Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Karakterisering af inflammatoriske reaktioner under intranasal kolonisering med Streptococcus pneumoniae

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/50490
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

Summary

Kolonisering af murine nasopharynx med Streptococcus pneumoniae og den efterfølgende ekstraktion af vedhængende eller rekrutterede celler er beskrevet. Denne teknik indebærer skylning af nasopharynx og indsamling af væsken gennem nares og kan tilpasses til forskellige udlæsninger, herunder differentialcellekvantificering og analyse af mRNA-udtryk in situ.

Abstract

Nasopharyngeal kolonisering af Streptococcus pneumoniae er en forudsætning for invasion i lungerne eller blodbanen1. Denne organisme er i stand til at kolonisere nasopharynxens slimhindeoverflade, hvor den kan opholde sig, formere sig og til sidst overvinde værtsforsvaret for at invadere til andre væv af værten. Etablering af en infektion i de normalt lavere luftveje resulterer i lungebetændelse. Alternativt kan bakterierne spredes i blodbanen, der forårsager bakterieæmi, som er forbundet med højdødelighed 2, ellers fører direkte til udvikling af pneumokok meningitis. Forståelse af kinetik af, og immunrespons på, nasopharyngeal kolonisering er et vigtigt aspekt af S. lungebetændelse infektion modeller.

Vores musemodel af intranasal kolonisering er tilpasset fra menneskelige modeller3 og er blevet brugt af flere forskergrupper i undersøgelsen af værtspatogenresponser i nasopharynx4-7. I den første del af modellen bruger vi et klinisk isoleret S. pneumoniae til at etablere en selvbegrænsende bakteriel kolonisering, der ligner transporthændelser hos voksne mennesker. Den procedure, der er beskrevet heri, indebærer forberedelse af et bakterielt inoculum efterfulgt af etablering af en koloniseringshændelse gennem levering af inoculumet via en intranasal indgiftsmåde. Residente makrofager er den fremherskende celletype i nasopharynx under konstant tilstand. Typisk er der få lymfocytter til stede i uinficerede mus8, men slimhindekolonisering vil føre til lav- til højkvalitetsbetændelse (afhængigt af virulensen af bakteriearterne og stammen), der vil resultere i et immunrespons og den efterfølgende rekruttering af værtsimmunceller. Disse celler kan isoleres af et toilet af trachealindholdet gennem narerne og korreleres med massefylden af koloniseringsbakterier for bedre at forstå infektionens kinetik.

Protocol

Før du begynder: Alle trin udføres i et biofarvejsniveau 2 (BSL2) Biologisk sikkerhedskabinet (BSC), medmindre andet er angivet. Sørg for, at du har opnået den relevante Biohazard Godkendelse til brug af infektiøse bakterielle patogener i henhold til institutionelle retningslinjer forud for påbegyndelsen af forsøgene. Derudover skal du sørge for, at du har alle de materialer og reagenser, der er nødvendige for at udføre proceduren forberedt på forhånd. Mus, der anvendes i disse eksperimenter har inkluderet kvindelige C57BL / 6 mus fra Jackson Laboratories, Charles River eller Taconic og var 10-14 uger (selv om vi ikke har fundet nogen kønsafhængige signifikante forskelle i kinetik af nasal kolonisering clearance eller infektion). Alle mus, der blev anvendt i disse forsøg, blev opdrættet og vedligeholdt under særlige patogenfrie tilstande og var fri for almindelige vira (LCMV, MNV, MPV, reovirus ECTV og andre) bakterier (f.eks. Når du udfører disse eksperimenter, anbefaler vi at bruge kontrolmus ikke yngre end 10-12 uger og ikke ældre end 6 måneder. Mus yngre eller ældre end denne aldersgruppe er mere modtagelige for længere nasopharyngeal transport varighed og øget sandsynlighed for at sprede infektion. Musebaggrund er en anden vigtig overvejelse, der kan påvirke resultaterne af et koloniseringseksperiment, da flere grupper har vist, at mus med forskellige genetiske baggrunde har forskellige modtageligheder for S. pneumoniae D39 (serotype 2) stamme9,10. S. pneumoniae er ikke et naturligt forekommende murinpatogen, og dets eneste naturlige reservoir er den menneskelige nasopharynx. Transmission sker via luftvejsdråber, og da mus ikke producerer åndedrætssløg, kan individuelle mus ikke overføre bakterien til andre mus, så der er ingen bekymring for overførsel fra mus til mus11. For at få et visuelt overblik over de procedurer, der er beskrevet i dette manuskript, henvises til figur 1.

1. Forberedelse af S. pneumoniae Kultur

  1. Pod 5 ml tryptisk soja agar til suspensionsvækst af Streptococcus pneumoniae.
  2. Dyrkning under statiske forhold ved 37 °C i 5% CO2, indtil det bakterielle inoculum når bjælkefasevækst med en tilsvarende væsketæthed på 108 CFU/ml som bestemt ved en kilometertæller indstillet til 600 nm. Den nøjagtige aflæsning, der svarer til denne CFU, vil variere afhængigt af den specifikke valgte bakteriestamme; for de fleste stammer af S. pneumoniae dette svarer til en OD600 interval på 0,45-0,55. Typisk vil S. lungebetændelse stammer i flydende kultur vokse til denne tæthed inden for 1,5-2,5 timer under de anbefalede betingelser, uden behov for subkultering. Kulturen bør ikke have lov til at vokse (ud over en OD-aflæsning på 0,75), da dette repræsenterer det punkt, hvor bakterierne ikke længere er i logfasevækst og gennemgår omfattende autolyse.
  3. Hver mus vil blive podet med ca. 107 bakterier. Derfor, for hver 9 mus, der skal koloniseres, pipette 1 ml inoculum i en Eppendorf rør og spin på 15.000 x g i 1 min. En hvidlig pellet skal være synlig. Supernatanten fjernes, idet man passer på ikke at forstyrre pellet'en og opbruger bakterierne i 100 μl fosfatbufferet saltvand (PBS), hvilket øger koncentrationen til 109 CFU/ml. På dette stadium skal bakterierne forblive levedygtige, men vil ikke let replikere.
  4. Hvis du bruger flere aliquots, kombineres i et rør for at kontrollere for mindre inter-prøve variationer i bakteriel tæthed.
  5. Hold bakterier på is, indtil de er klar til podning, i højst 1 time.
  6. For at opnå et nøjagtigt bakterietal skal du udføre log-wise serier med flot bakteriel inoculum. Serielt fortyndes 10 gange, tilsættes 10 μl på 90 μl steril PBS.
  7. 3 dråber 10 μl prøver af fortyndinger 10-5 - 10-9, plus en pbs-kun forureningskontrol, på separat mærkede dele af tryptisk soja agar (TSA) plade suppleret med 5% fåreblod (Figur 2). Sørg for, at pipettespidserne ændres for hvert trin, der fortyndes fra en højere CFU-koncentration til en lavere CFU-koncentration for at undgå at overføre overskydende bakterier og øge variabiliteten af resultaterne. Humant blod agar (HBA) plader kan også anvendes i stedet for TSA. Da mange stammer af S. pneumoniae er resistente over for neomycin (fra 5-20 μg/ml), kan dette antibiotikum også tilsættes til det valgte agarmedium i pladeforberedelsesfasen. Dette letter optællingen, da det eliminerer ikke-resistente bakterier. Den enkelte stammes antibiotikafølsomhed skal testes på forhånd for at bestemme den optimale koncentration af antibiotika, der skal anvendes for hver bakteriestamme.
  8. Lad det tørre i 15-30 min udækket, derefter dække plader og sted på hovedet i bakteriel inkubator sat til 37 °C og 5% CO2. Vokse op bakterielle kolonier på pladen i 24 timer.
  9. Bestem antallet af kolonidannende enheder og deres tilsvarende koncentration. Baseret på bestemmelse af OD600-værdien skal koncentrationen ligge inden for området 1-4 x 109 CFU/ml. S. lungebetændelseskolonier skal fremstå som små, cirkulære kolonier, en gullig beige i farve, med en lille fordybning i midten, der giver dem et donutlignende udseende (Figur 3).

2. Murine Intranasal kolonisering

  1. Fastholde mus ved at placere dem i en mus restrainer apparat (en modificeret 50 ml Falcon rør med spidsen afskåret for at skabe en blænde) sikre dem ved bunden af deres krop med tommelfingeren, så deres næser bare komme ud af tilspidset ende af fastholdelsesapparat (Figur 4). Brug af dette apparat giver mulighed for immobilisering af musens hoved og adskillelse af dets narer på en måde, der minimerer bevægelse samt forhindrer forsøg fra dyret på at mastikse pipettespidsen, hvilket giver mulighed for fuldstændig levering af inoculumet. Alternativt kan mus immobiliseres via scuffing i nakken og manuel tilbageholdenhed. Vi anbefaler ikke anæstesi af dyrene før intranasal podning. Administration af inoculum til dyr under anæstesi resulterer i, at nogle af inoculumet spredes til lungerne12,13.
  2. Ved hjælp af en P10- eller P20-pipette vaccineres hver mus ved at deponere 10 μl af den forberedte kultur og fordele den jævnt mellem begge narer (lad inoculum dryppe ind i næsen ved gradvist at pulsere podningen og tage tid for mus at indånde inoculum). For at opnå fuldstændig levering af inoculumet begynder pauseadministration på ethvert tidspunkt musen at bevæge næsen overdrevent. Hele inoculumet må ikke injiceres i narerne, da musene kan udvise nogle gennem næsen under udånding; men da den udviste mængde har tendens til at være minimal, og inoculumet indeholder en ekstremt høj mængde bakterier, påvirker dette ikke væsentligt koloniseringen af bakteriebelastningen. Derudover er det overfladeareal, der er tilgængeligt til kolonisering i nasopharyngeal slimhinden, begrænset, og derfor har vi og andre fundet ud af, at den anbefalede 107 dosis er tilstrækkelig til at opnå ensartede niveauer af bakterier i alle mus, hvilket resulterer i minimal variation i de oprindelige mængder koloniserende bakterier14,15 .
  3. Veje mus, hvis du bruger vægtindikatorer som en del af din slutpunktsovervågning. Overvåg mus hver 12-24 timer for kliniske symptomer, herunder sløvhed, pjusket pels og vægttab. Mus vil typisk ikke vise symptomer på sygdom indtil 3-5 dage efter koloniseringen, og disse vil blive efterfulgt af vægttab, som kan i gennemsnit omkring 5% af den samlede kropsvægt om dagen. Efterhånden som musene bliver mere og mere syge, vil de påtage sig hunched stillinger og vise nedsat aktivitet og nedsat lydhørhed over for stimulation, herunder håndtering. På nuværende tidspunkt er sygdom typisk tegn på sepsis og/eller lungebetændelse og vil sandsynligvis være terminal, selv om mus kan behandles med 1 ml subkutan saltvand dagligt for at forbedre resultaterne. Overlevende mus bør begynde at vise forbedring efter dag 7 efter koloniseringen, som det fremgår af stabilisering af vægt efterfulgt af vægtøgning, selv om forskellige stammer af S. pneumoniae kan fremkalde sygdom hurtigere og resultere i progression af kliniske symptomer langs en anden tidslinje. Se figur 5 for et repræsentativt resultat af vægt, der spores hos mus, der er koloniseret med P1547-stammen.

3. Nasal Lavage Prøve Collection

Før du begynder: Forbered kannulerede nåle med 1 ml sprøjter med en 26 3/8 G facetnål. Skær 2,5 cm stykker PE20 polyethylenrør med en indvendig diameter på 0,38 mm, hvilket sikrer, at hver ende har en skrå spids. Brug pincet, skub et 2,5 cm langt stykke PE20 polyethylenrør (indvendig diameter 0,38 mm) på nålespidsen, så du undgår at punktere slangesiden. Cannulated nåle kan opbevares i 70% ethanol indtil det er nødvendigt.

  1. Aflive eksperimentelle mus. Da livmoderhalskræft dislokation potentielt kan skade luftrøret, denne metode til aktiv dødshjælp skal undgås. Vores foretrukne metode er isoflurane anæstesi efterfulgt af exsanguination, dog sikre, at du følger institutionelle retningslinjer, når du vælger form for aktiv dødshjælp.
  2. Brug 70% vandig ethanol, steriliser dyrets superoanterior pels, især halsen, og sørger for at forhindre ethanol i at få adgang til narerne.
  3. Lav et enkelt langsgående snit langs midten af dyrets hals og to vandrette snit i hver ende, hvilket skaber en åbning for at forestille sig luftrøret.
  4. Skræl forsigtigt huden tilbage til begge sider, afslørende nakkevæv nedenunder.
  5. Luftrør skal være synligt, omgivet af langsgående muskler på begge sider. Klip forsigtigt disse for at give et klart overblik over selve luftrøret, og pas på ikke at skære den omgivende vaskulatur.
  6. Hvis vaskulaturen blev skåret, og blodet er til stede, før du fortsætter, skal blødningen stoppe, og derefter rense området flere gange ved at dispensere steril PBS og bruge steril gaze til forsigtigt at opsuge overskydende fugt i området.
  7. Når luftrøret er korrekt eksponeret, foretage en tværgående, semilunar skåret i luftrøret omkring halvvejs op (Figur 6).
  8. Der udtages 1.000 μl steriliseret PBS i en tidligere tilberedt kanyle.
  9. Indsætning af kanylen i luftrøret mod næsen, så den skrå kant holdes nedad for at lette indsættelsen (Figur 7). Når nålen er på plads, roteres den 180°, og sonde forsigtigt opad, indtil du føler lysstyrke.
  10. Placer Eppendorf udpeget til prøvesamling lige under musens næse.
  11. Test korrekt placering af nål ved at dispensere en minimal (~ 20 μl) mængde PBS lavage væske - dråbe væske skal dannes omkring nares af musen; hvis dette er tilfældet, skal du gå videre til trin 3.13).
  12. Hvis test PBS viser sig direkte ud af dyrets munding, skal du trække kanylen tilbage og flytte ved igen forsigtigt at sondere fremad, indtil der mærkes meget let modstand - pas på ikke at skubbe kanylen for langt forbi denne modstand, da du vil flytte den forbi næse ganen og igennem til mundhulen.
  13. Dispenser indholdet af nålen hurtigt for at hjælpe med at fortrænge og indsamle maksimal mængde celler - indholdet skal strømme ud gennem musens nares og ind i opsamlingsrøret. Placer prøven med det samme på is.
  14. For at indsamle prøver til RNA-analyse gentages trin 3.8-3.13) ved hjælp af en kanyleret nål, der indeholder 500 μl RNA lysis buffer på samme mus. Dette vil gøre det muligt at indsamle lysatprøve fra de resterende cellepopulationer, der hovedsagelig består af nasopharyngeal slimhindeepitelet, da ikke-klæbende celler burde have været fjernet efter det oprindelige PBS-lavage. Bemærk, at RNA lysis bufferen vil denudere epitelet og ødelægge det omgivende væv, så man skal være forsigtig for at undgå kontakt med organer som lungerne, hvis det ønskes at tilbageholde disse væv. Når prøven er indsamlet, anbringes prøven i RNA lysis buffer direkte på tøris for at fastfryse. Når prøverne er i lysisbuffer, kan de opbevares i henhold til fabrikantens anvisninger og er typisk stabile ved -70 °C i flere måneder.

4. Bestemmelse af bakteriel belastning i Nasopharynx

  1. Kvantitere bakterier ved at forberede en seriel fortynding serie for hver murine nasal lavage prøve. Generelt kan bakteriebelastning forventes at være mellem 0-104 CFU, derfor foretage tre 10-fold serielle fortyndinger. Der tilsættes 10 μl af den pæne næseprøve (100 CFU/ml) til det første rør til en koncentration på10-1 CFU/ml. Vortex grundigt.
  2. Bakteriologisk plade opdeles i kvadranter, og etiketter kvadranter hver med et medlem af fortyndingsserien (100-10-3 CFU/ml). 3 dråber 10 μl prøver af de 3 fortyndinger og den pæne prøve på tryptiske sojaplader suppleret med 5% fåreblod, som i figur 2.
  3. Lad det tørre i 15-30 min udækket, derefter dække plader og sted på hovedet i bakteriel inkubator med optimale betingelser for bakteriel vækst (typisk 37 °C og 5% CO2).
  4. Vokse op bakterielle kolonier på tallerkenen i 18-24 timer.
  5. Det bestemmes, hvor mange koloniserende bakterier der er dannet på tallerkenen for hver fortynding (Figur 3). Figur 8 demonstrerer bakterietæthed under forskellige tidspunkter, som bestemt af kultur af nasal lavages, hos mus koloniseret med 3 forskellige stammer af S. pneumoniae i op til 21 dage.

5. Forberedelse af prøver til flowcytometer

Før du begynder: Forbered blanding af antistoffer. Til kvantificering af leukocytpopulationer anbefaler vi følgende blanding ved de angivne fortyndinger: PE-Ly6G (klon 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (klon AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (klon 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (klon PM8 RUO, 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5,5-CD11c (klon N418 RUO 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (klon M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (klon 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (klon GK1.5, 6,67 μg/ml). Bemærk, at denne blanding er 2x koncentration (se trin 5.5). Alle antistoffer skal fortyndes i FACs Wash buffer (0,5% føtal kalv serum, 2mM EDTA, 0,1% natrium azid i PBS), som også bør fremstilles på forhånd. I en blanding af isotype matchede kontrolantistoffer, ideelt set fra samme leverandør som de mærkede antistoffer og i samme koncentrationer som de specifikke antistoffer, bør der fremstilles. De prøver, der behandles med isotypekontrolantistofferne, vil fungere som negativ kontrol. Enhver fluorescens, der observeres i de prøver, der er behandlet med isotypekontrolantistofferne, bør betragtes som baggrund.

  1. Prechill en centrifuge, der kan dreje 1,5 ml Eppendorf-rør til 4 °C.
  2. Centrifuge nasal lavage prøver ved 2.000 x g i 10 min ved 4 °C. Pipette forsigtigt supernatant ud og reserver. Bemærk: På grund af den lille mængde celler i nasopharynx vil cellepillen ikke være synlig, medmindre der er uønsket forurening af røde blodlegemer, som vil lyse rødt. Hvis dette ses, skal prøven kasseres.
  3. Genbrugt prøve i 50 μl af Fc? RIIb/CD16-2 (2.4G2) antistof (som binder Fc-receptorer og reducerer uspecifik antistofbinding) i FACs Wash Buffer ved en koncentration på 4 μg/ml.
  4. Inkuber prøve på is i 30 min.
  5. Der tilsættes 50 μl præpareret 2x koncentreret fluorescerende antistofblanding til prøve. Der udtages en repræsentativ prøve fra hver forsøgsgruppe, som skal fungere som isotypekontrol. Isotypeantistofblandingen tilsættes til denne prøve i stedet for pletblanding.
  6. Inkuber prøve på is i 1 time.
  7. Centrifugeprøver ved 2.000 x g i 10 min ved 4 °C. Supernatant kasseres og genbruges i 200 μl PBS.
  8. Gentag trin 5.7.
  9. Efter den anden vask udtages centrifugeprøverne igen ved 2.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  10. Genbruges enten i PBS (hvis der straks udtages prøver) eller 2% paraformaldehyd (hvis prøverne køres 1-3 dage efter farvningen).
  11. Ved udførelse af flowcytometry opsamles den maksimale mængde hændelser pr. prøve, eller indtil hele prøven er blevet indsugning. Hos uinficerede, sunde, unge mus vil dette være så lidt som 1.000-2.000 samlede begivenheder; Under en bakteriel kolonisering begivenhed, dette antal kan stige mere end 2-til-5-fold afhængig af sygdomsstatus hos dyr og faktorer som alder og genetisk baggrund. Figur 9 viser repræsentative flowcytometriresultater indsamlet fra et 3-laser Becton Dickenson LSRII flowcytometer ved hjælp af en fremadgående scatter på 450 og side scatter på 300, selvom vi anbefaler at optimere parametre for det specifikke flowcytometer, du har til hensigt at bruge før prøveindsamling. Bemærk: Hvis en prøve indeholder lige spormængder af blodforurening, vil de samlede indsamlede hændelser være betydeligt højere end forventet, og prøven bør diskonteres fra analysen.

6. Kvantitativ PCR (qPCR) Analyse af Nasal Lavages

  1. Optø celle lysater fra trin 3.14 stuetemperatur.
  2. Følg den anbefalede protokol, der følger med den foretrukne RNA-udtrækning af valg.
  3. Efter at have afsluttet RNA-ekstraktionsproceduren som anvist kvantificere mængden af RNA ved hjælp af et spektrofotometer eller elektroforesebaseret metode (figur 10). Vi opnår rutinemæssigt mellem 975 og 3.250 ng samlet RNA pr. prøve med et 260/280 nm forhold på >1,7 eller et RNA-integritetsnummer (RIN) omkring, 8.1±0.13.
  4. Transskribere cDNA ved hjælp af M-MULV Reverse Transcriptase i henhold til producentens protokol med 1.000 ng RNA (højst 13 μl).
  5. Der fortyndes cDNA-prøver 8x, og der tilsløres ligeledes i 4 separate rør til langtidsopbevaring ved -20 eller -80 °C.
  6. For at måle genekspression med qPCR skal du forberede 25 μl prøver reaktioner i tre eksemplarer på is eller kold blok, der indeholder: 12,5 μl af 2x qPCR master mix fra qPCR kit efter eget valg, 0,25 μl referencefarvestof, 2 μl fortyndet cDNA (trin 7.5), 1 μl blandede fremad- og bakprimtalere (400 nM endelig), 9,25 μl RNAse-DNAse frit vand. Denne protokol er en tilpasning af tidligere udgivne metoder16.
  7. Generelt finder vi, at en totrins qPCR-forstærkning (95 °C i 10 minutter efterfulgt af op til 40 cyklusser x [95 °C x 15 sek., 60 °C x 1 min]) er effektiv(figur 11a); Hvert primerpar skal dog optimeres. Dissociationskurver (smeltningskurver) skal udføres efter forstærkning for at sikre, at der ikke forekom nogen uspecifik forstærkning. forstærkning(figur 11b)
  8. Vi kører rutinemæssigt standardkurver for hvert analyseret gen samt en standardkalibrator (afledt af lunge- eller milt homogenat) for hver analyseret 96-brønds plade. Relative transskriptionsmængder opnås ved først at normalisere rå cyklustærskelværdier (Ct) ved hjælp af referencefarvet og omdanne de resulterende værdier gennem den respektive standardkurve. Disse relative mængder normaliseres efterfølgende til standardkalibratoren og et husholdningsgen, alt efter hvad der er relevant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 repræsenterer en oversigt, der opsummerer protokollens hovedtrin. Figur 2-3 giver visualisering af den mikrobiologiske metode, der er forbundet med de protokoller, der er beskrevet heri. Figur 4 repræsenterer korrekt placering af en mus til at udføre en intranasal kolonisering, mens figur 5 skildrer typisk ændringer i vægten af mus koloniseret med S. lungebetændelse stamme P1547. Figur 6-7 repræsenterer specifikke stadier af den nasale lavage del af processen, for assisteret visualisering af disse to teknikker. Figur 8-11 består af repræsentative resultater af analyser foretaget på prøver indsamlet fra en muss nasopharynx efter nasal lavage. Konkret figur 8 er et repræsentativt resultat af bakteriel belastning i nasopharynx, som bestemmes gennem dyrkning af nasal lavages opnået fra mus koloniseret enten med S. lungebetændelse stamme P1121, P1547 eller P1542. Figur 9 repræsenterer cellefenotyping af isolerede nasopharyngeale immunceller ved hjælp af flow cytometriske teknikker. Figur 10-11 viser repræsentative resultater vedrørende ekspressionel analyse af nasopharyngeal mRNA via kvantitativ PCR.

Figure 1
Figur 1. Rutediagram over intranasal podning og nasal lavage celle isolation procedurer ved hjælp af en mus model. For det første er bakterierne forberedt til podning, og derefter gives til murin emner intranasally. Efter den ønskede tidstid aflives mus via terminalblødning, og deres nasopharyngeal celler isoleres via to nasale lavage trin: et PBS-vasketrin efterfulgt af en sekundær vask i RNA lysis buffer. Cellerne fra den indledende PBS-vask isoleres og analyseres ved hjælp af flowcytometriteknikker, mens RNA isoleret fra den anden prøve kan bruges til at undersøge den relative overflod af molekyler af interesse på transskriptionsniveau.

Figure 2
Figur 2. For at bestemme bakteriekoncentrationen er 10 μl dråber belagt i tre eksemplarer på en plade opdelt i sektioner, der repræsenterer en anden seriel fortynding. Disse dråber får derefter lov til at tørre, og pladerne inkuberes natten over ved 37 °C, 5% CO2.

Figure 3
Figur 3. Koncentration af Streptoccous pneumoniae isoleret fra nasopharynx af et repræsentativt dyr. Hver diskret koloni repræsenterer en kolonidannende enhed, hver samling af kolonier repræsenterer en 10 μl dråbe (belagt med tre eksemplarer), og hver kvadrant på pladen repræsenterer en separat seriel fortynding. Bakteriekoncentrationen bestemmes i CFU/ml ved at beregne gennemsnittet af antallet af tællelige, fuldt dannede kolonier inden for og derefter mellem kvalificerende kvadranter.

Figure 4
Figur 4. Bevægelsen af enhver mus, der skal vaccineres, skal minimeres, især i nakken, for at give mulighed for korrekt levering af bakteriel inoculum. For at opnå dette fastholdes forsøgsmusen i et modificeret begrænsningsapparat bestående af et 50 ml Falcon-rør med en blænde i den koniske ende. Musen er derefter placeret, så dens næse kommer ud af blænden, hvor den kan tilgås af forskeren, så intranasal podning kan udføres.

Figure 5
Figur 5. Vægten af mus koloniseret med stamme P1547 fra mindst 2 repræsentative eksperimenter spores dagligt efter indledende podning (n = 6) til at skildre typiske ændringer i vægt forventes efter nasopharyngeal kolonisering. Vægt vises som en procentvis ændring af den oprindelige vægt. Bemærk det forventede kraftige indledende vægttab set mellem dag 3-5, efterfulgt af stabilisering og gradvis stigning i vægt hos overlevende mus.

Figure 6
Figur 6. Ved tracheal eksponering fjernes flankerende langsgående muskler omhyggeligt før trachealt snit på en måde, der ikke alvorlige de omkringliggende blodkar. En lille, semilunar snit er derefter lavet halvvejs op luftrøret ved hjælp af fine kirurgiske saks. Det er vigtigt at skære gennem diameteren af luftrøret kun delvist, forlader det intakt posteriorly.

Figure 7
Figur 7. Indsættelse af den kannulerede nål i luftrørets blænde opad mod næsen. Når kanylen er på plads, sonde forsigtigt, indtil modstanden er opfyldt, derefter skylle indholdet ud gennem nares.

Figure 8
Figur 8. En repræsentativ serie bakteriebelastning isoleret fra nasopharynx ved hjælp af næsedosisproceduren beskrevet efter kolonisering af C57BL/6 mus (trekanter) med S. pneumoniae stamme P1547 (A), P1542 (B) eller P1121 (C). En komparativ kolonisering af BALB/C-mus (cirkler) efter P1121-koloniseringen vises også i (C). Forskellige tidspunkter vises i løbet af koloniseringen, herunder dag 3, 7, 14 og 21. Generelt forventes en høj startbelastning på dag 3, med ringe formindskelse på dag 7. Clearance er typisk indledt af dag 14, med fuld eller næsten fuld clearance dokumenteret ved dag 21 efter kolonisering med de fleste stammer. Klik her for at få vist en større figur.

Figure 9
Figur 9. Repræsentativ histogram (A) og prik plot (B) af samlede celler isoleret fra murine nasal lavages som analyseret af flow cytometry. Differentialudtrykket af markører på cellepopulationer gør det muligt at identificere leukocytundersæt ved brug af fluorescerende antistoffer rettet mod disse proteiner. Som vist her vælges leukocytpopulationer ved først at gating på singlet-celler ved hjælp af en fremadskudt punktport (område) versus fremadskudt (bredde)(A)og derefter berige for CD45+-celler i det pågældende undersæt (B). Denne population kan yderligere opdeles i specifikke celletyper ved at gating for CD11b og Ly6G dobbelt positive neutrofiler (C). Analyse af CD11b-populationen kan udføres for at afsløre F4/80+, CD11b-makrofager (D) eller CD11b-, CD3 og CD4 dobbelt positive CD4 T-celler (E). Cellepopulationer kan fænotyperes, så længe de udtrykker enten en eller en kombination af flere unikke overfladereceptorer, der kan bruges til at skelne dem fra andre celletyper. Klik her for at få vist en større figur.

Figure 10
Figur 10. Repræsentativt elektrofemogram efter elektroforese automatisk sekventering af en prøve isoleret fra murin nasal lavages. Det resulterende elektropherogram viser kvantificeringsdataene og den karakteristiske signatur for en total RNA-prøve af høj kvalitet, der stammer fra nasopharyngeal-regionen. Ved gennemførelse af analyser af det samlede RNA anvendes områderne under RNA-toppe for de to store ribosomale RNA, 18S og 28S, til at beregne deres tilsvarende forhold. Væsentlige ændringer i forholdet mellem toppe, der kan henføres til 18S og 28S, er typisk tegn på forringet RNA. Graden af nedbrydning kan opsummeres ved RNA-integritetsnummer (RIN); RIN for denne repræsentative prøve er 8.1. Et eksempel på stærkt nedbrudt RNA er vist i (B) og (C), og den efterfølgende RIN er henholdsvis 1,9 og 4,6. Klik her for at få vist en større figur.

Figure 11
Figur 11. Forstærkningsplot (A) og dissociationskurve (B) fra qPCR-analyse af nasal vaskcelle lysater, hvilket giver et eksempel på, hvordan disse to udlæsninger typisk skal se ud efter en effektiv og korrekt påvist forstærkning af mRNA-produkter isoleret fra murine nasopharynx. Repræsenteret er en standardkurve for husholdningsgenet 18S. De resultater, der vises i (A), viser det ønskede PCR-produkt efter forstærkning ved hjælp af primere mod GAPDH. Linjen repræsenterer cyklustærsklen (Ct). Det punkt, hvor forstærkningsområderne svarende til forskellige prøver krydser denne tærskel, gør det muligt at sammenligne dem på tværs af stikprøver med lavere værdier svarende til større mængder RNA af interesse indeholdt heri. Observationsområdet i (B) viser, at qPCR-produktets maksimale smeltetemperatur er 85 °C, og at der ikke findes kontaminerende produkter i denne reaktion, som ville vise sig at være en ekstra top, der er adskilt fra den ønskede produkttop. Klik her for at få vist en større figur.

Navn på stamme Serotype Virulens Dødelighed hos mus Forventet koloniseringsvarighed
P1121 23F Asymptomatisk 0% 21-28 dage
P1542 4 lav 0-20% 21-28 dage
P1547 6A mid 20-50% 14-21 dage
D39 2 høj 70-100% 14-21 dage

Tabel 1. En tabeloversigt over 4 almindeligt anvendte S. pneumoniae kliniske isolere stammer, deres tilsvarende serotype nummer, tilhørende grad af virulens, forventet andel af invasivitet inden for en koloniseret delmængde af mus og typisk varighed af en nasopharyngeal kolonisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse præsenterede vi detaljerede metoder til intranasal kolonisering af mus ved hjælp af en klinisk isolere stamme af Streptococcus pneumoniae og den efterfølgende isolation og karakterisering af immuncellerne rekrutteret til nasopharynx som reaktion på bakterierne. Vi demonstrerede, hvordan et bakterielt inoculum kan dyrkes i næringsrige medier og bruges til at etablere en koloniseringsbegivenhed hos mus, som oprindeligt er begrænset til nasopharynx. Vi viste derefter, hvordan reagerende immuncelletyper, der rekrutteres til nasopharynx, kan isoleres efter tracheal eksponering, snit og et næsetør ved hjælp af en cannulated nål. Nasal lavage prøver kan indsamles i PBS at isolere intakte, let vedhængende celler; RNA'et fra mere tætsiddende celler og det omgivende epitelslimkosale lag kan isoleres ved at anvende en sekundær vask bestående af RNA lysis buffer. Førstnævnte af disse prøver kan derefter bruges til at fænotype de specifikke celler rekrutteret i forbindelse med koloniseringen via flow cytometry teknikker, mens sidstnævnte kan anvendes til Q-PCR analyse, til at bestemme effektor funktioner af disse rekrutterede celler ved at se på transskriptionelle udtryk for immunregulatorer af interesse. Nasal lavage prøver kan desuden bruges til at bestemme kinetik clearance af en bakteriel kolonisering begivenhed sammenligne forskellige eksperimentelle grupper til at løse specifikke forskningsspørgsmål.

Udnyttelse af denne metode til intranasal kolonisering giver mulighed for etablering af en koloniseringsbegivenhed, der oprindeligt er begrænset til dyrets nasopharynx. Enhver efterfølgende spredning af bakterierne til blodet eller organerne sker derfor sekundært i forhold til brud på immunforsvaret lokaliseret i nasopharyngeal slimhinden. Den trinvise progression opnået gennem denne model afspejler mere præcist processen med pneumokcocal invasion hos mennesker, så man kan studere dynamikken mellem de koloniserende bakterier og værten nasal slimhinde - og måske bedre forstå skift i bakteriel patogenitet og / eller vært immunitet, der giver mulighed for udvikling af spredning af sygdom. Dette er i modsætning til modeller, der giver afkald på etablering af en indledende kolonisering begivenhed og vælger at studere invasiv sygdom isoleret gennem direkte levering af bakteriel inoculum til lungerne via intratrachael instillation, til blodet via vaskulær injektion eller til peritoneum via peritoneal injektion.

Gennemførelse af en PBS nasal lavage efter en kolonisering begivenhed giver mulighed for isolering af ikke-eller mildt vedhængende celler rekrutteret til nasopharynx, samt eventuelle mucosally-associerede bakterier. Det skal dog bemærkes, at denne teknik er begrænset, da den ikke frigiver celler eller bakterier, der har rejst mellem eller under epitelet, og det vil heller ikke give mulighed for høst af celler eller bakterier, der er lokaliseret til det nasal-associerede lymfoidvæv (NALT), et lymfoidorgan, der er rapporteret at være et potentielt infektionssted efter en pneumokok kolonisering17,18. Hvis yderligere undersøgelse af NALT ønskes, anbefaler vi mikrodissection og fjernelse af dette væv engros til undersøgelse efter PBS nasal lavage; da disse to teknikker ikke udelukker hinanden, kan de udføres på samme dyr. På grund af RNA-høsttrinnets lytiske og destruktive karakter (det sekundære ærinde ved hjælp af RNA lysis buffer) bør dette trin dog udelades, hvis det har til hensigt at høste NALT. Selv om næsegødningen er en mindre teknisk udfordrende procedure, for grupper, der ønsker at opnå en mere omfattende vurdering af bakteriebelastning, der omfatter ikke kun mucosally-associerede bakterier, men også dem, der har invaderet nasopharyngeal væv, foreslår vi at høste nasopharyngeal væv efter fjernelse af den øverste kranieknogle af koloniserede mus og dissektion af vævet i næsekonchae, som beskrevet af andre19.

Arten af et fremkaldt immunrespons afhænger af samspillet mellem vært og patogen. Over 90 serotyper af S. pneumoniae er blevet karakteriseret til dato, alle med forskellige niveauer af patogenitet og virulensfaktorudtryk, hvilket resulterer i differentialprævalens i den menneskelige befolkning20-23. Tilsvarende er det hos mus blevet rapporteret, at omfanget af og kinetik forbundet med immunresponset fremkaldt som reaktion på en nasopharyngeal kolonisering er afhængig af selve koloniseringsstammen24. Således er udvælgelse af en passende stamme til at bruge til etablering af en nasopharyngeal kolonisering ikke en triviel sag, og heller ikke udvælgelse af musens genetiske baggrund. Figur 8 indeholder stikprøvedata, der viser kinetik af clearance af en nasopharyngeal kolonisering fra 3 forskellige S. lungebetændelse stammer efter intranasal kolonisering af kvindelige mus på en C57BL / 6 baggrund. Tabel 1 giver et overblik over graden af virulens og længden af den forventede koloniseringstid (ved anvendelse på C57BL/6-baggrunden) med 4 S. lungebetændelse kliniske isolerestammer, der er beskrevet i litteraturen og kendt for at kunne etablere en nasopharyngeal kolonisering25: den avirulente P1121 (serotype 23F)26,27 lav virulens P1542 (serotype4) 28, mid-virulens P1547 (serotype 6A)29-31, og den udbredte, velkarakteristret, meget virulent D39 (serotype 2)32-36. Hvis det eksperimentelle mål er strengt at studere en asymptomatisk nasal kolonisering begivenhed uden ledsagende bakteriel formidling til andre væv, anbefaler vi brug af den avirulente P1121 stamme, som er karakteriseret som en potent kolonisator, som længere kolonisering begivenheder (op til 28 dage før observeret clearance) er kendetegnende for denne stamme. Typisk mus koloniseret med P1121 vil ikke løbe nogen risiko for invasiv sygdom og vil vise nogen kliniske indikatorer for sygdom (med undtagelse af midlertidigt vægttab). Resten af stammerne bør anvendes afhængigt af den ønskede grad af virulens og tilhørende dødelighed, med virulens, der ikke betyder den infektionsgrad, der udvikler sig i en individuel mus, men snarere andelen af mus, der viser kliniske tegn på sygdom. Det skal også bemærkes, at typisk, graden af virulens korrelerer omvendt med længden af kolonisering varighed, med mere virulent stammer kolonisere i en kortere periode. Alle 3 af de beskrevne virulent stammer fører til dødelighed hos mus på grund af, oftest, sepsis, med fulminant lungebetændelse, eller samtidig lungebetændelse og sepsis udvikle sig i en delmængde af mus. Forskellene i lokalisering af invasive bakterier kan være stammespecifikke, da det tidligere er blevet rapporteret, at visse stammer viser tropismer for bestemte organer37. I en lille procentdel af dyr kan spontan meningitis også udvikle sig efter kolonisering. Bestemmelse af dødsårsagen samt graden af invasivitet kan opnås ved indsamling af tilhørende væv (lunger, milt og/eller hjerne) fra dyr ved slutpunktet. Homogenisering af disse væv og efterfølgende plating kan indikere tilstedeværelsen af invasive bakterier og tilsvarende bryster.

Et eksempel på en bakteriel dyrkningstæthed kvantificering er vist i figur 3. Hvis kulturen er for koncentreret, kolonier vokse for tæt til at blive individuelt tælles, men kolonier stammer fra enkeltceller kan skelnes, hvis en log-klog fortynding serie er forgyldt. Plating tre tekniske replikater pr fortynding minimerer variation. Bemærk, at når man kvantificerer bakterier hentet fra en nasal koloniseringshændelse, kan man støde på cokulturelle forurenende stoffer, der repræsenterer andre bakteriearter, der samtidig isoleres fra murine nasopharynx. Hvis bakteriestammen af interesse har nogen kendt antibiotikaresistens (for eksempel mange stammer af S. lungebetændelse er resistente over for gentamycin eller neomycin op til 5 μg/ml), kan man minimere forekomsten af forurenende stoffer ved at supplere vækstmedierne med antibiotika i en passende koncentration og derved begrænse forurenende vækst.

Flow cytometry kan bruges til at analysere celleoverflade markører på nasal lavage prøver. For eksempel kan en blanding af antistoffer, der er specifikke for bruttodifferentiering af leukocytter, herunder makrofager (F4/80+), neutrofiler (CD11b+ og Ly6G+) og T-celler (CD3+ og CD4+ eller CD8+), f.eks. Desuden kan disse analyser kombineres med flowcytometrisk analyse udført på forskellige væv eller blod for bedre at forstå handel med immunceller i løbet af en infektion. På grund af det begrænsende antal celler (typisk nummerering i de lave tusinder), der kan isoleres fra nasopharynx, er det typisk udfordrende at identificere sjældne undersæt, selvom forskere, der ønsker at opnå dette, bør overveje at samle prøver fra flere mus for at opnå det ønskede celletal. Da der desuden kan udtrækkes et begrænset antal celler fra dette område, anbefaler vi, at du analyserer disse data med hensyn til det samlede antal celler.

Selvom proteinudtryksniveauerne typisk er lave i nasopharynx, der begrænser muligheden for at analysere proteinproduktionen, er det muligt at analysere produktionen af værtsmolekyler som reaktion på de koloniserende bakterier på RNA-niveau. For at opnå dette kan nasal lavages udføres ved hjælp af RNA lysis buffer i stedet for PBS, som giver mulighed for analyse af genekspression. Ved qPCR-forstærkningsdetektion er det vigtigt at køre en tilsvarende dissociationskurve (figur 11) for at sikre, at det korrekte og ønskede produkt blev opdaget. Dette skyldes det faktum, at analysen vil opdage enhver dobbelt strandet DNA, herunder primer dimers, forurenende DNA, og PCR produkt fra misannealed primer.

Vi håber, at de metoder, der er beskrevet her, vil opfordre dig til at anvende en intranasal koloniseringsmodel til at studere værtsresponser på patogener, der er vigtige i forbindelse med denne understudiede region. For visse menneskelige patogener, såsom S. pneumoniae, en forudgående nasopharyngeal kolonisering begivenhed fungerer som en vigtig forløber for efterfølgende bakteriel formidling og den fatale sequelae, der kan følge, herunder formering i lungerne, som kan føre til lungebetændelse, eller andet til blodet, og deraf følgende bakterie og septisk chok. Således kan vi ved at studere bakteriel kolonisering i denne region forstå bedre, hvordan man kontrollerer det og forhindrer mere seriøs patologi i at forekomme helt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Jeffery Weiser fra University of Pennsylvania for hans gave af de kliniske stammer af Streptococcus pneumoniae. Dette arbejde blev finansieret af den canadiske Institutes for Health Research. CV blev finansieret af et M. G. DeGroote stipendium og et stipendium fra canadian Thoracic Society. Dette arbejde blev finansieret af Ontario Lung Association og Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Arbejdet i det buede laboratorium støttes delvist af michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research og McMaster Immunology Research Centre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1 ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  2. Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
  3. McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
  4. Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
  5. van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
  6. Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
  7. Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
  8. McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
  9. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
  10. Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
  11. Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  12. Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
  13. Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
  14. Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
  15. Wu, H. -Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  16. Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
  17. Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
  18. Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
  19. Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
  20. Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
  21. Bryant, W. P., J,, et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  22. Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
  23. Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
  24. Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
  25. Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  26. Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
  27. Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
  28. Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
  29. Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
  30. Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
  31. Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
  32. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  33. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  34. Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
  35. Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
  36. Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
  37. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  38. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
  39. Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).

Tags

Immunologi Streptococcus pneumoniae Nasal lavage nasopharynx murine flow cytometry RNA Kvantitative PCR rekrutterede makrofager neutrofiler T-celler effektorceller intranasal kolonisering
Karakterisering af inflammatoriske reaktioner under intranasal kolonisering med <em>Streptococcus pneumoniae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, … More

Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter