Summary
Time-lapse microscopía de marcadores autofagia marcados con fluorescencia permite la monitorización de la respuesta de la autofagia dinámico con alta resolución temporal. Usando la autofagia específico y los marcadores de orgánulos en una combinación de 3 colores diferentes, podemos seguir la aportación de una proteína a la formación autophagosome en un contexto espacial y temporal robusto.
Abstract
La autofagia es una respuesta celular provocada por la falta de nutrientes, especialmente la ausencia de aminoácidos. La autofagia se define por la formación de estructuras de doble membrana, llamada autofagosomas, que secuestran citoplasma, proteínas de larga duración y los agregados de proteínas, orgánulos defectuosos, e incluso virus o bacterias. Autofagosomas finalmente se fusionan con los lisosomas que conducen a la degradación mayor parte de su contenido, con los nutrientes producidos se reciclan de nuevo al citoplasma. Por lo tanto, la autofagia es fundamental para la homeostasis celular y la desregulación de la autofagia puede conducir a la enfermedad, sobre todo la neurodegeneración, el envejecimiento y el cáncer.
Formación autophagosome es un proceso muy elaborado, para el cual las células han asignado un grupo específico de proteínas, llamada la maquinaria autofagia núcleo. La maquinaria de la autofagia núcleo está funcionalmente complementa con proteínas adicionales que intervienen en diversos procesos celulares, por ejemplo, en membranel tráfico de correo, en la biología mitocondrial y lisosomal. La coordinación de estas proteínas para la formación y la degradación de autofagosomas constituye la respuesta altamente dinámica y sofisticada de la autofagia. Imágenes de células vivas permite seguir la contribución molecular de cada proteína relacionada con la autofagia hasta el nivel de un solo evento de formación autofagosoma y en tiempo real, por lo tanto, esta técnica ofrece una alta resolución temporal y espacial.
Aquí se utiliza una línea celular estable expresando GFP-DFCP1, para establecer un contexto espacial y temporal para nuestro análisis. DFCP1 marcas omegasomes, que son estructuras precursoras conducen a la formación autofagosomas. Una proteína de interés (POI) puede ser marcado con una etiqueta de color rojo o cian fluorescente. Los diferentes orgánulos, como el ER, las mitocondrias y los lisosomas, están todos involucrados en diferentes etapas de formación de autofagosoma, y pueden ser marcados utilizando un rastreador tinte específico. Time-lapse microscopía de autophagy en este montaje experimental, permite que la información se extrae de la cuarta dimensión, es decir, tiempo. Por lo tanto podemos seguir la contribución del POI de la autofagia en el espacio y el tiempo.
Introduction
La autofagia es un proceso muy dinámico, que requiere la coordinación de un gran número de proteínas para el resultado final de la formación autophagosome 1-3. Microscopía es probablemente la técnica más comúnmente aplicada para el estudio de la autofagia 4. La localización de la mayoría de las proteínas de la autofagia ha sido ampliamente estudiado en células fijadas, tanto por inmuno-tinción de las proteínas endógenas y por la expresión de la proteína exógena marcado con fluorescencia. Además, la microscopía electrónica (EM), solo y en combinación con el etiquetado inmuno-oro, ha descrito los detalles finos de estas estructuras 5,6. A pesar del hecho de que estas técnicas han establecido nuestra comprensión de la formación autofagosoma en las 3 dimensiones del espacio, que no han logrado proporcionar suficiente cantidad de información acerca de la 4 ª dimensión - tiempo. Imágenes de células en vivo supera esta barrera ya que permite después de la formación de un autofagosoma tan cerca como seable a tiempo real 7. Esta técnica se utilizó primero para estudiar la autofagia por Yoshimori y colegas 8, y se ha utilizado cada vez más en adelante.
Microscopía de lapso de tiempo captura la localización del punto de interés en células vivas y durante un período de tiempo. Al comparar esta información con la autofagia bien caracterizado y / u orgánulo marcador, el análisis de imágenes de células vivas puede poner el punto de interés en el mayor contexto espacial y temporal de la formación autophagosome. Análisis de imágenes de células vivas se basa en la captura repetitiva de la localización a lo largo de PDI todos los pasos de la formación de autofagosoma, mientras que las imágenes de células fijadas se basa en una sola captura. Por lo tanto, imágenes de células vivas puede demostrar la contribución de los POI a los pasos específicos de formación autophagosome, mientras que las imágenes de las células fijas sólo puede asumir la función de punto de interés, en base a su localización media en muchos autofagosomas capturados simultáneamente en diferentes etapas de su lifecycle.
A pesar de imágenes de células vivas es un método de alta capacidad analítica, tiene algunas limitaciones inherentes que deben ser tomados en consideración. En primer lugar, imágenes de células vivas requiere la expresión de una o más proteínas exógenos marcados con fluorescencia. Etiquetas fluorescentes tienden a ser grandes en tamaño y que a veces puede alterar el comportamiento de una proteína debido a razones estéricas. Esta situación se ve acentuada por las proteínas de membrana, ya que necesitan para funcionar en el espacio limitado de las 2 dimensiones de las membranas. De nota, autofagosomas son estructuras membranosas, y en consecuencia su formación requiere un gran número de proteínas asociadas a la membrana.
Otro conjunto de problemas está conectado a los niveles de expresión de la PDI. En principio, una proteína exógena debe ser expresada a niveles comparables a la proteína endógena. Esto asegura que los reguladores importantes de su localización sub-celular no estarán saturados, y thanálisis e será biológicamente relevante. Por otra parte, la sobreexpresión de proteínas de la autofagia se debe evitar, como cuando se expresan por encima de los niveles endógenos, que tienden a inhibir la respuesta autofagia 9. A la inversa, ya que los niveles de expresión del POI debe ser lo suficientemente alta como para permitir seguir su localización por un buen período de tiempo sin foto-blanqueo, un compromiso se ha alcanzado. El logro de los niveles de expresión óptimos de una proteína exógena en células mamíferos requiere mucha sintonía fina, pero es factible mediante el establecimiento y la detección de líneas celulares que expresan de forma estable los diferentes niveles de la PDI.
La resolución espacial que se puede lograr con microscopía de fluorescencia estándar es otro factor limitante. La resolución puede ser limitado por una serie de razones, pero en el mejor, resolución lateral será de alrededor de 250 nm. Esto significa que los objetos separados por una distancia menor que esta aparecerán conectado (o como una solaobjeto) y objetos de menos de 250 nm estarán representados en la imagen más grande de lo que realmente son. Por lo tanto, las imágenes siempre deben interpretarse teniendo esto en cuenta y las técnicas complementarias como la EM tendrán que resolver detalles finos ultra-estructural.
Por último, imágenes de células vivas requiere inherentemente exposición de una célula a la luz, potencialmente, para un período de tiempo prolongado. Esto puede alterar las respuestas fisiológicas de una célula, un fenómeno conocido como foto-toxicidad.
Hemos utilizado con éxito imágenes de células vivas de la proteína de unión a PI3P DFCP1 para describir por primera vez que se originan a partir de autofagosomas PI3P ricas en estructuras en forma de anillo omegasomes denominados, que están en estrecha asociación con ER hebras 10,11. Hemos demostrado claramente que las estructuras de LC3-positivos se empiezan a formar en estrecha asociación con omegasomes. Estamos aquí, sugerimos que el empleo de una línea celular estable expresando GFP-DFCP1 para la célula vivaimagen de la proteína de interés, establece un marco espacial y temporal robusto para la caracterización de su papel en la formación autophagosome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de células
- Semilla bajo número de pases de las células HEK-293T que expresan establemente GFP-DFCP1 en cubreobjetos redondos 22 mm; células de cultivos de una noche en medio Dulbecco Modificado de Eagles (DMEM), a una confluencia de 30-40% (objetivo para una confluencia de 80% después de 2 día - día de imágenes de células vivas).
2. Transfección celular
- Preparar la mezcla de complejo de transfección para cada plato, que contiene 100 l OptiMEM reduje el suero, 3 l X-9 tremeGENE ADN transfección reactivo, y 0,5 g de pECFP-LC3 plásmido ADN. Mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo y se incuba 15 minutos a temperatura ambiente. [Nota: Hemos encontrado repetidamente que otros reactivos de transfección, como Lipofectamine 2000, tienen un montón de toxicidad y, además, producen partículas fluorescentes en sus propios que interfieren con muchas técnicas de microscopía.]
- Aspirar el medio de las placas y añadir DMEM fresco pre-calentado a 37 ° C.
- Agregue la transfection complejo a las células por pipeteo, se incuban las células durante 24 horas.
3. Incubación de las células con el marcador Orgánulos (Opcional)
- Añadir MitoTracker / LysoTracker a DMEM a una concentración final de 75 nM, y mantener en hielo, en un tubo Falcon cubierto con papel de aluminio, a lo largo de todo el día experimental, para evitar la exposición a la luz y la congelación repetitivo y los ciclos de descongelación.
- Retirar una alícuota de 2 ml del medio que contiene LysoTracker MitoTracker / y calentar a 37 ° C; medio aspirado a partir de células transfectadas y reemplazar con MitoTracker / LysoTracker-que contiene el medio y se incuban las células durante 30 - 60 min.
4. Preparación de la cámara de incubación para imágenes de células vivas (Figura 1)
- Limpieza de metal y las juntas tóricas de plástico con 75% de etanol y aplicar grasa de silicona en el borde de la junta tórica de metal.
- El uso de pinzas quitar el cubreobjetos de la placa y secar el exceso de medio desde el lado inferior del cubreobjetos,para evitar que se mezclen demasiado medio con la grasa, ya que esto aumentará la probabilidad de fugas.
- Deje el cubreobjetos para descansar en el borde de la junta tórica de plástico y adaptarse a la junta tórica de metal en la parte superior de la junta tórica de plástico, con el cubreobjetos insertado en el medio, con el fin de crear una cámara cerrada.
- Rellenar cámara con el medio de la placa; desde este punto y en, evitar la incubación prolongada de las células en medio DMEM sin un agente tampón, para evitar cambios en el pH que se produzca, como el sistema de tampón de bicarbonato de DMEM requiere concentración artificial de CO 2 de 5-10% y la concentración de CO 2 del aire ambiente es mucho menor.
5. Padecer hambre a las células
- Coloque la cámara de incubación en la platina del microscopio.
- Aspirar el medio completo y se lava con 2 ml de medio de inanición 3 veces, para asegurarse de que no hay aminoácidos se han mantenido desde el DMEM, que eventualmente inhibir la respuesta autofagia; establecer eltemporizador ON.
6. Microscopía
- Se requiere un sistema de imagen adecuada configurada para células vivas de gran campo epi-fluorescencia. Este comprenderá típicamente un marco de la investigación de grado microscopio invertido, una intensa de amplio espectro de fuentes de luz, espejos y filtros específicos para la proteína fluorescente (s) / tinte (s) de interés, una lente de objetivo de alta calidad, un CCD / sCMOS sensible cámara y una cámara de incubación. Todos los principales fabricantes de microscopios ofrecen sistemas completos de gran campo apropiado para imágenes de células vivas, pero también es posible en casa a construir un sistema con componentes de una variedad de fabricantes y controlan el uso de software de código abierto como Micro-Manager ( http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). El aspecto más importante en nuestra opinión es el uso de un sistema de alta sensibilidad para que los niveles de expresión de los periodistas fluorescentes pueden mantenerse al mínimo.
- Selecting las celdas correspondientes a la imagen.
- Seleccione las celdas grandes y planas que permiten eventos de formación más autophagosome a ser capturados. Además, optar por las células que ya han comenzado la producción de un mayor número de omegasomes.
- Iniciar la captura de vídeo después de 30 min o bien en respuesta autofagia, con el fin de capturar una proporción más grande de eventos de formación autophagosome por vídeo.
- Imaging.
- Utilice un objetivo gran aumento (100x 1.4 NA).
- Ajuste la intensidad de luz de excitación a un 10-20% del máximo para evitar la foto-blanqueo.
- Ajuste la cámara (Hamamatsu ORCA ER, tamaño de píxel 6.45 m) para la exposición 100-500 ms, binning 2x2 y 100 de ganancia.
- Ajuste la velocidad de adquisición de imágenes de 1 fotograma cada 10 seg.
7. La creación de montajes de autophagosome Formación Eventos con ImageJ
[Esto se puede hacer de una manera no sistemática por el simple escaneado el vídeo fusionado para el correorespiraderos de interés, pero también puede ser sistematizados como se indica a continuación.]
- Pilas de imágenes abiertas para el 3 (o 2) capturaron canales en ImageJ / Fiji.
- Aplicar LUT verde, rojo y azul (Tablas de búsqueda) para el canal correspondiente; combinar 3 colores y ahorrar.
- En la ficha Analizar, seleccione Herramientas> ROI gerente ... > Especificar, a continuación, seleccionar un área aleatoria de tamaño definido en la primera imagen de la pila.
- En la ficha Imagen, seleccione duplicado, con el fin de duplicar el área seleccionada de la pila.
- En la ficha Imagen, seleccione Pilas> Hacer montage ... para crear un montaje provisional contiene capturan todos los marcos. Analizar todos los marcos en el montaje de un evento complete la formación autophagosome; tomar notas de la primera y la última imagen del evento.
- En la ficha Analizar, seleccione Herramientas> ROI gerente ... seleccionar la misma zona en la primera imagen de la pila para los otros 2 colores, así como para la imagen resultante de la concentración colores y duplicar pilas.
- De tél pestaña Archivo, seleccione Nuevo> Imagen, y para un ancho de acuerdo al número de píxeles seleccionados inicialmente con el administrador de retorno de la inversión, establecidos para la altura 4 veces la altura establecida en el gestor de ROI más 3 píxeles de espacio entre los 3 y los colores Rebanadas fusionado, y se definen como el número de fotogramas en cada pila.
- En la ficha Imagen, seleccione Pilas> Herramientas> Insertar ... y luego insertar cada sub-pila encima de otra, dejando un espacio de 1 pixel en el medio.
- En la ficha Imagen, seleccione Pilas> Hacer montage ... para crear un montaje de partida y acabado con la primera y última trama de la formación de evento autofagosoma capturado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En el protocolo descrito, hemos utilizado la microscopía de lapso de tiempo para seguir la localización de la PPC de etiquetado LC3 en una línea celular estable expresando GFP-etiquetados DFCP1, en condiciones que inducen la autofagia. El resultado de este experimento es la captura de 2 series o pilas de imágenes, uno de la verde y uno desde el canal azul, correspondientes a GFP-DFCP1 y CFP-LC3. Hemos analizado más estos videos usando ImageJ, con el fin de crear montajes correspondientes a eventos de formación autophagosome individuales, tal como se describe en la sección de protocolo. Este análisis permitió comprobar que un autophagosome LC3-positiva se origina en una omegasome DFCP1-positivo. En el montaje mostrado en la Figura 2, la formación de un omegasome se vuelve evidente a partir de la segunda trama, en la forma de un pequeño punto. El omegasome comienza la expansión con el fin de formar la estructura característica de tipo anillo, y alcanza su máximo diámetro después de 6 min. A continuación, el omegasome comienza collapsing y eventualmente desaparece después de aproximadamente 10 min. Poniendo ahora la formación de la estructura LC3-positivo o autofagosoma en el contexto de la formación omegasome, se observa que la autofagosoma aparece después de la omegasome, y se vuelve claramente visible después de aproximadamente 1,5 min. El autophagosome inicia expansión en estrecha asociación con el omegasome, primer lugar y luego el anillo, y cuando el omegasome comienza colapsando las yemas autophagosome off. Finalmente, el autophagosome se queda atrás, al parecer para fusionarse con los lisosomas, después de desaparecer la omegasome. Este análisis proporciona una indicación clara acerca de la relación funcional entre las estructuras 2, según el cual LC3 autofagosomas positivos se originan a partir de omegasomes correspondientes.
En otro ejemplo, hemos añadido un rastreador lisosoma con el fin de capturar la asociación temporal y espacial de la autophagosome formación con los lisosomas (Figura 3
Sin embargo, el mismo tipo de análisis puede producir resultados no interpretables, debido a una variedad de razones. En el ejemplo presentado en la figura 4, los resultados se vuelven no interpretable debido a una deriva en el foco. Vídeo comienza a capturar con éxito la formación de un autofagosoma, sin embargo una deriva en el enfoque se produce después de la marca de 3 min. La captura de vídeo sigue fuera de foco para el próximo 6 minutos, pero al final el objetivo que se corrija manualmente después de la marca de 9 a 10 min. Este análisis, sin embargo, hace imposible discriminar si el evento formación autophagosome capturado cuando se corrige el enfoque es elevento inicial que está casi terminada, o uno nuevo que se inició después de la deriva en el enfoque.
Los problemas adicionales se pueden atribuir a la confluencia de las células cultivadas. Por ejemplo, cuando las células se cultivan a una confluencia superior al óptimo, se ven obligados a ampliar en la parte superior de una célula adyacente, lo que hace que se centra bastante difícil. Por otra parte, las células que se cultivan a alta confluencia tienden a ser subrayado, el aumento de los niveles de actividad de la autofagia fondo antes de la iniciación de la inanición.
Finalmente, las cuestiones relacionadas con fluorescencia son bastante comunes. PPC tiene una actividad más débil en comparación con la fluorescencia de GFP, y a menudo se foto-blanqueada en etapas posteriores de la captura de vídeo. El análisis de estos vídeos puede conducir a conclusiones falsas negativas acerca de la asociación espacial del POI con autofagosomas formación. Sin embargo, estos problemas se pueden superar mediante el uso de una de las variantes, tales como mTurquise2. Otro fenomeno comúnn deriva del hecho de que la fluorescencia de etiquetas rojas no se apaga en el pH más bajo de los lisosomas. Muchas proteínas autofagia fisiológicamente terminan su ciclo de vida en los lisosomas, mientras autofagosomas finalmente se fusionan con los lisosomas. Por otra parte, las proteínas no funcionales a menudo son blanco de la degradación en los lisosomas. Por lo tanto, uno podría terminar después de la asociación sin fines de autofagosomas relacionados con los lisosomas, en lugar de una asociación física de entre un POI y omegasomes etiqueta roja.
Figura 1. Cámara de incubación. La junta tórica de plástico se ajusta alrededor del borde de la junta tórica de metal y tiene en la parte inferior un saliente delgada que se extiende hacia el interior. El cubreobjetos se coloca en el borde de la junta tórica de plástico, y a continuación, el O-anillo de plástico se monta en la parte inferior de la junta tórica de metal. De esta manera, el cubreobjetos es arenaintercalado entre las 2 juntas tóricas, la creación de una cámara cerrada.
Figura 2. Las células que expresan GFP-DFCP1 y CFP-LC3 se mueren de inanición durante 30 minutos y la imagen a una velocidad de 1 fotograma cada 10 seg. Un montaje de un evento representativo formación autophagosome se presenta. Las señales de los canales verde y azul son pseudo-color verde y rojo correspondientemente. Las flechas indican la primera omegasome discernible y autophagosome. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. Las células que expresan GFP-DFCP1 y CFP-LC3, se incubaron con LysoTracker rojo, en ayunas durante 30 min y se obtuvieron imágenes a una velocidad de 1 marco cada 15 seg. Un montaje de un evento de formación de representante autofagosoma se presenta. Las señales de los canales de color verde, rojo y azul son pseudo-color correspondiente verde, azul y rojo. Las flechas indican la primera omegasome discernible y autophagosome. Punta de flecha indica la primera captura de la fusión autophagosome con el lisosoma. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
La Figura 4. Las células que expresan GFP-DFCP1 y CFP-LC3 se mueren de inanición durante 30 min y la imagen a una velocidad de 1 marco cada 10 seg. Un montaje de un ejemplo de sub-o se presenta captura ptimal. Las señales de los canales verde y azul son pseudo-color verde y rojo correspondientemente. Las flechas indican la primera omegasome discernible y autophagosome. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Video 1. Vídeo del evento formación autophagosome presenta en la Figura 2. La velocidad de reproducción es de 4 fotogramas por segundo. Haz clic aquí para ver la película .
Video 2. Vídeo del evento formación autofagosoma presentado en la Figura 3. La flecha indica primero, la formación de la omegasome, y segundo, la fusión de la autofagosoma con los lisosomas. La velocidad de reproducción es de 4 fotogramas por segundo."> Haga clic aquí para ver la película.
Video 3. Vídeo del evento formación autophagosome presenta en la Figura 4. La velocidad de reproducción es de 4 fotogramas por segundo. Haz clic aquí para ver la película .
Tabla 1. Lista de reactivos y equipos específicos necesarios para el protocolo, junto con el proveedor correspondiente y el número de catálogo.
TOPES
| Buffer | Composición | Paso Usados |
| Medio de inanición | HEPES 20 mM, pH 7,4 | 5.2 |
| 140 mM de NaCl | ||
| 1 mM de CaCl2 | ||
| 1 mM MgCl 2 | ||
| 5 mM de glucosa | ||
| 1% de BSA |
Tabla 2. Lista de los tampones utilizados en este protocolo. Los tampones utilizados, su composición y el primer paso en el que se utilizan en el protocolo está listado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El método descrito en este protocolo permite la visualización de la localización de una proteína durante la formación de autofagosoma. Hemos intentado varios métodos de visualización de los eventos descritos como punto confocal de barrido, disco giratorio confocal y de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) microscopía. Hemos encontrado que para los propósitos generales de campo amplio epi-fluorescencia estándar proporciona el mejor compromiso entre la sensibilidad y la resolución. Esto asegura una buena señal a ruido, photo-bleaching/photo-toxicity mínima y una rápida adquisición. La falta de seccionamiento óptico no es un problema si las regiones apropiadas de la célula se eligen para la imagen, es decir la periferia donde se propaga la célula y plana. Sin embargo, es importante que el sistema de imagen utilizado está configurado apropiadamente (tanto en términos del hardware utilizado y la configuración del sistema).
Para una mejor resolución espacial, se recomienda usar una alta magnificación, hlente igh apertura numérica aceite de inmersión (lentes de inmersión en agua no serán un beneficio formación de imágenes en las proximidades de la cubreobjetos). Se sugiere para equilibrar la intensidad de la iluminación (por ejemplo, con filtros de densidad neutra), los ajustes de la cámara (tiempo de exposición, y la ganancia de binning) para maximizar la relación señal-ruido y minimizar la decoloración. Esto tendrá que hacerse empíricamente, sino como una guía, cuando se utiliza un objetivo 100x 1.4 NA que suelen reducir el poder de nuestra luz de excitación a un 10-20% del máximo y ajuste la cámara (Hamamatsu ORCA ER, tamaño de píxel 6.45 m) la exposición a 100-500 mseg, binning 2x2 y 100 de ganancia.
La tasa de adquisición de la imagen se debe establecer en el intervalo de 1 marco cada 1-10 seg. La adquisición de imágenes a velocidades de cuadro más altas se asegurará una mayor continuidad entre las imágenes (mejor resolución temporal), pero va a exponer las células a más luz y así aumentar photo-bleaching/photo-toxicity.
Si una imagen más fluorescenccanales de correos, tiene que asegurarse de que el retardo entre la captura de canal se reduce al mínimo (reducir el tiempo de exposición, ajuste cambiadores de filtro rápido). Esto reducirá las posibilidades de que los artefactos de movimiento que aparecen en la imagen compuesta. Si los artefactos de movimiento están resultando difíciles de evitar considerar el uso de un divisor de imagen (un dispositivo para facilitar la adquisición simultánea de dos canales de fluorescencia utilizando una cámara) o un adaptador de doble cámara.
Imágenes canal azul requiere la selección de filtros y espejos adecuados a fin de evitar las emisiones de la fluorescencia azul para el canal verde. Hemos utilizado con éxito un microscopio Olympus CellR, que utiliza el iluminador Hasta Polychrome V, que permite la selección específica de longitud de onda, ancho de banda y la intensidad y por lo tanto es muy flexible. Sin embargo, la fuente de luz es 'fugas' con un poco de luz blanca que viene a través, además de la wavelengths.For seleccionado esta razón hemos provisto (multi) filtros de paso de banda de excitación en elcubos, así que no adicional de filtrado de la luz de excitación. Se utilizó la siguiente combinación de espejos / filtros (todos Semrock). Por las buenas prácticas agrarias y mCherry: Exciter FF01-479-585, emisor FF02-525/40 (GFP) y FF01-607/36 (mCherry), Espejo dicroico FF505/606-Di01. Para PPC: Exciter FF01-416/501, emisor FF01-523/610, espejo dicroico FF440/520-Di01. También hemos utilizado un microscopio CellR diferente, lo que ha dado resultados sub-óptimos, con la cruz-emisión de fluorescencia azul en el canal verde. Este microscopio utiliza una fuente de luz blanca y tiene una rueda de filtro rápido para seleccionar el wavelengths.This de excitación significa que la selección de longitud de onda se limita a los 8 filtros en la rueda, pero no es una rueda separada para regular la intensidad. Se utilizó la siguiente combinación de espejos / filtros. Para GFP (Semrock): Exciter FF01-470/40, emisor FF02-525/50, espejo dicroico FF495-DI02. Para PPC y mCherry: Exciter FF01-427/10 (PPC, Semrock) 572/23 (mCherry, Chroma), emisor FF01-472/30 (PPC, Semrock) 632/60 (mCherry, Chroma), espejo dicroico 89006bs (Chroma).
La importancia de esta técnica en comparación con otras técnicas de imagen es doble: En primer lugar, puede capturar la localización de la proteína de interés en las células vivas, y la segunda, que puede aumentar la información extraída la adición de la cuarta dimensión del tiempo. Sin embargo, como con las proteínas exógenas siempre existe la posibilidad de mislocalization, ya sea debido al aumento de los niveles de expresión o debido al etiquetado, por lo tanto, en vivo de imágenes de células se debe combinar con inmuno-tinción de la PDI endógeno en células fijadas, con el fin de corroborar los resultados . Finalmente, merece la pena señalar que imágenes de células vivas se puede combinar con inmuno-EM, con el fin de aumentar la resolución espacial del análisis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nuestro trabajo es apoyado por la Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación. Nos gustaría agradecer a Prof Tamotsu Yoshimori para nosotros proporcionar amablemente con el plásmido para la expresión de PPC-LC3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
- Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
- Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
- Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
- Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
- Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
- Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
- Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
- Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).
