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Immunology and Infection

स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया के साथ इंट्रानासाल उपनिवेशीकरण के दौरान भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का लक्षण वर्णन

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/50490
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

Summary

स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया के साथ मुरीन नासोफेरिंक्स का उपनिवेशीकरण और अनुयायी या भर्ती कोशिकाओं के बाद की निकासी का वर्णन किया गया है। इस तकनीक में नासोफेरिनक्स को फ्लश करना और नरों के माध्यम से तरल पदार्थ का संग्रह करना शामिल है और विभिन्न रीडआउट के लिए अनुकूलनीय है, जिसमें अंतर कोशिका मात्राकरण और सीटू मेंएमआरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण शामिल है।

Abstract

स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया द्वारा नासोफेरिंजियल उपनिवेशीकरण फेफड़ों या खून के बहाव पर आक्रमण करने के लिए एक शर्त है1। यह जीव नासोफेरिनक्स की म्यूकोसल सतह को उपनिवेश बनाने में सक्षम है, जहां यह मेजबान के अन्य ऊतकों पर आक्रमण करने के लिए मेजबान सुरक्षा को गुणा और अंततः दूर कर सकता है। सामान्य रूप से निचले श्वसन तंत्र में संक्रमण की स्थापना के परिणामस्वरूप निमोनिया होता है। वैकल्पिक रूप से, बैक्टीरिया रक्तधारा में फैल सकता है जिससे जीवाणु होता है, जो उच्च मृत्यु दर2से जुड़ा होता है, या फिर सीधे न्यूमोकोकल मेनिनजाइटिस के विकास के लिए नेतृत्व करता है। कीइनेटिक्स को समझना, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए, नासोफेरिंजियल उपनिवेशीकरण एस निमोनिया संक्रमण मॉडल का एक महत्वपूर्ण पहलू है।

इंट्रानासल उपनिवेशीकरण के हमारे माउस मॉडल को मानव मॉडल3 से अनुकूलित किया गया है और इसका उपयोग कई शोध समूहों द्वारा नासोफेरिंक्स4-7में मेजबान-रोगजनक प्रतिक्रियाओं के अध्ययन में किया गया है। मॉडल के पहले भाग में, हम एस निमोनिया के एक नैदानिक आइसोलित का उपयोग एक आत्म सीमित जीवाणु उपनिवेशीकरण है कि मानव वयस्कों में गाड़ी की घटनाओं के समान है स्थापित करने के लिए । यहां विस्तृत प्रक्रिया में एक जीवाणु इनोकुलम तैयार करना शामिल है, जिसके बाद प्रशासन के एक इंट्रानैसल मार्ग के माध्यम से इनोकुलम के वितरण के माध्यम से उपनिवेशीकरण घटना की स्थापना होती है। निवासी मैक्रोफेज स्थिर स्थिति के दौरान नासोफेरिंक्स में प्रमुख कोशिका प्रकार हैं। आमतौर पर, असंक्रमित चूहों8में कुछ लिम्फोसाइट्स मौजूद होते हैं, हालांकि म्यूकोसल उपनिवेशीकरण कम से उच्च ग्रेड सूजन (बैक्टीरियल प्रजातियों और तनाव की उग्रता के आधार पर) का कारण बनेगा जिसके परिणामस्वरूप प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बाद की भर्ती होगी। इन कोशिकाओं को नाड़ों के माध्यम से श्वासनली सामग्री के एक लाव्ज द्वारा अलग किया जा सकता है, और संक्रमण के काइनेटिक्स को बेहतर ढंग से समझने के लिए उपनिवेशीकरण बैक्टीरिया के घनत्व से सहसंबद्ध किया जा सकता है।

Protocol

शुरू करने से पहले: सभी कदम बायोहैजार्ड स्तर 2 (बीएसएल 2) जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में किए जाते हैं जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है। कृपया सुनिश्चित करें कि आपने प्रयोगों की शुरुआत से पहले संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार संक्रामक जीवाणु रोगजनकों के उपयोग के लिए उपयुक्त बायोहैजार्ड अनुमोदन प्राप्त किया है। इसके अतिरिक्त, कृपया सुनिश्चित करें कि आपके पास पहले से तैयार प्रक्रिया का संचालन करने के लिए आवश्यक सभी सामग्री और अभिकर् थ हैं। इन प्रयोगों में इस्तेमाल चूहों जैक्सन प्रयोगशालाओं, चार्ल्स नदी या Taconic से महिला C57BL/6 चूहों को शामिल किया है और उंर के 10-14 सप्ताह थे (हालांकि हम नाक उपनिवेशीकरण निकासी या संक्रमण के काइनेटिक्स में किसी भी लिंग पर निर्भर महत्वपूर्ण अंतर नहीं मिला है) । इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले सभी चूहों को विशिष्ट-रोगजनक मुक्त परिस्थितियों में पैदा और बनाए रखा गया था, और आम वायरस से मुक्त थे, (एलसीएमवी, एमएनएवी, एमपीवी, रीवायरस ईसीटीवी, और अन्य) बैक्टीरिया(जैसे एच पाइलोरी)और परजीवी(जैसे पिनवार्म, एक्टोपैरासाइट्स) मल नमूना परीक्षण के साथ-साथ प्रहरी चूहों के लगातार शारीरिक मूल्यांकन के साथ-साथ प्रहरी चूहों के लगातार शारीरिक मूल्यांकन उनके कमरे के भीतर। इन प्रयोगों का संचालन करते समय, हम नियंत्रण चूहों का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो 10-12 सप्ताह की उम्र से कम नहीं है और 6 महीने से अधिक उम्र का नहीं है। इस आयु सीमा से छोटे या पुराने चूहों को लंबे समय तक नासोफेरिंजियल कैरिज अवधि और संक्रमण के प्रसार की संभावना में वृद्धि के लिए अधिक संवेदनशील होते हैं। माउस पृष्ठभूमि एक और महत्वपूर्ण विचार है जो उपनिवेशीकरण प्रयोग के परिणामों को प्रभावित कर सकता है, क्योंकि कई समूहों ने दिखा दिया है कि विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चूहों में एस निमोनिया डी 39 (सेरोटाइप 2) तनाव9,10के लिए अलग-अलग संवेदनशीलताएं हैं। एस निमोनिया एक स्वाभाविक रूप से होने वाली मुरीन रोगजनक नहीं है और इसका एकमात्र प्राकृतिक जलाशय मानव nasopharynx है । संचरण श्वसन बूंदों के माध्यम से होता है, और चूहों के रूप में श्वसन स्राव का उत्पादन नहीं करते हैं, व्यक्तिगत चूहों जीवाणु को अन्य चूहों को संचारित नहीं कर सकते हैं, इसलिए माउस-टू-माउस ट्रांसमिशन11के लिए कोई चिंता नहीं है। इस पांडुलिपि के भीतर वर्णित प्रक्रियाओं के दृश्य अवलोकन के लिए, कृपया चित्र 1 का उल्लेख करें।

