S. aureus MRSA 45 AU R +
B. anthracis Estrellas AU NA -
Salmonella typhimurium LT2 AU NA -
Shigella flexneri desconocido AU NA -
Yersinia enterocolitica desconocido AU NA -
Proteus mirabilis desconocido AU NA -
Klebsiella pneumoniae 13882 AU NA -
Bacillus subtilis 6051 ATCC NA -

Tabla 1. 12.600 fagos sensibilidad de s bacterianarecogida bacteriana cultura de la Universidad de Auburn - UA;; NA - No es aplicable; a - actividad lítica de fago se define por la formación placas, +, sensible, -, no es sensible - trenes IA aisladas de animales.. Cultivos de una noche de cepas analizadas se sembraron en las placas con agar NZY. Después de que la superficie se seca, una muestra (10 l) de 10 11 UFP suspensión de fago fue descubierto en la superficie de la placa. Las placas se incubaron a 37 ° C durante 18-24 horas. Actividad lítica de los fagos se detectó por la formación de placas.

Figura 1
Figura 1. Propiedades infecciosas de fago unido y libre. A. El crecimiento de bacterias en ausencia (círculos vacíos) y la presencia (círculos rellenos) del fago libre, en presencia de fagos unidos a la superficie de oro (arriba a triangles), y en la presencia de fago unido a la superficie de oro después de 6 horas a 4 ° C (de arriba hacia abajo triángulos). Insert: La línea (1) muestra un ajuste lineal de los fagos de crecimiento de datos no experimentales a la ecuación (4) (R = -0,99, p <0,0001). La línea (2) muestra un ajuste de los datos experimentales de crecimiento bacteriano en presencia de fagos libres de la misma ecuación. Constante crecimiento bacteriano (k) en ausencia y presencia de fagos libres, son iguales 0.88 y 0.64, (-0.048, fase de declive). Los datos representativos de tres experimentos independientes se muestran en el panel A. A media relativa de error OD 600 mediciones no superan el 5%. B. El fago inmovilizado a la superficie de oro es infeccioso como se indica por la zona de lisis alrededor de la pieza de oro. 1 - el fragmento de la placa de agar con bacterias; 2 - la pieza de oro con el fago inmovilizado;. 3 - de la zona de inhibición alrededor de la pieza de oro C. Representación esquemática de la bacteria de la lisis por fago unido a la superficie de oro. 1 -pieza de oro recubierto de cuarzo, 2 - fago unido a la superficie de oro, 3 - bacteria anclado por los fagos unidos, 4 - fagos libres han dado a conocer por el estallido bacteria infectada. Usado con permiso de: Guntupalli, R., et al 2012.. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 2
Figura 2. Propiedades de fago intacto y modificado A y B - Transmisión y micrografías electrónicas de barrido de fago intacto, respectivamente.;. C - fago actividad lítica sobre una placa de agar con SARM D y E - Transmisión y micrografías electrónicas de barrido de esferoides de fagos intactos, respectivamente; esferoides fagos líticos a - Fctividad en una placa de agar con MRSA. La actividad media de fago y esferoides son (7,4 ± 1,5 (SD)) 10 x 10 (N = 4) y (7.5 ± 1.0 (SD)) 10 x 10 (N = 7) PFU / ml. T-test: t = 0,15682, p = 0,87851. A nivel de 0.05, las actividades de los fagos y esferoides no son significativamente diferentes. Bares: A, B, D y E: 200 nm. Usado con permiso de:. Guntupalli, R., et al 2012.

Figura 3


Figura 3. Las bacterias combinados QCM-D y análisis de EM de las interacciones fago-bacterias. Fueron entregados al sensor a una concentración de 10 9 UFC / ml suspensiones en agua a una velocidad de flujo de 50 l / min. 1, 2 representan los cambios en la frecuencia de resonancia y la disipación de energía, respectivamente. A. fagos respuesta del sensor QCM-D recubierto de SARM. Flecha muestra tque el tiempo de entrega MRSA en la superficie del sensor. B. Micrografía electrónica de barrido de la post ensayó MRSA obligado a fago lítico inmovilizada en el sensor QCM. M-MRSA, P-fagos sobre la superficie del sensor. C. respuestas sucesivas de los esferoides recubiertos de fagos sensor QCM-D para MRSA primero y luego a PBP perlas de anticuerpo. Las flechas indican el SARM y PBP plazo de entrega de anticuerpos a la superficie del sensor, respectivamente. D. Micrografía electrónica de barrido de la post ensayó biosensor con esferoides fagos, MRSA, y los granos de anticuerpos PBP. Flechas gruesas y delgadas muestra típica célula MRSA y el anticuerpo del grano, respectivamente. E. respuestas sucesivas de los esferoides fagos recubierto sensor QCM-D de S. aureus primero y luego a PBP perlas de anticuerpo. Las flechas indican S. aureus y tiempo de entrega de anticuerpos PBP a la superficie del sensor, respectivamente. F. Micrografía electrónica de barrido de la post ensayó biosensor con esferoides fagos, S. aureus, y PBP cuentas de anticuerpos. Flechas gruesas y delgadas muestra típica de S. células aureus y anticuerpo talón, respectivamente. Usado con permiso de: Guntupalli, R., et al 2012.. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Figuras complementarias

Figura S1
Figura S1. Suplementaria Figura 1. (A) y (b) son un perfil de espesor elipsométrica y 3D mapa de espesor de un fago lítico, respectivamente (índice de refracción efectivo = 1,05). Perfiles de espesor muestran rugosidad RMS, mínimo, máximo y espesor medio, de la monocapa. Una línea a través del mapa de espesores se ha elaborado para generar el perfil de espesor.

50474/50474figs2.jpg "/>
Figura S2. Suplementario Figura 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Es bien sabido que los fagos se pueden utilizar como sondas de biosensores para patógenos bacterianos 28. Se demuestra en este trabajo que fago junto con anticuerpos PBP 2a puede ser utilizada para resolver el viejo problema: las cepas resistentes y sensibles a antibióticos discriminación rápidos.

Se encontró sin embargo esos fagos de estafilococos no modificados normales no son adecuados para la detección de bacterias con dispositivos QCM, a pesar de que las bacterias se unen. La cola del fago es tan larga que las ondas acústicas no pueden "alcanzar" las bacterias unidas al final de las colas de fago. Esta condición dio lugar a una "masa perdida" efecto 29 y la incapacidad para registrar la frecuencia de resonancia y la disipación de cambio a pesar de la unión significativa por EM mostró imágenes (Figuras 3A y 3B). Este problema se resuelve fácilmente mediante la sustitución del fago intacto con esferoides, el fago modificado por tratamiento cloroformo-agua. Este tratamiento resultó en p totalmente funcionalhage con cola corta, gruesa y no flexible (Figuras 2D, 2E y 2F). Cuando los fagos fueron reemplazados con esferoides en biosensores, el SARM se detecta fácilmente por el dispositivo de QCM-D.

Cuando las partículas de fagos fueron obligados a superficies de oro en una orientación correcta, sus receptores eran accesibles a la bacteria huésped. Si se produce el contacto físico directo entre una superficie sólida con fagos y una capa bacteriana seca, los fagos inmovilizados son capaces de inyectar genoma viral en bacterias huésped (Figura 1C). Estos resultados concuerdan bien con los obtenidos con los fagos líticos inmovilizadas a las superficies de disco de vidrio por una técnica de unión covalente 27. La capacidad de los fagos líticos enlazados para capturar bacterias huésped también se demostró mediante el uso de una técnica de inmovilización fago biotinilado 30. Por el contrario, un método de adsorción física muy simple para la fijación de fagos orientadas adecuadamente a las superficies sólidas se ha utilizado 31. Tél de alta eficiencia de la captura esferoide fago se puede utilizar para la fabricación de superficies antimicrobianas eficaces. Un tiempo de respuesta total para el ensayo propuesto es de aproximadamente 16 minutos por muestra. Este tiempo se puede acortar dramáticamente mediante el uso de dispositivos de QCM con un gran número de cámaras. La vida útil esperada de los sensores de fago es de aproximadamente de 3-4 meses a temperatura ambiente. Con la protección de un biopolímero que se puede prolongar hasta unos pocos años 32. El límite de detección de S. aureus se midió para este fago mediante una espectroscopia de resonancia de plasmón superficial, y se encontró que 10 4 UFC / ml 18.

Una de las condiciones más importantes para el uso de los métodos descritos en este artículo es para cumplir con las condiciones limpias y estériles 33 requisitos para todos los experimentos con fagos y bacterias.

Métodos comúnmente utilizados para la detección de MRSA, como la prueba de screening de oxacilina de difusión en disco o microdilución en caldo toman normally hasta 24 horas para llevar a cabo la prueba. Rapid técnicas que incluyen técnicas automatizadas, tales como la tarjeta Vitek GPS-SA, el sistema Rapid ATB Staph, el sistema Rapid Panel de Microscan, y el sistema de Crystal MRSA ID también producen resultados después de 3-11 horas 9-14. PCR o hibridación de ADN del gen mecA 15 es un método relativamente rápido y preciso, pero requiere ADN purificado y es extremadamente sensibles a las impurezas. En contraste, el método descrito en este trabajo es rápida, no necesita la extracción de ADN, y que no es sensible a los aditivos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

El trabajo presentado en este documento fue apoyado por becas de la Universidad de Auburn y AUDFS USAF CRADA 07-277-60MDG-01. Las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan la política o posición de la Fuerza Aérea de Estados Unidos, el Departamento de Defensa, ni del Gobierno de EE.UU. oficial.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
  2. Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements. J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).
  3. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films. Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).
  4. Barie, P. S. Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).
  5. Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).
  6. Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract. Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).
  7. Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations. J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).
  8. Knopf, H. J. Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus. Urologe A. 36, 248-254 (1997).
  9. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).
  10. Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).
  11. Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).
  12. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of BBL crystal MRSA ID system. J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).
  13. Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System. J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).
  14. Zambardi, G., Fleurette, J., et al. European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).
  15. Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
  16. Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).
  17. Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).
  18. Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).
  19. Popham, D. L., Young, K. D. Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis. Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).
  20. Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH. J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).
  21. Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).
  22. Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).
  23. Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Rapid and sensitive biosensor for Salmonella. Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).
  24. Sauerbrey, G. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing. Z. Phys. 155, 206-222 (1959).
  25. Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
  26. Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface. Cell. 23, 747-753 (1981).
  27. Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces. Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).
  28. Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).
  29. Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. Missing mass" effect in biosensor's QCM applications. Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).
  30. Gervals, L., Gel, M., et al. Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).
  31. Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption. Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).
  32. Sorokulova, I., Watt, J., et al. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).
  33. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).

Tags

Bioingeniería Número 75 microbiología enfermedades infecciosas infecciones medicamentos inmunología biología celular biología molecular genética anatomía fisiología farmacología bacterias Staphylococcus bacteriófagos fagos Binding competitivos Biofísica propiedades superficiales (materiales no metálicos) los dispositivos de ondas acústicas de superficie (diseño electrónico) sensores esferoides fagos líticos QCM-D monocapas de Langmuir-Blodgett (LB) MRSA, Ensayo
Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guntupalli, R., Sorokulova, I.,… More

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter