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Bioengineering

एंटीबायोटिक प्रतिरोधी Staphylococcus बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए biosensor

Published: May 8, 2013 doi: 10.3791/50474
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University, 2Clinical Research Laboratory, 81st Medical Group, Keesler Air Force Base

Summary

Lytic फेज biosensors और एंटीबॉडी मोती Methicillin प्रतिरोधी (मरसा) और संवेदनशील Staphylococcus बैक्टीरिया के बीच भेदभाव करने में सक्षम हैं. फगेस एक क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance सेंसर की एक सतह पर एक Langmuir-Blodgett विधि द्वारा स्थिर और व्यापक रेंज staphylococcus जांच के रूप में काम कर रहे थे. एंटीबॉडी मोती मरसा पहचाना.

Abstract

स्ताफ्य्लोकोच्चुस उपभेदों की एक व्यापक मेजबान रेंज और एक पेनिसिलिन बाध्यकारी प्रोटीन (PBP 2 ए) प्रतिरक्षी संयुग्मित लेटेक्स मोती Methicillin प्रतिरोधी (मरसा) और संवेदनशील (MSSA) एस के भेदभाव के लिए बनाया गया एक biosensor बनाने के लिए उपयोग किया गया है होने के एक संरचनात्मक रूप से बदल अपघट्य जीवाणुभोजी . ऑरियस प्रजातियों 1,2. अपघट्य फगेस पानी के क्लोरोफॉर्म इंटरफेस के साथ संपर्क से फेज spheroids में तब्दील कर दिया गया है. फेज अंडाकार आकृति monolayers Langmuir-Blodgett (पौंड) तकनीक 3 से एक biosensor सतह पर ले जाया गया है. बनाया biosensors के बैक्टीरिया फेज बातचीत का मूल्यांकन अपव्यय ट्रैकिंग के साथ एक क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance (QCM डी) द्वारा जांच की गई है. बैक्टीरिया अंडाकार आकृति बातचीत कम अनुनाद आवृत्ति और MRSA और MSSA उपभेदों दोनों के लिए अपव्यय ऊर्जा में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व किया. बैक्टीरियल बंधन के बाद, इन सेंसरों आगे पेनिसिलिन बाध्यकारी प्रोटीन एंटीबॉडी लेटेक्स मनका को उजागर किया गया हैएस. मरसा के साथ विश्लेषण सेंसर 2a एंटीबॉडी मोती PBP को जवाब दिया, MSSA साथ निरीक्षण सेंसर कोई जवाब नहीं दिया है. इस प्रयोगात्मक भेद Methicillin प्रतिरोधी और संवेदनशील एस के बीच एक स्पष्ट भेदभाव को निर्धारित करता है aureus उपभेदों. समान रूप से बाध्य है और अपार bacteriophages सतहों पर और पानी निलंबन में बैक्टीरिया विकास को दबाने. अपघट्य फगेस spheroids में बदल रहे हैं, वे अपने मजबूत अपघट्य गतिविधि को बनाए रखने और उच्च बैक्टीरियल कब्जा क्षमता दिखा. फेज और फेज spheroids एंटीबायोटिक प्रतिरोधी सूक्ष्मजीवों का परीक्षण और नसबंदी के लिए उपयोग किया जा सकता है. अन्य अनुप्रयोगों जीवाणुभोजी चिकित्सा और रोगाणुरोधी सतहों में शामिल हो सकते हैं.

Introduction

स्ताफ्य्लोकोच्चुस की Methicillin प्रतिरोधी उपभेदों आवश्यक संक्रमण और nosocomial प्रकोप 4-8 में एक कारक के रूप में सुझाव दिया गया है. ऐसी डिस्क प्रसार oxacillin अगर स्क्रीन टेस्ट, या शोरबा microdilution रूप मेथिसिलिन प्रतिरोध की मान्यता के आम तरीकों,, प्रतिरोध की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए सिलवाया संस्कृति की स्थिति पर निर्भर हैं. बदलाव oxacillin का उपयोग, डिग्री सेल्सियस की बजाय 37 डिग्री सेल्सियस से 30 या 35 पर ऊष्मायन, और मध्यम विकास के लिए NaCl के शामिल किए जाने हैं. इसके अलावा, तकनीक के इन प्रकार से सही पता लगाने के लिए, 24 घंटे की लंबी ऊष्मायन अवधि के बजाय 16 से 18 घंटे की आवश्यकता है. मेथिसिलिन प्रतिरोध की पहचान के लिए संवेदनशीलता के उपयुक्त (> 96%) स्तर के साथ तेजी से तकनीक 3-11 घंटे के बाद परिणाम का उत्पादन है, जो इस तरह के Vitek जीपीएस एसए कार्ड, रैपिड ATB Staph प्रणाली, और रैपिड Microscan पैनल सिस्टम के रूप में स्वचालित microdilution तकनीकों में शामिल 9-11. क्रिस्टल एमआरएसए आईडी सिस्टम एस के विकास की मान्यता पर आधारित एक तेजी से विधि है 2% NaCl और एक ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील प्रतिदीप्ति संवेदक के साथ प्रति लीटर oxacillin की 4 मिलीग्राम की उपस्थिति में ऑरियस. दावा संवेदनशीलता ऊष्मायन 12-14 के 4 घंटे के बाद 100-91% के बीच सीमा होती है. ये प्ररूपी तरीकों विषम प्रतिरोध व्यक्त कि प्रचलित उपभेदों के प्रभाव से उनके accuracies में सीमित कर रहे हैं. इसलिए, मेथिसिलिन प्रतिरोध की मान्यता के लिए सबसे अच्छा व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं तरीकों Meca जीन 15 से पीसीआर या डीएनए संकरण है. हालांकि इस तकनीक का शुद्ध डीएनए की आवश्यकता है और सेल मलबे 16 में शामिल हैं जो विभिन्न admixtures (दोष), के प्रति बेहद संवेदनशील है.

इसके अलावा, इन तकनीकों का प्रदर्शन करने के लिए एक लंबे समय की जरूरत है. Meca जीन उत्पाद, प्रोटीन PBP 2 ए, की पहचान करने के लिए रणनीति प्रतिरोध का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है और मानक परीक्षण तकनीक 17 की तुलना में अधिक विश्वसनीय हो सकता है.

1,2,18 होने के उन सहित स्ताफ्य्लोकोच्चुस उपभेदों के लिए एक मान्यता जांच के रूप में उपयोग किया जा सकता है कि दिखाया गया था. इस काम में हम इस तरह के वास्तविक समय में MRSA की रचना के साथ बैक्टीरिया की पहचान के रूप में MRSA के विशिष्ट पहचान और पता लगाने में एक उपन्यास तकनीक का प्रस्ताव रखा. इस विशेष उद्देश्य के एक एस के लिए प्रोटीन के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ संयुक्त सेनाओं के एक व्यापक स्पेक्ट्रम (MRSA उपभेदों सहित) के साथ ऑरियस जीवाणुभोजी (PBP 2 ए) का इस्तेमाल किया गया है. PBP 2a एक कोशिका दीवार प्रोटीन होता है और यह MRSA के एंटीबायोटिक प्रतिरोधकता के कारण है. हालांकि PBP 2a एंटीबॉडी एस के लिए विशिष्ट नहीं है कुछ अन्य बैक्टीरिया के बाद ऑरियस PBP 2a 19,20 को अनुक्रम समानता के साथ एंटीबायोटिक बंधनकारी प्रोटीन है. नतीजतन इस काम में, एस PBP 2a प्रोटीन के खिलाफ ऑरियस जीवाणुभोजी और एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया है. Specifi के लिए एक biosensor विकसित करने में सक्षम होना करने के लिएबड़ी सफाई एक दो कदम कार्रवाई उपयोग किया गया है के साथ एक डिवाइस का पता लगाने और मरसा पहचान. प्रारंभिक कदम के लिए एक एस इस्तेमाल किया एक संवेदक जांच के रूप में ऑरियस जीवाणुभोजी monolayer, दूसरे चरण PBP 2a विशिष्ट एंटीबॉडी कार्यरत है. इसलिए, एक एस पहचाना जाएगा कदम aureus जीवाणु, एक दूसरे के रूप में एंटीबायोटिक बाध्यकारी प्रोटीन के प्रति संवेदनशील होना होगा. दो कदम से प्राप्त संकेतों को सकारात्मक रहे हैं, यह मरसा की विशिष्ट पहचान को दर्शाता है.

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Protocol

1. मंच की स्थापना

  1. प्रकार तनाव एस प्राप्त करें ऑरियस ATCC 12600, एस ऑरियस ATCC 27690 और दण्डाणु subtilis ATCC 6051. एस के Methicillin प्रतिरोधी उपभेदों ऑरियस - MRSA1, मरसा 2, मरसा 5, मरसा 13, मरसा 26, मरसा 34, मरसा 45, बी anthracis Sterne, साल्मोनेला LT2, शिगेला flexneri, Yersinia enterocolotica, बदलनेवाला प्राणी मिराबिलिस, क्लेबसिएला निमोनिया 13,882; अपघट्य फेज 12600.
  2. PBP 2a एंटीबॉडी संयुग्मित लेटेक्स मोती प्राप्त करते हैं.
  3. 21 के रूप में वर्णित NZY मध्यम तैयार.
  4. फॉस्फेट प्राप्त नमकीन घोल (पीबीएस) buffered.
  5. Langmuir-Blodgett (पौंड) monolayer के बयान के लिए subphase रूप विआयनीकृत पानी तैयार.

2. जीवाणुभोजी प्रचार और अनुमापन

  1. एस के रातोंरात संस्कृति के 5 मिलीलीटर सेते फेज के 500 μl (3 के साथ ऑरियस ATCC 12600 (3.6 x 10 8 कॉलोनी गठन इकाइयों (CFU) / एमएल) 10 x 9 </ 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात प्रकार के बरतन-इनक्यूबेटर पर 2 एल flack में 500 मिलीलीटर NZY माध्यम में)> pfu / एमएल समर्थन.
  2. 4 में 10 मिनट के लिए 4424 XG पर संस्कृति अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
  3. 4 में 10 मिनट के लिए 11,325 XG पर पुनः centrifuged तैरनेवाला डिग्री सेल्सियस
  4. 0.22 सुक्ष्ममापी Millipore फिल्टर के माध्यम से फिल्टर तैरनेवाला.
  5. 1.5 घंटे के लिए 75,395 XG पर छानना अपकेंद्रित्र.
  6. आसुत जल के 100 μl में गोली भंग.
  7. NZY माध्यम में फेज निलंबन का 10 गुना dilutions तैयार करते हैं.
  8. एस के रातोंरात (पर) संस्कृति की प्लेट 1 मिलीलीटर सभी सतह कवर किया जाता है सुनिश्चित करने के लिए NZY अगर साथ 2 प्लेटों में से प्रत्येक पर ऑरियस ATCC 12600. संस्कृति का अतिरिक्त निकालें और 30 मिनट के लिए सतह सूखी हैं.
  9. थाली की सतह पर उचित फेज कमजोर पड़ने का एक नमूना (10 μl) हाजिर और 18-24 घंटे के लिए 37 ओ सी सेते हैं.
  10. सजीले टुकड़े के गठन की जांच करने और फेज अनुमापांक गणना. जीवाणुभोजी titers (टी) पी की संख्या के आधार पर अनुमान लगाया जाता हैlaques (एन) फेज निलंबन और कमजोर पड़ने कारक (एफ) के 10 μl मात्रा (v) के प्रति गठन. . टी = एन / (vxF) उदाहरण के लिए, कमजोर पड़ने 10 -7 में सजीले टुकड़े की संख्या 75 और मात्रा 10 μl (10 एक्स 10 -3 एमएल) के लिए, अनुमापांक 75 / बराबर है: अनुमापांक सूत्र द्वारा गणना की गई (10 एक्स 10 -3 एक्स 10 -7) = 7.5 एक्स 10 10 पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) प्रति मिलीलीटर निलंबन की.

3. सोना स्थिर फेज

  1. फिर 10 मिनट के लिए आर्गन में नक़्क़ाशी और प्लाज्मा द्वारा स्वच्छ सोने में लिपटे क्वार्ट्ज टुकड़े (60 मिमी 2) एक बाँझ कैबिनेट में पराबैंगनी प्रकाश के तहत 6 घंटे के लिए बाँझ.
  2. एक बाँझ पेट्री डिश में प्रत्येक टुकड़ा की सोने की सतह के लिए 1 एक्स 9 10 pfu / एमएल फेज निलंबन के 50 microliters जोड़ें, और फिर कमरे के तापमान पर एक नम कक्ष में रातोंरात सेते हैं.
  3. शेष फेज निलंबन निकालें और अनुमापांक.
  4. अनबाउंड दूर करने के लिए पीबीएस के साथ समयबद्ध फेज साथ टुकड़े 5 बार धोएंफेज.

4. एक सूखी सतह पर स्थिर फेज संक्रामकता का परीक्षण

  1. एक NZY अगर प्लेट पर एस. ऑरियस ATCC 12600 की एक हे / एन संस्कृति बिखरा हुआ है और सुखाने की अनुमति देते हैं.
  2. थाली चेहरे पर स्थिर फेज साथ एक सोने का टुकड़ा नीचे रखें.
  3. 37 में 12 घंटे ऊष्मायन के बाद सेल के एक क्षेत्र का निरीक्षण डिग्री सेल्सियस कि संक्रामकता को इंगित करता है.
  4. नियंत्रण प्रयोगों में कोई फेज साथ सोने के कवर के टुकड़े का उपयोग करें.

5. तरल में नि: शुल्क और बाध्य फेज की lytic गतिविधि का परीक्षण

  1. एस के एक पर संस्कृति जोड़ें चार 300 मिलीलीटर sidearm बोतल के हर (6 एक्स 10 6 / CFU प्रत्येक कुप्पी में एमएल) में NZY की ऑरियस ATCC 12600-10 मिली.
  2. दो बोतल 2 एक्स 10 6 pfu / मुक्त फेज की मिलीलीटर में जोड़ें.
  3. नियंत्रण के रूप में अन्य दो बोतल का उपयोग करें.
  4. एस के समय के पाठ्यक्रम पर नजर रखने के सभी बोतल के लिए 30 मिनट के अंतराल पर ऑप्टिकल घनत्व माप (आयुध डिपो 600) ने 570 मिनट के लिए ऑरियस सेल.
  5. 24 घंटे में एक अंतिम माप ले लो.
  6. कदम 5.1-5.5 दोहराएँ, लेकिन नियंत्रण बोतल में कोई फेज साथ सोना बाध्य फगेस के बजाय स्वतंत्र फगेस साथ टुकड़े, और सोने के टुकड़े का उपयोग करें.

6. ऊष्मायन के दौरान बाध्य phages की हानि

  1. कमरे के तापमान पर रातोंरात एक नम कक्ष में रखा गया है कि एक पेट्री डिश में बाँझ सोने के टुकड़े की सतह पर 1 एक्स 9 10 pfu / एमएल फेज के 50 μl जोड़ें.
  2. सोने की सतह और अनुमापांक से अनबाउंड फेज साथ निलंबन निकालें.
  3. 8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से कम 5 पीबीएस के साथ समय और जगह प्रकार के बरतन-इनक्यूबेटर में 15 मिलीलीटर ट्यूब में 1 मिलीलीटर NZY समाधान में ही फेज साथ सोने का टुकड़ा धो लें.
  4. 2 में वर्णित के रूप में अलग फेज की अनुमापांक निर्धारित करते हैं.

7. फेज Spheroids तैयारी

  1. 1 मिलीग्राम शीशी में spectrophotometric ग्रेड क्लोरोफॉर्म के एक बराबर मात्रा के साथ शेयर फेज 12600 निलंबन (10 11 pfu / एमएल) के 400 μl का मेलकमरे के तापमान पर.
  2. धीरे भंवर 5-6 बार (5 सेकंड के अंतराल) एक मिनट की अवधि से अधिक फेज के क्लोरोफॉर्म निलंबन.
  3. 30 सेकंड के लिए स्थिर और फिर spheroids monolayer की तैयारी के लिए बंद pipetted था जिसमें शीर्ष चरण की विंदुक निलंबन की अनुमति दी.
  4. पारेषण और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए spheroids निलंबन की कुछ microliters लो.
  5. Biosensor के निर्माण के लिए एक शेष अंडाकार आकृति निलंबन का प्रयोग करें.

8. Biosensor तैयारी

  1. 10 मिनट पीडीसी-32G Harrick प्लाज्मा क्लीनर के लिए आर्गन में नक़्क़ाशी प्लाज्मा से साफ QCM डी सेंसर.
  2. किसी भी कार्बनिक अशुद्धियों को दूर करने के लिए हेक्सेन के साथ सेंसर कुल्ला.
  3. तैयार है और के रूप में 22 में वर्णित फिल्म संतुलन की गर्त को साफ.
  4. एक subphase समाधान के साथ लेग गर्त भरें और एक गर्त बाधा के साथ यह साफ है और 20 पर गर्त स्थिर ± 0.1 डिग्री सेल्सियस
  5. जलीय suspensi में फेज 12600 के 300 μl विभाज्य बिखरालेग subphase पर (10 11 pfu / एमएल) पर.
  6. आंशिक रूप से subphase 22,23 में पानी में डुबोया जाता है कि एक झुका wettable गिलास छड़ी नीचे चलाने के लिए फेज 12600 जलीय निलंबन के 300 μl विभाज्य (10 11 pfu / एमएल) की अनुमति देकर लेग subphase समाधान पर फेज monolayer की तैयारी.
  7. 10 मिनट के लिए तैयार monolayer स्थिर, और उसके बाद एक लगातार दबाव तक 19 एन / मीटर उपलब्ध हो जाता है, 30 मिमी / मिनट (45 सेमी 2 / मिनट) की दर से यह सेक.
  8. क्रमिक monolayer के सात बार सेंसर में सूई और बाहर से 4.5 मिमी / मिनट की दर पर सीधा तैनात QCM डी संवेदक पर एक ऊर्ध्वाधर फिल्म बयान निष्पादित करें. बैक्टीरिया के नमूने लिए जोखिम परतों (नहीं दिखाया डेटा), सतत सजातीय, और एक समान थे पता चला है कि पहले के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी फेज monolayers जमा.
  9. दोहराएँ 3 में तैयार किया जाता है कि एक फेज अंडाकार आकृति निलंबन के साथ 4.5-4.8 कदम.
  10. मरसा का पता लगाने, इलेक्ट्रॉन के लिए गढ़े फेज biosensors के प्रयोगमाइक्रोस्कोपी, और ellipsometry.

9. Biosensor परीक्षण, Methicillin प्रतिरोधी के भेदभाव और संवेदनशील Staphylococcus बैक्टीरिया

  1. इस प्रोटोकॉल में, असंशोधित और संशोधित फेज और फेज spheroids साथ biosensors के लिए तैयार हैं. चार सेंसर प्रवाह कक्षों के साथ एक क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance QCM सेंसर सतह पर स्थिर फेज को बैक्टीरिया के बंधन नजर रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. PBP 2a एंटीबॉडी संयुग्मित लेटेक्स मोती Methicillin प्रतिरोधी (मरसा) और संवेदनशील Staphylococcus बैक्टीरिया के बीच विभेद करने के लिए उपयोग किया जाता है. सभी मापन 5 मेगाहर्ट्ज पर प्रवाह मोड (50 μl / मिनट) में आयोजित की जाती हैं.
  2. पानी (~ 30 मिनट) में QCM सेंसर का एक आधार रेखा अनुनाद आवृत्ति की स्थापना.
  3. परीक्षा कक्ष के माध्यम से पानी में रहते मेथिसिलिन संवेदनशील Staphylococcus बैक्टीरिया कोशिकाओं (9 10 CFU / एमएल) की एक निलंबन ड्रा.
  4. लगातार पहले जगा है, उसी के लिए सेंसर अनुनाद आवृत्ति और ऊर्जा अपव्यय में परिवर्तन की निगरानीएनजी क्यू शीतल सॉफ्टवेयर.
  5. सेंसर अनुनाद आवृत्ति और अपव्यय में परिवर्तन संतृप्ति स्तर पर पहुंच गया, आवृत्ति और अपव्यय की सतत निगरानी के दौरान प्रवाह को PBP एंटीबॉडी संयुग्मित लेटेक्स मोती (6.77 x10 10 मोती / एमएल) के निलंबन जोड़ें.
  6. दोहराएँ Methicillin प्रतिरोधी Staphylococcus बैक्टीरिया कोशिकाओं (मरसा) के लिए 9.2-9.5 कदम.
  7. सी निरंतर (सी = 17.7 एनजी एक्स सेमी -2 एक्स हर्ट्ज -1 में 5 मेगाहर्ट्ज जन संवेदनशीलता है जहां Sauerbrey समीकरण 24,25 Δf =-Δm xn / सी, से बाध्यकारी बैक्टीरिया की वजह से बड़े पैमाने पर परिवर्तन के माध्यम से एक आवृत्ति परिवर्तन को परिभाषित करें ), मीटर द्रव्यमान है और n overtone संख्या (एन = 1) है.
  8. रिकॉर्डिंग से एक ऊर्जा अपव्यय परिवर्तन (Δ डी) परिभाषित दोलन की घातीय क्षय (आवृत्ति और आयाम दोलन की एक अवधि के दौरान व्यस्त और संग्रहित ऊर्जा की मात्रा का ठहराव की अनुमति दी है, जो dampening,क्रमशः, ई व्यस्त और ई संग्रहित: Δ डी ई = व्यस्त / 2 πE संग्रहीत. Δ डी अपव्यय इकाइयों (डीयू), एक ड्यू = 10 -6 रिश्तेदार इकाइयों) में मापा जाता है.

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Representative Results

फेज एस के सभी परीक्षण किया उपभेदों के खिलाफ अपघट्य गतिविधि का प्रदर्शन के रूप में फेज मौके परीक्षण ने संकेत दिया MRSA उपभेदों, सहित ऑरियस,. फलक आकार आम तौर पर 5 से 15 मिमी से लेकर. गतिविधि अन्य परीक्षण संस्कृतियों (1 टेबल) के खिलाफ नहीं मिला.

एस का एक सामान्य वृद्धि 37 प्रकार के बरतन-इनक्यूबेटर पर NZY माध्यम में ऑरियस ATCC 12600 डिग्री सेल्सियस चित्रा 1 ए (खाली हलकों द्वारा लेबल एक वक्र) में दिखाया गया है. जीवाणुओं की संख्या 4.0 से 6 x 10 3.2 से बढ़ाकर 10 x 8 CFU / एमएल. चित्रा 1 ए (भरा हलकों द्वारा लेबल एक वक्र) 2.0 एक्स 10 के सह खेती के परिणामों से पता चलता है 6 pfu / मिलीलीटर मुक्त फेज एक साथ के साथ जोड़ा एस का एक ही एकाग्रता ऑरियस ATCC 12600. सोने की सतह पर स्थिर फेज, निलंबन में फेज की गतिविधि (चित्रा 1 ए, ऊपर नीचे त्रिकोण द्वारा लेबल की अवस्था के साथ तुलनीय अपघट्य गतिविधि का प्रदर्शन). फेज साथ सोने का टुकड़ा पहला प्रयोग बढ़ रहा 24 घंटे में इस्तेमाल किया गया था जब immobilized फेज संक्रामक बने रहे, तो यह 4 में 6 दिनों के लिए 5 बार धोया और पीबीएस में संग्रहीत किया गया डिग्री सेल्सियस, और अंत में एक ताजा जीवाणु निलंबन के साथ पुन: उपयोग. (चित्रा 1 ए, ऊपर त्रिकोण द्वारा चिह्नित वक्र). यह स्थिर फगेस नए बैक्टीरिया को संक्रमित करने के काबिल नहीं हैं जो शून्य capsids है, छोड़ने के बैक्टीरिया में उनके डीएनए इंजेक्षन कि लगता है. हम एक सोने की सतह पर स्थिर फगेस बारी में उन नए बैक्टीरिया और इतने पर संक्रमित मुक्त फगेस उत्पन्न जो कुछ बैक्टीरिया को संक्रमित करने के लिए प्राथमिक "catalyzers" के रूप में सेवा की परिकल्पना है कि. इसलिए, स्थिर फगेस की सबसे शायद एक पहले 24 घंटे से बढ़ प्रयोग में इस्तेमाल नहीं किया गया है और इसलिए, एक दूसरी बार उपयोग किया जा सकता है. शारीरिक सोखना द्वारा जमा फगेस की सतह घनत्व के बारे में ~ 0.7 फेज कण / 2 सुक्ष्ममापी था. यह एकाग्रता उच्च है, लेकिन यह 10 गुना 2 तक बढ़ सकता है. इसलिए, सोने की थाली है शामिल कर सकतापहले 24 घंटे से बढ़ प्रयोग में संक्रमित जीवाणुओं द्वारा जारी की स्वतंत्र रूप से व्यवहार्य फगेस की ome.

चित्रा 1 बी स्थिर फगेस बैक्टीरियल कोशिकाओं lysing करने में सक्षम थे, यह दर्शाता है कि सोने के टुकड़े चारों ओर सेल क्षेत्र से पता चलता है. नियंत्रण प्रयोगों में, खाली सोने की थाली बैक्टीरियल विकास को बाधित नहीं किया. इसलिए बैक्टीरिया और स्थिर फेज के सह संस्कृति में पाया बैक्टीरिया विकास के प्रभावी कमी पानी निलंबित बैक्टीरिया और चित्रा -1 सी के रूप में दिखाया बाध्य फेज की प्राथमिक बातचीत का एक परिणाम है. बाध्य फेज और बैक्टीरिया के सह ऊष्मायन के दौरान सोने की सतह से फेज टुकड़ी छोटा था. ऊष्मायन के दौरान सोने की सतह से अलग थे कितने फगेस अनुमान लगाने के लिए आदेश में, बाध्य फेज साथ नमूने 8 घंटे के लिए 37 प्रकार के बरतन-इनक्यूबेटर में हिल NZY समाधान, डिग्री सेल्सियस में डूब गया, और सतह पर तैरनेवाला में एक नि: शुल्क फेज एकाग्रता मूल्यांकन किया गया था. हम 4.1 एक्स 10 7 pfu boun थे कि निर्धारितकेवल 3 एक्स 10 4 pfu अलग थे जब एक 60 मिमी 2 सोने का टुकड़ा (~ 0.7 फेज कण / माइक्रोन 2), (0.007% टुकड़ी) को घ.

पारेषण और सोने सब्सट्रेट सतह पर बरकरार अपघट्य फेज 12600 की इलेक्ट्रॉन micrographs स्कैनिंग आंकड़े 2A और 2 बी में दिखाया गया है. फेज निलंबन उपचार क्लोरोफॉर्म के अधीन किया गया था, फेज भौतिक स्वरूप बदल गया था. पूंछ की लंबाई में अनुबंधित किया है और thickened. बहुभुज सिर (आंकड़े 2 डी और 2 ई) गोल बन गया. हम filamentous फेज 26 का इलाज क्लोरोफॉर्म के नाम करने के लिए "अंडाकार आकृति" संरचनात्मक रूप से संशोधित अपघट्य फेज समान करार दिया. क्लोरोफॉर्म उपचार से हुई महत्वपूर्ण संरचनात्मक परिवर्तनों के बावजूद, पट्टिका संख्या से मापा अंडाकार आकृति अपघट्य गतिविधि (आंकड़े -2 सी और 2 एफ) नहीं बदला है. फेज और spheroids का मतलब अपघट्य गतिविधि थे (7.4 ± 1.5 (एसडी)) 10 x 10 (एन = 4) और (7.5 ± 1.0 (एसडी)) 10 x 10 (एन = 7), pfu / एमएल. 0.05 के स्तर पर, फेज और spheroids की गतिविधियों (चित्रा -2 और 2 एफ) काफी अलग नहीं थे.

वे मरसा (चित्रा 3) के संपर्क में थे जब स्थिर अपघट्य फगेस साथ QCM सेंसर अनुनाद आवृत्ति या ऊर्जा के अपव्यय में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाया. इन आंकड़ों मरसा / फेज बातचीत QCM के अनुसार एक बड़े पैमाने पर परिवर्तन नहीं है कि परिणाम से संकेत मिलता है, और अभी तक पोस्ट assayed biosensors के इलेक्ट्रॉन micrographs सेंसर सतह (3B चित्रा) में महत्वपूर्ण बैक्टीरियल बंधन का पता चला.

मरसा निलंबन फेज अंडाकार आकृति, biosensors आवृत्ति में पर्याप्त कमी के साथ प्रवाह सेल में इंजेक्शन थे जब (Δ च ≈ -105 हर्ट्ज) और अपव्यय में वृद्धि (ΔD ≈ 26 ड्यू) मनाया गया (चित्रा -3 सी). फेज अंडाकार आकृति बैक्टीरियल (मरसा) बाध्यकारी बातचीत के बाद से assayednsors PBP2a एंटीबॉडी संयुग्मित लेटेक्स मोती निलंबन से अवगत कराया गया. ये मरसा biosensors आवृत्ति में एक और कमी के बाद से, PBP2a एंटीबॉडी संयुग्मित लेटेक्स मोती निलंबन के लिए प्रतिक्रिया (Δ च ≈ -45 हर्ट्ज) और अपव्यय में वृद्धि (ΔD ≈ 15 ड्यू) मनाया गया (चित्रा -3 सी) assayed. जांच और PBP2a एंटीबॉडी संयुग्मित लेटेक्स मोती फेज के लिए MRSA के बंधन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जांच (चित्रा 3 डी) का उपयोग करने की पुष्टि की थी.

फेज अंडाकार आकृति biosensor MSSA निलंबन, आवृत्ति में काफी कमी से अवगत कराया गया था, जब (Δ च ≈ -200 हर्ट्ज) और अपव्यय में वृद्धि (ΔD ≈ 55 ड्यू) मनाया गया (चित्रा 3E). फेज अंडाकार आकृति-MSSA बाध्यकारी बातचीत के बाद, assayed सेंसर PBP2a एंटीबॉडी संयुग्मित लेटेक्स मोती निलंबन के साथ चुनौती दी थी. प्रारंभ में, MSSA assayed biosensor का कम यात्रियों से पता चलाआवृत्ति में वृद्धि और अपव्यय में कमी. MSSA और PBP2a एंटीबॉडी संयुग्मित लेटेक्स मोती बातचीत के कुछ ही मिनटों के बाद, आवृत्ति PBP2a एंटीबॉडी परिचय स्तरों पोस्ट करने के लिए लौट आए, लेकिन क्षणिक ऊर्जा (चित्रा 3E) की वृद्धि हुई. फेज जांच करने MSSA के बंधन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के साथ की पुष्टि की, लेकिन MSSA और PBP2a एंटीबॉडी संयुग्मित लेटेक्स मोती (चित्रा 3F) मनाया गया के बीच कोई बाध्यकारी था. Ellipsometric मोटाई प्रोफाइल, अपघट्य फगेस और Staphylococcus बैक्टीरिया की 3 डी मोटाई नक्शा S1 और S2 पूरक आंकड़े में दिखाया गया.

10 9 कोशिकाओं / मरसा या MSSA की मिलीलीटर के निलंबन को लेग स्थिर फगेस या spheroids साथ सेंसर के संपर्क के बाद, बैक्टीरिया, 9.1 10 x 7 (मरसा / बरकरार फगेस) का घनत्व (ρ) पर फगेस या spheroids बाध्य करने के लिए मनाया गया 7.9 10 x 7 (मरसा / spheroids), और 7.2 एक्स 10 7 (MSSA / spheroids) कोशिकाओं / 2 सेमी. में5 अलग अपघट्य फगेस और 2 मेजबान बैक्टीरिया 27 का उपयोग कर परीक्षण, शोधकर्ताओं ने 10 9 कोशिकाओं / एमएल बैक्टीरिया को सहसंयोजक बंधन विधि द्वारा immobilized फगेस अधीन, और (2.5-8.9) x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी की एक श्रृंखला में फेज कब्जा दक्षता निर्धारित . इस काम में प्रस्तुत फेज कब्जा दक्षता ~ 100 गुना ज्यादा है.

मेजबान तनाव तनाव विवरण मेथिसिलिन संवेदनशीलता फेज संवेदनशीलता
एस aureus 12600 ATCC एस +
एस aureus 27690 ATCC एस +
एस aureus 10292 आइए एस +
10378 आइए एस +
एस aureus 10497 आइए एस +
एस aureus 10686 आइए एस +
एस aureus मरसा 1 ए.यू. आर +
S.aureus मरसा 2 ए.यू. आर +
एस aureus मरसा 5 ए.यू. आर +
एस aureus मरसा 13 ए.यू. आर +
S.aureus मरसा 26 ए.यू. आर +
एस aureus मरसा 34 ए.यू. आर +
एस aureus एमआरएसए 45 ए.यू. आर +
बी anthracis Sterne ए.यू. एनए -
साल्मोनेला LT2 ए.यू. एनए -
शिगेला flexneri अज्ञात ए.यू. एनए -
Yersinia enterocolitica अज्ञात ए.यू. एनए -
बदलनेवाला प्राणी मिराबिलिस अज्ञात ए.यू. एनए -
क्लेबसिएला निमोनिया 13882 ए.यू. एनए -
बेसिलस subtilis 6051 ATCC एनए -

तालिका 1. बैक्टीरियल एस के फेज 12600 संवेदनशीलताट्रेनों आइए - जानवरों से अलग;. ए.यू. - Auburn विश्वविद्यालय के जीवाणु संस्कृति संग्रह, एनए - लागू नहीं, एक - फेज की अपघट्य गतिविधि संवेदनशील सजीले टुकड़े के गठन, +, द्वारा परिभाषित किया गया था - संवेदनशील नहीं. परीक्षण उपभेदों के ओवरनाइट संस्कृतियों NZY अगर साथ प्लेटों पर चढ़ाया गया. सतह सूख जाने के बाद, 10 11 pfu फेज निलंबन का एक नमूना (10 μl) थाली की सतह पर देखा गया था. प्लेट्स 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे. फगेस के lytic गतिविधि सजीले टुकड़े के गठन के द्वारा खोजा गया था.