1. एस निमोनिया संस्कृति की तैयारी

  1. स्ट्रेप्टोकोकस निमोनियाके निलंबन वृद्धि के लिए 5 मिलीलीटर ट्राइप्टिक सोया एगर टीका लगाएं ।
  2. 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर परिस्थितियों में संस्कृति जब तक बैक्टीरियल इनोकुलम 10 8 सीएलयू/एमएल के इसी तरल घनत्व के साथ लॉग चरण वृद्धि तक नहींपहुंचता है जैसा कि 600 एनएम के लिए एक ओडोमीटर सेट द्वारा निर्धारित किया गया है। इस सीएलयू के अनुरूप सटीक पढ़ना विशिष्ट चयनित बैक्टीरियल तनाव के आधार पर अलग होगा; एस निमोनिया के अधिकांश उपभेदों के लिए यह0.45-0.55 की एक ओडी 600 रेंज से मेल खाती है। आमतौर पर, तरल संस्कृति में एस निमोनिया उपभेदों की सिफारिश की शर्तों के तहत 1.5-2.5 घंटे के भीतर इस घनत्व के लिए विकसित होगा, उपसंख्य के लिए कोई ज़रूरत नहीं के साथ । संस्कृति को अधिक वृद्धि करने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए (0.75 के ओडी रीडिंग से परे) क्योंकि यह उस बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर बैक्टीरिया अब लॉग चरण वृद्धि में नहीं हैं और व्यापक ऑटोलिसिस के दौर से गुजर रहे हैं।
  3. प्रत्येक माउस लगभग 107 बैक्टीरिया के साथ टीका लगाया जाएगा। इसलिए, हर 9 चूहों को उपनिवेश बनाने के लिए, एपेंडोर्फ ट्यूब में 1 मिलीलीटर इनोकुलम और 1 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर स्पिन करें। एक सफ़ेद गोली दिखाई जानी चाहिए। सुपरनैंट निकालें, सावधान रहें कि गोली को परेशान न करें और फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 100 माइक्रोन में बैक्टीरिया को फिर से रखें, इस प्रकार एकाग्रता को 109 सीएलयू/एमएल तक बढ़ा दिया। इस स्तर पर, बैक्टीरिया व्यवहार्य रहना चाहिए, लेकिन आसानी से दोहराने नहीं होगा।
  4. यदि कई aliquots का उपयोग कर रहे हैं, तो बैक्टीरियल घनत्व में मामूली अंतर-नमूना विविधताओं के लिए नियंत्रित करने के लिए एक ट्यूब में गठबंधन करें।
  5. टीका लगाने के लिए तैयार होने तक बर्फ पर बैक्टीरिया रखें, अधिकतम 1 घंटे के लिए।
  6. एक सटीक बैक्टीरियल गिनती प्राप्त करने के लिए, साफ बैक्टीरियल इनोकुलम के साथ शुरू लॉग-वार सीरियल कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रदर्शन करते हैं। तनु धारावाहिक 10 गुना, बाँझ PBS के ९० μl के लिए 10 माइक्रोन जोड़ने ।
  7. 10-5 -10 -9, प्लस एक पीबीएस-केवल संदूषण नियंत्रण के 10 माइक्रोन नमूनों की3 बूंदोंको प्लेट करें, ट्राइप्टिक सोया एगर (टीएसए) प्लेट के अलग-अलग लेबल वाले वर्गों पर 5% भेड़ के रक्त(चित्रा 2)के साथ पूरक हैं। सुनिश्चित करें कि अतिरिक्त बैक्टीरिया को ले जाने और परिणामों की परिवर्तनशीलता बढ़ाने से बचने के लिए उच्च सीएलयू एकाग्रता से कम सीएलयू एकाग्रता के लिए प्रत्येक चरण के लिए पिपेट युक्तियां बदल दी जाती हैं। टीएसए के बदले ह्यूमन ब्लड एगर (एचबीए) प्लेट्स का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। चूंकि एस निमोनिया के कई उपभेद नियोमाइसिन (5-20 μg/ml से) के लिए प्रतिरोधी हैं, इसलिए इस एंटीबायोटिक को प्लेट तैयारी चरण के दौरान पसंद के आगर माध्यम में भी जोड़ा जा सकता है। यह गणना की सुविधा के रूप में यह गैर प्रतिरोधी बैक्टीरिया समाप्त । प्रत्येक तनाव की एंटीबायोटिक संवेदनशीलता का परीक्षण पहले से किया जाना चाहिए ताकि प्रत्येक जीवाणु तनाव के लिए उपयोग करने के लिए एंटीबायोटिक की इष्टतम एकाग्रता निर्धारित की जा सके।
  8. 15-30 मिनट खुला के लिए सूखने की अनुमति दें, फिर प्लेटों को कवर करें और बैक्टीरियल इनक्यूबेटर में उल्टा रखें जो 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2तक सेट है। 24 घंटे के लिए प्लेट पर बैक्टीरियल कॉलोनियों को बढ़ाएं।
  9. कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों और उनकी इसी एकाग्रता की संख्या निर्धारित करें। ओडी६०० मूल्य के निर्धारण के आधार पर, एकाग्रता 1-4 x 109 CFU/ml. एस निमोनिया कालोनियों के रूप में छोटे, परिपत्र कालोनियों रंग में एक पीले रंग का बेज दिखाई देना चाहिए, केंद्र में एक छोटे से अवसाद के साथ उंहें एक डोनट की तरह उपस्थिति(चित्रा 3)दे रही है ।

2. मुरीन इंट्रानासाल उपनिवेशीकरण

  1. चूहों को माउस निरोधक तंत्र में रखकर नियंत्रित करें (एक प्रतिपर्चर बनाने के लिए टिप के साथ एक संशोधित 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब) उन्हें अंगूठे के साथ उनके शरीर के आधार से सुरक्षित करता है ताकि उनकी नाक सिर्फ निरोधक तंत्र(चित्रा 4)के पतला अंत से बाहर निकलती हो। इस उपकरण का उपयोग माउस के सिर को स्थिर करने और इसके नार्स के अलगाव को इस तरीके से अनुमति देता है जो आंदोलन को कम करता है और साथ ही जानवर से पिपेट टिप को मस्टिकेट करने के प्रयासों में बाधा डालता है, जिससे इनोकुलम की पूर्ण डिलीवरी की अनुमति मिलती है। वैकल्पिक रूप से, चूहों को गर्दन और मैन्युअल संयम पर scuffing के माध्यम से स्थिर किया जा सकता है। हम इंट्रानासल टीका लगाने से पहले जानवरों के संज्ञाहरण की सिफारिश नहीं करते हैं। एनेस्थीसिया के अंतर्गत पशुओं को इनोकुलम का प्रबंध करने से कुछ इनोकुलम फेफड़ों में फैलतेहैं 12,13.
  2. P10 या P20 पिपेट का उपयोग करके, तैयार संस्कृति के 10 माइक्रोन जमा करके प्रत्येक माउस को टीका लगाते हैं, इसे दोनों नाड़ों के बीच समान रूप से वितरित करते हैं (इनोकुलम को धीरे-धीरे टीका लगाकर नाक में ड्रिप करने की अनुमति दें, चूहों को टीका लगाने में समय लग जाता है)। इनोकुलम की पूरी डिलीवरी प्राप्त करने के लिए, किसी भी बिंदु पर प्रशासन को रोकें माउस अपनी नाक को जरूरत से ज्यादा स्थानांतरित करना शुरू कर देता है। पूरे इनोकुलम को नाड़ों में इंजेक्ट नहीं किया जा सकता है क्योंकि चूहे सांस छोड़ने के दौरान नाक के माध्यम से कुछ निष्कासित कर सकते हैं; हालांकि, चूंकि निष्कासित राशि मामूली हो जाती है, और इनोकुलम में बैक्टीरिया की एक बहुत ही उच्च मात्रा होती है, यह उपनिवेश बैक्टीरियल लोड को काफी प्रभावित नहीं करता है। इसके अतिरिक्त, नासोफेरिंजियल म्यूकोसा में उपनिवेशीकरण के लिए उपलब्ध सतह क्षेत्र सीमित है और नतीजतन हमने और अन्य लोगों ने पाया है कि अनुशंसित 107 खुराक सभी चूहों में बैक्टीरिया के लगातार स्तर को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है, जिसके परिणामस्वरूप उपनिवेश बैक्टीरिया14,15 की प्रारंभिक मात्रा में न्यूनतम परिवर्तनशीलता होती है।
  3. अपने अंत बिंदु निगरानी के भाग के रूप में वजन संकेतकों का उपयोग कर यदि चूहों का वजन करें। सुस्ती, झालरदार फर और वजन घटाने सहित नैदानिक लक्षणों के लिए हर 12-24 घंटे चूहों की निगरानी करें। चूहों आम तौर पर 3-5 दिनों के बाद उपनिवेशीकरण तक बीमारी के लक्षण नहीं दिखाएगा, और ये वजन घटाने से पहले होंगे जो एक दिन में कुल शरीर के वजन का लगभग 5% औसत हो सकता है। चूहों के रूप में तेजी से बीमार हो वे कूबड़ मुद्राओं मान और गतिविधि में कमी दिखाने के लिए और उत्तेजना के लिए जवाबदेही में कमी, हैंडलिंग सहित होगा । इस स्तर पर, बीमारी आम तौर पर सेप्सिस और/या निमोनिया का संकेत है और संभावना टर्मिनल होगा, हालांकि चूहों के परिणामों में सुधार करने के लिए दैनिक चमड़े के नीचे खारा के 1 मिलीलीटर के साथ इलाज किया जा सकता है । जीवित चूहों को 7 दिन के बाद उपनिवेशीकरण के बाद सुधार दिखाना शुरू कर देना चाहिए, जैसा कि वजन बढ़ने के बाद वजन के स्थिरीकरण से पता चलता है, हालांकि एस निमोनिया के विभिन्न उपभेद बीमारी को अधिक तेज़ी से प्रेरित कर सकते हैं और परिणामस्वरूप एक अलग समय-रेखा के साथ नैदानिक लक्षणों की प्रगति हो सकती है। कृपया P1547 तनाव के साथ उपनिवेश चूहों में ट्रैक वजन के एक प्रतिनिधि परिणाम के लिए चित्रा 5 देखें ।

3. नाक लावेज नमूना संग्रह

शुरुआत से पहले: 26 3/8 जी beveled सुइयों के साथ छाया हुआ 1 मिलीलीटर सीरिंज का उपयोग कर cannulated सुई तैयार करें। एक आंतरिक व्यास 0.38 मिमी के साथ PE20 पॉलीथीन ट्यूबिंग के 2.5 सेमी टुकड़े काटें, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रत्येक छोर में एक बेवेल्ड टिप है। संदंश का उपयोग करते हुए, सुई टिप पर PE20 पॉलीथीन ट्यूबिंग (आंतरिक व्यास 0.38 मिमी) के 2.5 सेमी लंबे टुकड़े को स्लाइड करें, ट्यूबिंग साइड को पंचर करने से बचें। कैनुलेटेड सुई को जरूरत पड़ने तक 70% इथेनॉल में रखा जा सकता है।

