Summary
蛍光標識したオートファジーマーカーのタイムラプス顕微鏡は、高時間分解能とダイナミックオートファジー応答の監視ができます。 3つの異なる色の組み合わせで特定のオートファジーとオルガネラのマーカーを使用して、我々は強固な空間的·時間的文脈におけるオートファゴソーム形成にタンパク質の寄与に従うことができます。
Abstract
自食作用は、特に栄養素の不足、アミノ酸の欠如によって引き起こされる細胞応答である。自食作用は細胞質、長寿命のタンパク質およびタンパク質凝集体であっても、欠陥のある細胞小器官、およびウイルスまたは細菌を隔離ファゴソームと呼ばれる二重膜構造の形成、によって定義される。オートファゴソームは、最終的に細胞質に戻ってリサイクルされる生産の栄養素と、そのコンテンツのバルク劣化につながるリソソームと融合。そのため、オートファジーは、細胞の恒常性のために重要であり、オートファジーの調節不全は、疾患、特に神経変性、老化やがんにつながることができます。
オートファゴソームの形成は、細胞がコアオートファジー機械と呼ばれる、タンパク質の特定のグループを割り当てているため、非常に手の込んだプロセスです。コアオートファジー機械は機能MEMBRANで例えば 、多様な細胞プロセスに関与する付加的なタンパク質によって補完されミトコンドリアとリソソーム生物学におけるe密売、。オートファゴソームの形成と分解のためのこれらのタンパク質の調整はオートファジーの非常にダイナミックで洗練された応答を構成している。ライブセルイメージングは1つが、単一のオートファゴソーム形成のイベントのレベルまで各オートファジー関連タンパク質の分子の寄与を下に従うことができ、リアルタイムで、そのためこの手法は、高い時間·空間分解能を提供しています。
ここでは、我々の分析のための空間的および時間的なコンテキストを確立するために、安定的にGFP-DFCP1を発現する細胞ラインを使用。オートファゴソームの形成につながる前駆構造ですDFCP1マークomegasomes、。目的のタンパク質（POI）は、赤やシアン蛍光タグのいずれかをマークすることができます。ミトコンドリアとリソソームERのような別の細胞小器官は、、、すべてのオートファゴソーム形成の異なるステップに関与しており、特定のトラッカーの染料を使用してマークすることができます。 AUTOPのタイムラプス顕微鏡この実験的なセットでhagyアップ、情報が四次元、 すなわち時間について抽出することができます。したがって、我々は時間と空間にオートファジーにPOIの寄与に従うことができます。
Introduction
自食作用は1-3オートファゴ形成の最終的な結果のために多数のタンパク質の調整を必要とする非常に動的なプロセスである。顕微鏡は、おそらく最も一般的にオートファジー4を研究するための適用手法です。最もファジータンパク質の局在化は、広く両方の内因性タンパク質を免疫染色することによって及び蛍光標識外因性タンパク質の発現により、固定細胞において研究されている。また、電子顕微鏡（EM）、単独および免疫金標識との組み合わせでは、これらの構造5,6の細部を説明した。時間-これらの技術は空間の3次元のオートファゴソーム形成の我々の理解を確立しているという事実にもかかわらず、彼らは4 番目の次元の情報の十分な量を提供するために失敗している。それはpossiとして近くにオートファゴソームの形成に続くことができるようにライブセルイメージングはこの障壁を克服リアルタイム7〜BLE。この技術は、第吉森ら8によってファジーを研究するために用いられ、今後ますます使用されている。
タイムラプス顕微鏡は、生きた細胞内で、一定期間にわたってPOIの局在をキャプチャします。よく特徴付け自食作用および/または細胞小器官マーカーでこの情報を比較することにより、生細胞画像解析は、オートファゴ形成の大きな空間的および時間的文脈でPOIを置くことができる。固定された細胞のイメージングは、単一のキャプチャに基づいていながら、ライブセルイメージング解析は、オートファゴソーム形成のすべてのステップに沿ってPOI定位の繰り返し取り込みに基づいています。固定した細胞のイメージングが同時にlifecyの様々な段階で撮影多くのオートファゴソームにその平均ローカライズに基づいて、POIの役割のみを引き受けることができつつ、ライブセルイメージングは、オートファゴソーム形成の具体的なステップでPOIの貢献を証明することができますCLE。
ライブセルイメージングは、高パワーの分析方法であるが、考慮しなければならないいくつかの固有の限界を有している。まず、生細胞のイメージングは、1つ以上の外因性の蛍光標識タンパク質の発現を必要とする。蛍光タグのサイズは大きくなる傾向があり、彼らは、時には立体的理由のためにタンパク質の挙動を変更することができます。それらは膜の2次元の限られた空間で機能する必要があるとして、この状況は、膜タンパク質に対して強調されている。注目すべきは、オートファゴは膜構造であり、従ってそれらの形成は、膜結合タンパク質を大量に必要とする。
問題の別のセットは、POIの発現レベルに接続されている。原理的には、外因性タンパク質は、内因性タンパク質に匹敵するレベルで発現されるべきである。これは、そのサブ細胞内局在の重要な調節因子が飽和されないことを保証し、目電子分析は生物学的に関連するようになります。それらは、内因性レベル以上表される場合、それらはファジー応答9を阻害する傾向があるので、さらに、ファジータンパク質の過剰発現は、避けるべきである。 POIの発現レベルは、光退色なしに時間の良い期間の後に、そのローカライゼーションを可能にするのに十分高くなければならないので、逆に、妥協点に到達しなければならない。哺乳動物細胞における外因性タンパク質の最適な発現レベルを達成するには、微調整の多くを必要とするが、それは安定してPOIのさまざまなレベルを発現する細胞株を確立し、スクリーニングすることによって実現可能である。
標準的な蛍光顕微鏡を用いて達成することができる空間分解能は別の制限要因である。解像度はいくつかの理由のために制限することができるが、最高の状態で、横方向の分解能は250nmで前後になる。これは、これより小さい距離で区切られているオブジェクトが接続されている（または単一として表示されることを意味します250 nmのは、彼らが実際にあるより大きな画像で表現されますよりも小さな物体）とオブジェクト。したがって、画像は常に念頭に置いてこれを解釈されるべきで、そのようなEMなどの補完的な技術は細かい超構造の細部を解決する必要があります。
最後に、生細胞画像化は、本質的に長期間にわたって潜在的に、光に露出させるセルを必要とする。これは、セル、光毒性として知られる現象の生理学的応答を変化させることができる。
我々は正常にオートファゴソームがERストランド10,11と密接に関連しているPI3P豊富なリング状の構造と呼ばomegasomes、由来することを初めて記述するPI3P結合タンパク質DFCP1のライブセルイメージングを使用している。我々は明らかにLC3陽性構造はomegasomesと密接に関連して形成し始めることが示されている。ここ細胞株を用いた生細胞に対して安定GFP-DFCP1を発現することを示唆している目的のタンパク質のイメージングは、オートファゴソーム形成におけるその役割の特性評価のための堅牢な空間および時間枠を確立します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。細胞調製
- （2の後の80％の密集度を目指す30〜40％のコンフルエントになるまで、ダルベッコ改変イーグルの培地（DMEM）中で一晩培養細胞、HEK-293T細胞の種低継数が安定的に22ミリメートルの円形のカバースリップ上GFP-DFCP1を表現日 - ライブセルイメージングの日）。
2。細胞トランスフェクション
- 私は血清培地、3μlのX-tremeGENE 9 DNAトランスフェクション試薬、及びpECFP-LC3プラスミドDNA0.5μgのを減少させ、100μlのOptiMEM中を含む、各プレートのためにトランスフェクション複雑なミックスを調製する。とを上下にピペッティングにより穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートする。 [注：我々は何度もそのようなリポフェクトアミン2000などの他のトランスフェクション試薬は、毒性の多くを持っていることを発見した、そして、それに加えて、彼らは多くの顕微鏡技術と干渉し、自分の上に蛍光粒子を生成します。]
- プレートから培地を吸引し、新鮮なDMEM予め温め37℃を追加
- TRANを追加ピペッティングにより細胞への複雑なsfection、24時間インキュベートした細胞。
3。オルガネラマーカー（オプション）を持つセル·インキュベーション
- 75 nMの最終濃度DMEMにmitotracker / lysotrackerを追加し、露光、繰り返し凍結融解サイクルを避けるために、全体の実験日に沿って、アルミホイルで覆いファルコンチューブに、氷上で保持する。
- mitotracker / lysotracker含有培地2mlのアリコートを取り出し、37℃で温める。トランスフェクトした細胞から吸引培地とmitotracker / 30用培地とインキュベート細胞含有lysotrackerと交換 - 60分。
4。生細胞イメージングのためのインキュベーションチャンバー（図1）の調製
- きれいな金属、75％エタノールでOリングプラスチックと金属Oリングのリム上にシリコングリースを塗布してください。
- 、プレートからカバーガラスを除去し、カバースリップの下側から媒体の過剰の乾燥鉗子を使用してこれは漏れの可能性を増加させるように、グリースが多すぎる培地を混合しないようにします。
- 密閉チャンバーを作成するために、プラスチック製のOリングの棚の上に休ませ、その間に挟まれたカバースリップで、プラスチック製のOリングの上に金属製のOリングに合うようにカバースリップのままにしておきます。
- プレートから媒体とチャンバアップトップ、この点から上に、DMEMの重炭酸塩緩衝系は人工的なCO 2濃度を必要とするように、発生するpHの変化を防ぐために、緩衝剤を含まないDMEM培地での細胞の長期のインキュベーションを避ける5〜10％の、周囲の空気のCO 2濃度が非常に低い。
5。細胞の飢餓
- 顕微鏡ステージ上でインキュベーションチャンバーを置く。
- 完全培地を吸引しないアミノ酸が、最終的にオートファジー応答を阻害するDMEMから、残っていないことを確実にするために、飢餓培地2mlで3回洗浄する。設定ONタイマー。
6。顕微鏡検査
- 生細胞広視野落射用に構成されている適切なイメージング·システムが必要となる。これは、典型的には研究用倒立顕微鏡フレーム、蛍光タンパク質（単数または複数）/その他の染料（単数または複数）、高品質の対物レンズ、敏感なCCD / sCMOSに特異強烈な広域スペクトル光源、ミラーおよびフィルタを含む。カメラとインキュベーションチャンバー。 （すべての主要顕微鏡メーカーはライブセルイメージングに適した完全な広視野システムを提供していますが、それはメーカーの様々なコンポーネントを使用してシステムを家庭構築もすることが可能であり、そのようなマイクロマネージャーなどのオープンソースソフトウェアを使用してそれを制御します。http / / valelab.ucsf.edu /〜MM / MMwiki / ）。我々の意見で最も重要な側面は、蛍光レポーターの発現レベルを最小限に抑えることができるように高感度のシステムを使用することである。
- SEL画像に適切なセルをecting。
- もっとオートファゴソーム形成のイベントをキャプチャできるようになります大規模でフラットなセルを選択します。また、すでにomegasomesより多くの生産を開始した細胞を選ぶ。
- ビデオあたりオートファゴ形成事象のより大きな割合を捕捉するためには、30分後またはウェルファジー応答にビデオキャプチャを開始する。
- イメージング。
- 高倍率レンズ（100×1.4 NA）を使用します。
- 光退色を防止するために最大の10〜20％の励起光の強度を調整する。
- 100〜500ミリ秒の露出、2x2のビニングと100ゲインにカメラ（浜松ORCA ER、画素サイズ6.45μm）を設定します。
- 画像取得速度1フレーム毎に10秒に設定します。
7。 ImageJのとオートファゴソーム形成イベントのモンタージュを作成する
[これは、単に電子ためにマージされた映像をスキャンして非体系的な方法で行うことができる興味のある通気孔が、以下に概説するように、それはまた、体系化することができます。]
- ImageJの/フィジーの3（または2）キャプチャチャネルのためのオープン画像スタック。
- 対応するチャンネルに、赤、緑、青のLUT（ルックアップテーブル）を適用し、3色をマージし、保存します。
- 分析]タブから、[ツール]> [ROIマネージャー]を選択します... >指定し、スタックの最初の画像で定義されたサイズのランダムな領域を選択します。
- [イメージ]タブから、スタックの選択領域を複製するために、複製を選択します。
- [イメージ]タブで、[スタック]を選択> [モンタージュを作る...キャプチャされたすべてのフレームを含む暫定的なモンタージュを作成します。完全なオートファゴソーム形成のイベントのモンタージュのすべてのフレームをスキャンし、イベントの最初と最後のフレームのノートを保つ。
- 分析]タブから、[ツール]> [ROIマネージャー]を選択します...他の2色のためだけでなく、マージされた色のイメージと重複してスタックのスタックの最初の画像で同じ領域を選択します。
- Tから彼はタブをファイル、[新規]> [イメージ]を選択し、高さに設定されたROIマネージャを使用して最初に選択されたピクセルの数に応じた幅に設定されて4回ROIマネージャで設定した高さに加え、3色との間のスペースのために3ピクセル各スタック内のフレーム数として合併し、設定スライス。
- [イメージ]タブから、[スタック]> [ツール]> [挿入...、その後の間に1ピクセルのスペースを残して、別の上に各サブスタック1を挿入します。
- [イメージ]タブで、[スタック]を選択> [モンタージュを作る...開始とキャプチャオートファゴソーム形成のイベントの最初と最後のフレームに仕上げモンタージュを作成します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
プロトコルは説明では、安定的にオートファジーを誘導する条件下では、GFPタグDFCP1を発現している細胞株におけるCFP-タグLC3の局在に従うことをタイムラプス顕微鏡を使用している。この実験の結果は、2シリーズまたはGFP-DFCP1とCFP-LC3に対応する画像、緑色から1と青のチャンネルから1つのスタックのキャプチャです。我々はさらに、プロトコルのセクションで説明したように、単一のオートファゴ形成イベントに対応するモンタージュを作成するために、ImageJのを使用してこれらのビデオを分析した。この分析は、私たちがLC3陽性のオートファゴソームがDFCP1陽性omegasome由来することを証明することができました。 図2に示すモンタージュにおいて、omegasomeの形成は小さなスポットの形で、第二フレームから明らかになる。 omegasomeは、特性リング状の構造を形成するために膨張を開始し、6分後に最大直径に達する。次に、omegasomeは、Cを開始ollapsing、結局それが消え、約10分後。今omegasome形成の文脈におけるLC3陽性構造やオートファゴソームの形成を入れて、私たちは、オートファゴソームがomegasome後に表示され、約1.5分後にはっきりと見えるようになることを確認します。オートファゴソームはomegasome、最初のスポットと、リングと密接に関連して拡大して開始され、omegasomeは、オートファゴソームの芽を切っ崩壊開始したとき。 omegasomeが消えた後に最終的にオートファゴソームは、明らかにリソソームと融合するためには、後ろに留まる。この分析は、LC3陽性のオートファゴソームが、対応omegasomesから発信されたによると、2の構造の間の機能の関係について明確な指示を提供します。
別の例において、我々は（リソソームを形成するオートファゴの時間的および空間的な関連付けを捕捉するために、 図3リソソームトラックを追加した
しかし、分析の同じ種類は様々な理由のために解釈不能な結果を、生成することができます。 図4に示す例では、結果が解釈不能フォーカスのドリフトによるなる。ビデオが正常にオートファゴソームの形成をキャプチャを開始、しかし、焦点のドリフトは3分マークの後に発生します。ビデオキャプチャは、次の6分間の焦点から出続けますが、最終的にはフォーカスは手動で9から10分マークの後に修正されています。しかしこの分析は、フォーカスが補正されたときにキャプチャされたオートファゴ形成イベントがあるかどうかを判別することは不可能となるほぼ完成された初期イベント、またはフォーカスのドリフトの後に開始された新しいもの。
上記の問題は、培養細胞のコンフルエントに帰することができる。例えば、細胞がコンフルエント最適よりも高いで成長される場合、それらは非常に困難となる合焦隣接セルの上に展開することを余儀なくされている。また、高い集密度で成長している細胞は、飢餓を開始する前に、バックグラウンドファジー活性のレベルを増加させる、強調する傾向がある。
最後に、蛍光関連の問題は非常に一般的です。 CFPは、GFPに比べて弱い蛍光活性を有しており、多くの場合、ビデオキャプチャリングの後の段階で光退色なる。ビデオなどの分析は、オートファゴソーム形成とPOIの空間的関連についての偽陰性の結論につながることができます。しかし、これらの問題は、例えばmTurquise2として変異体のいずれかを使用して克服することができる。別の一般的なphenomenonは、赤色の蛍光タグをリソソームの低いpHでクエンチされないという事実から生じる。オートファゴソームが結局リソソームと融合しながら、多くのオートファジータンパク質は、生理学的に、リソソームに彼らのライフサイクルを終える。また、非機能性タンパク質は、多くの場合、リソソームでの分解を対象としています。したがって、1の代わりに赤タグ付きPOIとomegasomes間の実際の物理的な協会のリソソームとオートファゴソームの非関連協会、以下に終わるかもしれない。
図1。インキュベーションチャンバー。プラスチック製O-リングは、金属Oリングの縁の周りにフィットし、底に内側に伸びる細い棚を持っています。カバースリップは、プラスチックO-リングの棚上に載置された後、プラスチックOリングは金属Oリングの底部に装着されている。このように、カバースリップは砂です密閉チャンバーを作成する2 O-リングの間wiched。
図2。 GFP-DFCP1とCFP-LC3を発現する細胞を30分間飢えと1フレームの割合ごとに10秒で撮像した。代表的なオートファゴソーム形成イベントのモンタージュ提示されます。緑と青のチャンネルからの信号は、擬似色の緑とそれに対応して赤です。矢印は、最初に認識できるomegasomeとオートファゴソームを示す。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
Fiのグレ3。 、lysotracker赤とインキュベート30分間飢えと1フレームの割合ごとに15秒で撮像した、GFP-DFCP1とCFP-LC3を発現している。代表的なオートファゴソーム形成事象のモンタージュは、細胞が提示されます。 、緑、赤と青のチャンネルからの信号は擬似色、緑、青と赤に対応しています。矢印は、最初に認識できるomegasomeとオートファゴソームを示す。アローヘッドはリソソームとオートファゴソームの融合の最初のキャプチャを示します。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。 GFP-DFCP1とCFP-LC3を発現する細胞を30分間飢えと1フレーム毎に10秒の速度で画像化した。サブOの一例のモンタージュは、 ptimalキャプチャが提示されます。緑と青のチャンネルからの信号は、擬似色の緑とそれに対応して赤です。矢印は、最初に認識できるomegasomeとオートファゴソームを示す。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
ビデオ1。図2に示したオートファゴソーム形成のイベントのビデオ。再生速度は毎秒4フレームです。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
ビデオ2。図3に示すオートファゴソーム形成のイベントのビデオ。矢印は最初、omegasomeの形成、そして第二に、リソソームとオートファゴソームの融合を示している。再生速度は毎秒4フレームである。">のムービーを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ3。図4に示すオートファゴソーム形成のイベントのビデオ。再生速度は毎秒4フレームです。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
表1。対応するプロバイダとカタログ番号とともに、プロトコルに必要な特定の試薬 と機器のリスト。
BUFFERS
| バッファ | 構図 | 使用されるステップ |
| 飢餓培地 | 20mMのHEPES pH7.4の | 5.2 |
| 140mMのNaClを | ||
| 1mMのCaCl 2を | ||
| 1mMのMgCl 2を | ||
| 5 mMグルコース | ||
| 1％BSA |
表2。このプロトコルで使用されるバッファのリスト。使用されるバッファは、その組成、それらはプロトコルで使用される最初のステップが記載されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルに記載されている方法は、オートファゴソーム形成の間にタンパク質の局在を可視化することができます。我々は、ポイントスキャン共焦点、スピニングディスクを共焦点と全反射蛍光（TIRF）顕微鏡検査を含む説明イベントを可視化する様々な方法を試してみました。我々は、一般的な目的のために標準の広視野落射蛍光は感度と分解能との間の最良の妥協を提供することを見出した。これは、ノイズ、ミニマルphoto-bleaching/photo-toxicityと高速買収に良好な信号を保証します。セルの適切な領域はセルが広がって平らにされて周辺すなわちイメージに選ばれている場合は、光学セクショニングの欠如は問題ではありません。ただし、（使用するハードウェアおよびシステム設定の両面で）使用される撮像システムが適切に構成されていることが重要である。
最高の空間分解能のために、高倍率、Hを使用することが推奨されIGH開口油浸レンズ（水浸レンズはカバースリップに近接全く給付イメージングを提供しません）。これは、信号対雑音を最大化し、漂白最小限に抑えるための照度（中性濃度フィルタを使用など ）、カメラ設定（露光時間、ビニングおよび利得）を両立することが提案されている。これは、経験的に行われなければならないが、目安として、100×1.4 NAレンズを用いたとき、我々は、典型的には最大値の10〜20％まで励起光のパワーを低減し、カメラ（浜松ORCA ER、画素サイズ6.45μm）を設定する100〜500ミリ秒の露出、2x2のビニングと100ゲイン。
画像取得速度は1フレーム毎に1-10秒の範囲で設定されるべきである。高いフレームレートで画像を取得する画像（より良い時間分解能）の間のより良い継続性を確保しますが、より多くの光に細胞をさらすためphoto-bleaching/photo-toxicityが増加します。
イメージングもっとfluorescenc場合電子チャネル、チャネル間の遅延を捕捉（高速フィルタチェンジャに合わせて、露光時間を短縮する）最小化されることを保証しなければならない。これにより、合成画像に現れるモーションアーチファクトの可能性を減少させる。モーションアーチファクトは、画像スプリッタ（一台のカメラを使用して2蛍光チャネルの同時取得を容易にする装置）またはデュアルカメラアダプターを使用することを検討して回避することは困難で証明されている場合。
イメージング青チャンネルはグリーンチャンネルに青色蛍光のクロス放出を防止するために、適切なフィルタやミラーを選択する必要があります。我々は成功し、波長帯域幅と強度の特定の選択を可能にする、多色V照明ティル使用するので、非常に柔軟であるオリンパスCellR顕微鏡を使用しています。しかし、光源は、我々が装着しているこのような理由（マルチ）におけるバンドパス励起フィルター一部白色光は、選択wavelengths.Forに加えてから来るの "漏れ"ですキューブは、その励起光の追加のフィルタリングがある。鏡/フィルタの組み合わせは、以下の（すべてSemrock）を用いた。 GFP＆mCherry用：エキサイターFF01-479から585、エミッタFF02-525/40（GFP）とFF01-607/36（mCherry）、ダイクロイックミラーFF505/606-Di01。エキサイターFF01-416/501、エミッタFF01-523/610、ダイクロイックミラーFF440/520-Di01：CFPのために。また、緑のチャンネルに青色蛍光のクロスエミッションとは、サブ最適な結果を与えている異なるCellR顕微鏡を、使用している。この顕微鏡は、白色光源を使用し、励起wavelengths.Thisは、波長選択が車輪20.32フィルタに限定されることを意味するが、強度を調節するための別の車輪があるか選択するために、高速フィルタホイールを有している。鏡/フィルタは、以下の組み合わせを用いた。エキサイターFF01-470/40、エミッタFF02-525/50、ダイクロイックミラーFF495-DI02：GFP（Semrock）用。 CFPとmCherry場合：エキサイターFF01-427/10（CFP、Semrock）23分の572（mCherry、クロマ）、エミッタFF01-472/30（CFP、Semrock）60分の632（mCherry、クロマ）、ダイクロイックミラー89006bs（クロマ）。
他のイメージング技術と比較して、この技術の重要性は2つある：第一に、生細胞における目的のタンパク質の局在をキャプチャし、第ことができ、それは時間の四次元を追加する抽出された情報を高めることができる。どちらかの増加した発現レベルのために、またはタグ付けのためmislocalizationの可能性は、常にある外因性タンパク質としかし、したがって、ライブセルイメージングは結果を確証するために、固定した細胞における内因性POIの免疫染色と組み合わせる必要がある。最後に、生細胞画像化、分析の空間分解能を上げるために、免疫EMと組み合わせることができることに注意する価値がある。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
私たちの仕事は、バイオテクノロジー·生物科学研究評議会によってサポートされています。私たちは、親切にCFP-LC3の発現用プラスミドを私達に供給するための教授吉森保に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
- Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
- Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
- Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
- Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
- Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
- Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
- Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
- Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).