चित्रा 1
चित्रा 1. समयबद्ध और मुक्त फेज के संक्रामक गुण. मुक्त फेज के ए बैक्टीरियल अभाव में विकास (खाली हलकों) और उपस्थिति (भरा हलकों), फेज की उपस्थिति में (टीआर ऊपर सोने की सतह के लिए बाध्यiangles), और 4 से कम 6 घंटे के बाद सोने की सतह के लिए बाध्य फेज की उपस्थिति में डिग्री सेल्सियस (त्रिकोण नीचे ऊपर). सम्मिलित: लाइन (1) समीकरण (4) (नि. = -0.99, पी <0.0001) को फेज विकास प्रयोगात्मक डेटा नहीं की एक रेखीय फिट से पता चलता है. लाइन (2) एक ही समीकरण के लिए स्वतंत्र फेज उपस्थिति में बैक्टीरियल वृद्धि की प्रयोगात्मक डेटा की एक फिट से पता चलता है. मुक्त फेज की अनुपस्थिति और उपस्थिति में बैक्टीरियल वृद्धि निरंतर (कश्मीर), बराबर 0.88 और 0.64, (-0.048, गिरावट चरण) हैं. तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि डेटा एक मतलब सापेक्ष त्रुटि 600 आयुध डिपो माप 5% से अधिक नहीं था पैनल ए में दिखाया जाता है. बी फेज सोने की सतह को स्थिर सोने के टुकड़े चारों ओर सेल क्षेत्र से संकेत के रूप में संक्रामक है. 1 - टुकड़ा बैक्टीरिया के साथ अगर प्लेट, 2 - स्थिर फेज साथ सोने का टुकड़ा;. 3 - सोने के टुकड़े आसपास निषेध क्षेत्र सोने की सतह से जुड़ी फेज द्वारा जीवाणु सेल के सी. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. 1 -सोने में लिपटे क्वार्ट्ज टुकड़ा, 2 - फेज सोने की सतह, 3 के लिए बाध्य - बाउंड फगेस, 4 द्वारा लंगर जीवाणु - मुक्त फगेस संक्रमित जीवाणु फोड़ द्वारा जारी की है. से अनुमति के साथ प्रयोग किया है: Guntupalli, आर, एट अल 2012.. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. बरकरार है और संशोधित फेज के गुण ए और बी - पारेषण और क्रमशः बरकरार फेज की इलेक्ट्रॉन micrographs, स्कैनिंग,.. सी - मरसा डी और ई के साथ एक अगर प्लेट पर फेज अपघट्य गतिविधि - पारेषण और क्रमशः बरकरार फेज spheroids, की इलेक्ट्रॉन micrographs स्कैनिंग; एफ - फेज spheroids एक अपघट्यमरसा के साथ एक अगर प्लेट पर ctivity. फेज और spheroids का मतलब गतिविधि कर रहे हैं (7.4 ± 1.5 (एसडी)) 10 x 10 (एन = 4) और (7.5 ± 1.0 (एसडी)) 10 x 10 (एन = 7) pfu / एमएल. टी परीक्षण: टी = 0.15682, पी = 0.87851. 0.05 के स्तर पर, फेज और spheroids की गतिविधियों में काफी अलग नहीं हैं. बार्स: ए, बी, डी, और ई: 200 एनएम. से अनुमति के साथ प्रयोग किया है:. Guntupalli, आर, एट अल 2012.

चित्रा 3


चित्रा 3. QCM डी और फेज बैक्टीरिया बातचीत के EM विश्लेषण संयुक्त. जीवाणु 50 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर 10 9 / CFU पानी में मिलीलीटर निलंबन की एकाग्रता पर सेंसर करने के लिए दिया गया. 1, 2, क्रमशः अनुनाद आवृत्ति और ऊर्जा अपव्यय में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं. MRSA के लिए ए फेज लेपित QCM डी सेंसर प्रतिक्रिया. तीर टी से पता चलता हैवह सेंसर सतह को मरसा प्रसव के समय. पोस्ट के बी स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ मरसा QCM सेंसर पर स्थिर अपघट्य फेज के लिए बाध्य assayed. फेज spheroids के एम मरसा, संवेदक सतह पर पी फगेस. सी. लगातार प्रतिक्रियाओं एंटीबॉडी मोती PBP तक तो मरसा पहले और के लिए लेपित QCM डी सेंसर. तीर क्रमशः, MRSA और सेंसर सतह को PBP एंटीबॉडी प्रसव के समय का संकेत मिलता है. पोस्ट के डी स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ फेज spheroids, मरसा, और PBP एंटीबॉडी मोतियों के साथ biosensor assayed. मोटी और पतली तीर क्रमशः ठेठ मरसा सेल और एंटीबॉडी मनका, पता चलता है. फेज spheroids की ई. लगातार प्रतिक्रियाओं एस के लिए लेपित QCM डी सेंसर एंटीबॉडी मोती PBP तक तो ऑरियस पहले और. तीर एस का संकेत पोस्ट के क्रमश सेंसर सतह को aureus और PBP एंटीबॉडी प्रसव के समय,. एफ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ फेज spheroids, एस के साथ biosensor assayed ऑरियस, और एंटीबॉडी मोती PBP. मोटी और पतली तीर ठेठ एस से पता चलता है ऑरियस सेल और एंटीबॉडी मनका, क्रमशः. से अनुमति के साथ प्रयोग किया है: Guntupalli, आर, एट अल 2012.. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

पूरक आंकड़े

चित्रा S1
चित्रा S1. पूरक चित्रा 1. (क) और (ख) एक ellipsometric मोटाई प्रोफाइल और क्रमशः एक अपघट्य फेज की 3 डी मोटाई नक्शा, (प्रभावी अपवर्तनांक = 1.05) हैं. मोटाई प्रोफाइल के monolayer के मतलब, आरएमएस खुरदरापन, न्यूनतम और अधिकतम मोटाई दिखा. मोटाई नक्शे में एक लाइन मोटाई प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए तैयार किया गया था.

50474/50474figs2.jpg "/>
S2 है चित्रा. पूरक चित्रा 2.

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Discussion

यह अच्छी तरह से फगेस बैक्टीरियल रोगज़नक़ों 28 के लिए biosensor जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि जाना जाता है. तेजी से भेदभाव एंटीबायोटिक प्रतिरोधी और संवेदनशील उपभेदों: यह PBP 2a एंटीबॉडी के साथ एक साथ फेज पुरानी समस्या को हल करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि इस काम में प्रदर्शन किया है.

हालांकि यह उन सामान्य असंशोधित staphylococcal फगेस वे बैक्टीरिया बाँध, भले ही QCM उपकरणों के साथ बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए उपयुक्त नहीं हो पाया था. फेज पूंछ ध्वनिक लहरों फेज पूंछ के अंत करने के लिए बाध्य बैक्टीरिया "पहुंच" नहीं किया जा सकता है कि इतने लंबे समय है. इस हालत (आंकड़े 3 ए और 3 बी) EM द्वारा छवियों से पता चला महत्वपूर्ण बंधन के बावजूद अनुनाद आवृत्ति और अपव्यय परिवर्तन रजिस्टर करने के लिए एक "लापता जन" प्रभाव 29 और अक्षमता में हुई. इस समस्या को आसानी से spheroids साथ बरकरार फेज की जगह द्वारा हल किया गया था, फेज क्लोरोफॉर्म जल उपचार द्वारा संशोधित. इस इलाज पूरी तरह कार्यात्मक पी में हुई, छोटी मोटी और गैर लचीला पूंछ (आंकड़े, 2 डी 2 ई, और 2 एफ) के साथ हेग. फगेस biosensors में spheroids के साथ बदल रहे थे, मरसा आसानी QCM डी डिवाइस से पता चला रहे थे.

फेज कणों एक उचित उन्मुखीकरण पर सोने की सतहों के लिए बाध्य कर रहे थे, उनके रिसेप्टर्स मेजबान बैक्टीरिया को सुलभ थे. फगेस के साथ एक ठोस सतह और एक सूखे बैक्टीरियल परत के बीच प्रत्यक्ष शारीरिक संपर्क होते हैं, स्थिर फगेस मेजबान बैक्टीरिया (चित्रा 1C) में वायरल जीनोम इंजेक्शन लगाने में सक्षम हैं. इन परिणामों के एक सहसंयोजक बंधन तकनीक 27 से कांच डिस्क सतहों को स्थिर अपघट्य फगेस साथ प्राप्त उन लोगों के साथ अच्छी तरह से सहमत हैं. मेजबान बैक्टीरिया कब्जा करने के लिए बाध्य अपघट्य फगेस की क्षमता भी एक biotinylated फेज स्थिरीकरण तकनीक 30 का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया. इसके विपरीत, ठोस सतहों को ठीक से उन्मुख फगेस संलग्न करने के लिए एक बहुत ही सरल शारीरिक सोखना विधि 31 उपयोग किया गया है. टीवह उच्च फेज अंडाकार आकृति कब्जा दक्षता प्रभावी रोगाणुरोधी सतहों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कुल समय से जवाब देने के लिए प्रस्तावित परख के लिए नमूना प्रति के बारे में 16 मिनट है. इस समय नाटकीय रूप से कक्षों की एक बड़ी संख्या के साथ QCM उपकरणों का उपयोग करके छोटा किया जा सकता है. फेज सेंसर के लिए प्रत्याशित शेल्फ जीवन कमरे के तापमान पर 3-4 महीने के बारे में है. एक biopolymer के संरक्षण के साथ यह एक कुछ साल 32 से ऊपर लम्बा किया जा सकता है. एस की सीमा का पता लगाने ऑरियस एक सतह plasmon अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा इस फेज के लिए मापा, और 10 4 CFU / एमएल 18 हो पाया था.

इस आलेख में वर्णित तरीकों का उपयोग करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण शर्तों में से एक स्वच्छ और बाँझ शर्तों फगेस और बैक्टीरिया के साथ सभी प्रयोगों के लिए 33 आवश्यकताओं का अनुपालन करने के लिए है.

आमतौर पर इस्तेमाल ऐसी डिस्क प्रसार oxacillin अगर स्क्रीन टेस्ट के रूप में मरसा का पता लगाने के तरीकों, या शोरबा microdilution नॉरमा लेlly अप करने के लिए 24 घंटे का परीक्षण बाहर ले जाने के लिए. ऐसे Vitek जीपीएस एसए कार्ड, रैपिड ATB Staph प्रणाली, रैपिड Microscan पैनल सिस्टम, और क्रिस्टल मरसा आईडी सिस्टम के रूप में स्वचालित तकनीक भी शामिल है कि रैपिड तकनीक भी 3-11 घंटे 9-14 के बाद परिणाम का उत्पादन. Meca जीन 15 से पीसीआर या डीएनए संकरण एक अपेक्षाकृत तेजी से और सही तरीका है, लेकिन शुद्ध डीएनए की आवश्यकता है और बेहद संवेदनशील दोष है. इसके विपरीत, इस काम में वर्णित विधि, तेजी से डीएनए निष्कर्षण की जरूरत नहीं है, और यह admixtures के प्रति संवेदनशील नहीं है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस के साथ साथ काम की रिपोर्ट कपिश विश्वविद्यालय AUDFS और यूएसएएफ CRADA 07-277-60MDG -01 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. इस लेख में व्यक्त विचार लेखक के हैं, और सरकारी नीति या संयुक्त राज्य वायु सेना, रक्षा विभाग, या अमेरिकी सरकार की स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं करते.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

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References

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