  1. प्रयोगात्मक चूहों को इच्छामृत्यु। चूंकि गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था संभावित रूप से श्वासनली को नुकसान पहुंचा सकती है, इसलिए इच्छामृत्यु की इस विधि से बचा जाना चाहिए। हमारी पसंदीदा विधि आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया है जिसके बाद एक्सेंगिनेशन होता है, हालांकि, यह सुनिश्चित करते हैं कि आप इच्छामृत्यु के तरीके का चयन करते समय संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करें।
  2. 70% जलीय इथेनॉल का उपयोग करना, जानवर के सुपरनोएंटरर फर को स्टरलाइज करें, विशेष रूप से गर्दन, इथेनॉल को नार्स तक पहुंचने से रोकने के लिए ध्यान रखें।
  3. जानवर की गर्दन के मिडलाइन के साथ एक एकल देशांतर कटौती करें, और दोनों छोर पर दो क्षैतिज कटौती करें, श्वासनली की कल्पना करने के लिए एक उद्घाटन बनाते हैं।
  4. ध्यान से वापस दोनों तरफ त्वचा छील, नीचे गर्दन के ऊतकों का खुलासा ।
  5. श्वासनली दिखाई देना चाहिए, दोनों तरफ देशांतर की मांसपेशियों से घिरा हुआ है। ध्यान से इन्हें स्निप करें ताकि श्वासनली का स्पष्ट दृश्य प्रदान किया जा सके, इस बात का ध्यान रखा जाए कि आसपास के वास्कुलेचर को तोड़ न दिया जाए।
  6. यदि वाक्यूल्चर को काट दिया गया था और रक्त मौजूद है, तो आगे बढ़ने से पहले, रक्तस्राव को रोकने की अनुमति दें, और फिर बाँझ पीबीएस को वितरित करके और बाँझ धुंध का उपयोग करके क्षेत्र में अतिरिक्त नमी को धीरे से सोख लेने के लिए कई बार क्षेत्र को शुद्ध करें।
  7. एक बार श्वासनली ठीक से उजागर हो जाने के बाद, श्वासनली में एक ट्रांसवर्स, अर्धचंद्र कट बनाएं, जो आधेरास्ते (चित्रा 6)के बारे में है।
  8. पहले से तैयार कैनुलेटेड सुई में निष्फल पीबीएस के 1,000 माइक्रोन को ड्रा करें।
  9. नाक की ओर श्वासनली में कैनुला डालें, सम्मिलन (चित्र 7) की आसानी के लिए नीचे की ओर इशारा करते हुए beveledकिनारे रखते हुए। एक बार सुई जगह में है, यह 180 ° घुमाएं, और धीरे से ऊपर की ओर जांच जब तक आप प्रकाश प्रतिरोध महसूस करते हैं ।
  10. माउस की नाक के ठीक नीचे नमूना संग्रह के लिए नामित एपेंडोर्फ रखें।
  11. पीबीएस लावेज तरल पदार्थ की न्यूनतम (~ 20 माइक्रोन) मात्रा को वितरित करके सुई की सही प्लेसमेंट का परीक्षण करें - माउस के नारों के चारों ओर तरल पदार्थ की बूंद बननी चाहिए; यदि यह मामला है, तो 3.13 कदम पर आगे बढ़ें।) ।
  12. यदि परीक्षण PBS सीधे जानवर के मुंह से बाहर उभर, cannula वापस खींच, और फिर से धीरे से आगे की जांच जब तक बहुत मामूली प्रतिरोध महसूस किया जाता है-ध्यान रखना नहीं cannula धक्का बहुत दूर इस प्रतिरोध पिछले, के रूप में आप इसे नाक तालु पिछले और मौखिक गुहा के माध्यम से कदम होगा ।
  13. कोशिकाओं की अधिकतम मात्रा को विस्थापित करने और एकत्र करने में मदद करने के लिए सुई की सामग्री को तेजी से बांटना - सामग्री माउस के नाड़ों के माध्यम से और संग्रह ट्यूब में प्रवाहित होनी चाहिए। बर्फ पर तुरंत नमूना रखें।
  14. आरएनए विश्लेषण के लिए नमूने एकत्र करने के लिए, एक ही माउस पर आरएनए लाइसिस बफर के 500 माइक्रोन युक्त एक कैनुलेटेड सुई का उपयोग करके 3.8-3.13 कदम दोहराएं। यह शेष कोशिका आबादी से lysate नमूना के संग्रह की अनुमति देगा, मोटे तौर पर nasopharyngeal म्यूकोसल एपिथेलियम से बना है, क्योंकि प्रारंभिक पीबीएस लावेज के बाद गैर-अधिष्ठाता कोशिकाओं को हटा दिया जाना चाहिए था। कृपया ध्यान दें कि आरएनए लाइसिस बफर एपिथेलियम को खराब कर देगा और आसपास के ऊतकों को नष्ट कर देगा, इसलिए इन ऊतकों की अवधारण वांछित होने पर फेफड़ों जैसे अंगों के संपर्क से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। एक बार एकत्र होने के बाद, आरएनए लाइसिस बफर में सीधे सूखी बर्फ पर स्नैप-फ्रीज करने के लिए नमूना रखें। एक बार लाइसिस बफर में, नमूनों को निर्माता के निर्देशों के अनुसार संग्रहीत किया जा सकता है, और कई महीनों के लिए आम तौर पर -70 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होते हैं।

4. नासोफेरिनेक्स में बैक्टीरियल लोड का निर्धारण

  1. प्रत्येक मुरीन नाक लावेज नमूने के लिए एक धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करके क्वांटिटेट बैक्टीरिया। सामान्य तौर पर, बैक्टीरियल लोड 0-104 सीएलयू के बीच होने की उम्मीद की जा सकती है, इसलिए तीन 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने का संचालन करते हैं। 10 -1 सीएलयू/एमएल भंवर की एकाग्रता के लिए पहली ट्यूब में साफ नाक लावेज नमूना(100 सीएलयू/एमएल) के 10 माइक्रोन को अच्छी तरह से जोड़ें।
  2. जीवाणु प्लेट को चतुर्भुज में विभाजित करें, और प्रत्येक को कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला (100-10-3 सीएलयू/एमएल) के सदस्यके साथ ट्रैक्टरों को लेबल करें। प्लेट आउट 3 कमजोर पड़ने के 10 μl नमूनों की 3 बूंदें और ट्रिप्टिक सोया आगर प्लेटों पर साफ नमूना 5% भेड़ के रक्त के साथ पूरक, जैसा कि चित्र 2में है।
  3. 15-30 मिनट खुला के लिए सूखने की अनुमति दें, फिर प्लेटों को कवर करें और बैक्टीरियल विकास के लिए इष्टतम स्थितियों के साथ बैक्टीरियल इनक्यूबेटर में उल्टा रखें (आमतौर पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2)।
  4. 18-24 घंटे के लिए प्लेट पर बैक्टीरियल कॉलोनियों को बढ़ाएं।
  5. प्रत्येक कमजोर पड़ने(चित्र 3)के लिए प्लेट पर गठित कालोनियों के औसत से उपनिवेश बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करें। चित्रा 8 विभिन्न टाइमपॉइंट्स के दौरान बैक्टीरियल घनत्व को दर्शाता है, जैसा कि नाक लावों की संस्कृति द्वारा निर्धारित किया जाता है, चूहों में 21 दिनों तक एस निमोनिया के 3 विभिन्न उपभेदों के साथ उपनिवेश होता है।

5. फ्लो साइटोमीटरी के लिए नमूनों की तैयारी

शुरुआत से पहले: एंटीबॉडी का मिश्रण तैयार करें। ल्यूकोसिटे आबादी के मात्राकरण के लिए, हम निर्दिष्ट कमजोरुओं पर निम्नलिखित मिश्रण की सलाह देते हैं: पीई-Ly6G (क्लोन 1A8, 1 μg/ml), फिटसी-Ly6C (क्लोन अल-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (क्लोन 30-F11, २.६७ μg/ml), एपीसी-F4/80 (क्लोन पीएम8 RUO, ०.६७ μg/ml), PerCP-Cy5.5-CD11c (क्लोन N418 RUO, 0.5 μg/ml), पीई-Cy7-CD11b (क्लोन M1/70, 0.33 μg/ml), एलेक्सा फ्लोर 700-सीडी 3 (क्लोन 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (क्लोन GK1.5, 6.67 μg/ml) । कृपया ध्यान दें कि यह मिश्रण 2x एकाग्रता है (चरण 5.5 देखें)। सभी एंटीबॉडी को एफएसीएस वॉश बफर (0.5% भ्रूण बछड़ा सीरम, 2mM EDTA, पीबीएस में 0.1% सोडियम एजाइड) में पतला किया जाना चाहिए जिसे पहले से तैयार किया जाना चाहिए। आइसोटाइप मिलान नियंत्रण एंटीबॉडी के मिश्रण में, आदर्श रूप से लेबल वाले एंटीबॉडी के रूप में एक ही आपूर्तिकर्ता से और विशिष्ट एंटीबॉडी के समान सांद्रता पर, तैयार किया जाना चाहिए। आइसोटाइप कंट्रोल एंटीबॉडी के साथ इलाज किए गए नमूने नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेंगे। आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ इलाज नमूनों में मनाया किसी भी फ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि माना जाना चाहिए ।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस तक 1.5 मिलीलीटर एप्पेनडोर्फ ट्यूब ों को कताई करने में सक्षम एक अपकेंद्रित्र।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नाक लाव्ज नमूने। ध्यान से सुपरनेट और रिजर्व बाहर पिपेट। नोट: नासोफेरिन्स के भीतर कोशिकाओं की थोड़ी मात्रा के कारण, सेल पेल तब तक दिखाई नहीं देगा जब तक कि अवांछित लाल रक्त कोशिका संदूषण न हो, जो उज्ज्वल लाल होगा। यदि यह देखा जाता है, तो नमूना छोड़ दिया जाना चाहिए।
  3. एफसी के 50 माइक्रोन में नमूना Resuspend? RIIb/CD16-2 (2.4G2) एंटीबॉडी (जो एफसी रिसेप्टर्स बांधता है और गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी कम कर देता है) FACs धोने बफर में 4 μg/ml की एकाग्रता पर ।
  4. 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट नमूना।
  5. नमूना करने के लिए पूर्वतैयार 2x केंद्रित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी मिश्रण के 50 माइक्रोन जोड़ें। आइसोटाइप नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह से एक प्रतिनिधि नमूना अलग सेट करें। दाग मिश्रण के बदले में इस नमूने में आइसोटाइप एंटीबॉडी मिक्स जोड़ें।
  6. 1 घंटे के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट नमूना।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूने। पीबीएस के 200 माइक्रोल में सुपरनेट और रिसिपेंड को त्यागें।
  8. दोहराएं चरण 5.7।
  9. दूसरी वॉश के बाद, सेंट्रलाइज नमूने फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर।
  10. पीबीएस में या तो पुनर्सुगत (यदि नमूना तुरंत चल रहा है) या 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (यदि नमूने 1-3 दिन बाद धुंधला चल रहा है)।
  11. जब प्रवाह साइटोमेट्री का संचालन प्रति नमूना घटनाओं की अधिकतम राशि इकट्ठा या पूरे नमूना एस्पिरेटेड किया गया है । असंक्रमित, स्वस्थ, युवा चूहों में, यह 1,000-2000 कुल घटनाओं के रूप में कम होगा; एक जीवाणु उपनिवेशीकरण घटना के दौरान, यह संख्या पशु में रोग की स्थिति और उम्र और आनुवंशिक पृष्ठभूमि जैसे कारकों पर निर्भर 2 से 5 गुना से अधिक बढ़ सकती है। चित्रा 9 450 के फॉरवर्ड स्कैटर और 300 के साइड स्कैटर का उपयोग करके 3-लेजर बेक्टन डिकेंसन एलएसआरआईआई फ्लो साइटोमीटर से एकत्र किए गए प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री परिणामों को दिखाता है, हालांकि हम नमूना संग्रह से पहले उपयोग करने वाले विशिष्ट प्रवाह साइटोमीटर के लिए मापदंडों को अनुकूलित करने की सलाह देते हैं। नोट: यदि किसी नमूने में रक्त संदूषण की मात्रा का पता भी लगाया जाता है, तो एकत्र की गई कुल घटनाएं अपेक्षा से काफी अधिक होंगी और नमूने को विश्लेषण से छूट दी जानी चाहिए।

6. नाक Lavages के मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) विश्लेषण

  1. गल सेल स्टेप 3.14 रूम टेम्परेचर से होता है।
  2. पसंद के पसंदीदा आरएनए निष्कर्षण के साथ प्रदान की सिफारिश की प्रोटोकॉल का पालन करें।
  3. निर्देश के अनुसार आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया को पूरा करने के बाद, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या इलेक्ट्रोफोरेसिस आधारित विधि(चित्रा 10)का उपयोग करके आरएनए की मात्रा की मात्रा निर्धारित करें। हम नियमित रूप से 975 और 3,250 एनजी कुल आरएनए प्रति नमूना के साथ >1.7 या एक आरएनए अखंडता संख्या (RIN) के आसपास, 8.1.1±0.13 के एक 260/280 एनएम अनुपात के साथ प्राप्त करते हैं।
  4. 1,000 एनजी आरएनए (अधिकतम 13 माइक्रोल) के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एम-एमयूएल रिवर्स ट्रांसक्रिप्टीज़ का उपयोग करके सीडीएनए को टाइप करें।
  5. तनु जिसके परिणामस्वरूप सीडीएनए नमूने 8x, और aliquot समान रूप से -20 या -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए 4 अलग ट्यूबों में ।
  6. क्यूपीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए, बर्फ या कोल्ड ब्लॉक पर ट्रिपलिटेट में 25 माइक्रोन नमूने प्रतिक्रियाएं तैयार करें: अपनी पसंद की क्यूपीसीआर किट से 2x क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स के 12.5μl, 0.25 माइक्रोन संदर्भ डाई, पतला सीडीएनए (चरण 7.5) का 2 माइक्रोन, मिश्रित फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर (400 एनएम फाइनल), आरएनईई-डीएनसी मुफ्त पानी का 9.25 माइक्रोन। यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित तरीकों का अनुकूलन है16.
  7. सामान्य तौर पर हम पाते हैं कि दो चरण क्यूपीसीआर प्रवर्धन (10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और उसके बाद 40 चक्र x [95 डिग्री सेल्सियस x 15 सेकंड, 60 डिग्री सेल्सियस x 1 मिनट]) प्रभावी है(चित्रा 11a); हालांकि, प्रत्येक प्राइमर जोड़ी को अनुकूलित किया जाना चाहिए। वियोजन (पिघलने) घटता प्रवर्धन के बाद किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए कि कोई गैर विशिष्ट प्रवर्धन हुआ । प्रवर्धन(चित्र 11b)
  8. हम नियमित रूप से प्रत्येक जीन विश्लेषण के लिए मानक घटता चलाने के साथ ही एक मानक कैलिब्रेटर (फेफड़ों या तिल्ली समरूप से व्युत्पन्न) प्रत्येक ९६-अच्छी तरह से प्लेट का विश्लेषण के लिए । सापेक्ष प्रतिलिपि राशि पहले संदर्भ डाई द्वारा कच्चे चक्र सीमा (सीटी) मूल्यों को सामान्य बनाने और संबंधित मानक वक्र के माध्यम से परिणामी मूल्यों को बदलने के द्वारा प्राप्त की जाती है। इन सापेक्ष मात्रा को बाद में लागू मानक कैलिब्रेटर और हाउसकीपिंग जीन में सामान्यीकृत किया जाता है।

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Representative Results

चित्रा 1 प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों का सारांश एक अवलोकन योजनाबद्ध का प्रतिनिधित्व करता है। आंकड़े 2-3 यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए निहित माइक्रोबायोलॉजिकल पद्धति का दृश्य प्रदान करते हैं। चित्रा 4 एक इंट्रानासाल उपनिवेशीकरण करने के लिए माउस की उचित स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि चित्रा 5 एस निमोनिया तनाव P1547 के साथ उपनिवेश चूहों के वजन में आम तौर पर परिवर्तन को दर्शाया गया है । आंकड़े 6-7 इन दो तकनीकों की सहायता से दृश्य के लिए, प्रक्रिया के नाक लावेज भाग के विशिष्ट चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं। आंकड़े 8-11 नाक लावज के बाद एक माउस के nasopharynx से एकत्र नमूनों पर आयोजित विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणामों से मिलकर बनता है । विशेष रूप से, चित्रा 8 नासोफेरिंक्स में बैक्टीरियल लोड का एक प्रतिनिधि परिणाम है, जैसा कि एस निमोनिया तनाव P1121, P1547 या P1542 के साथ उपनिवेश चूहों से प्राप्त नाक लावॅ्स की खेती के माध्यम से निर्धारित किया गया है। चित्रा 9 प्रवाह साइटोमेट्रिक तकनीकों का उपयोग करके अलग-अलग नासोफेरिंजियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सेल फेनोटाइपिंग का प्रतिनिधित्व करता है। आंकड़े 10-11 मात्रात्मक पीसीआर के माध्यम से nasopharyngeal mRNA के भावात्मक विश्लेषण से संबंधित प्रतिनिधि परिणाम।

Figure 1
चित्रा 1. माउस मॉडल का उपयोग करके इंट्रानासल टीका और नाक लाव्ज सेल आइसोलेशन प्रक्रियाओं का प्रवाह चार्ट। सबसे पहले, बैक्टीरिया टीका के लिए तैयार कर रहे हैं, और फिर इंट्रानैसली विषयों को दिया जाता है। समय बीतने की वांछित लंबाई के बाद, चूहों को टर्मिनल खून के माध्यम से इच्छामृत्यु दी जाती है, और उनकी नासोफेरिंजियल कोशिकाओं को दो नाक लावेज चरणों के माध्यम से अलग किया जाता है: एक पीबीएस वॉश स्टेप जिसके बाद आरएनए लाइसिस बफर में एक माध्यमिक धोने होता है। प्रारंभिक पीबीएस धोने से कोशिकाओं को अलग और प्रवाह साइटोमेट्री तकनीकों का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं, जबकि दूसरे नमूने से अलग आरएनए प्रतिलेखन स्तर पर ब्याज के अणुओं के सापेक्ष बहुतायत की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 2
चित्रा 2। बैक्टीरियल एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, एक अलग धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रतिनिधित्व करने वाले वर्गों में विभाजित प्लेट पर त्रिपाल में 10 माइक्रोन बूंदें चढ़ाया जाताहै। इन बूंदों को तब सूखने की अनुमति है और प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटेड कियाजाताहै।

Figure 3
चित्र 3। स्ट्रेप्टोकस निमोनिया की एकाग्रता जो एक प्रतिनिधि जानवर के नासोफेरिक्स से अलग होती है। प्रत्येक असतत कॉलोनी एक कॉलोनी बनाने इकाई का प्रतिनिधित्व करती है, कालोनियों का प्रत्येक संग्रह एक 10 माइक्रोल ड्रॉप (ट्रिपली में चढ़ाया गया) का प्रतिनिधित्व करता है और प्लेट पर प्रत्येक चतुर्भुज एक अलग धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रतिनिधित्व करता है। जीवाणु एकाग्रता CFU/ml में गणना की संख्या औसत से निर्धारित किया जाता है, पूरी तरह से निर्मित कालोनियों के भीतर, और फिर के बीच, क्वाड्रंट्स योग्यता ।

Figure 4
चित्र 4. किसी भी माउस के आंदोलन को कम किया जाना चाहिए, विशेष रूप से गर्दन पर, बैक्टीरियल इनोकुलम के उचित वितरण के लिए अनुमति देने के लिए। इसे पूरा करने के लिए, विषय माउस को एक संशोधित प्रतिबंध तंत्र में रोका जाता है जिसमें 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब होता है, जिसमें इसके पतला अंत में एक एपर्चर होता है। माउस तो तैनात है ताकि उसकी नाक एपर्चर से उभर, जहां यह शोधकर्ता द्वारा पहुँचा जा सकता है, इंट्रानासल टीका लगाने के लिए अनुमति दी ।

Figure 5
चित्रा 5। नासोफेरिंजियल उपनिवेशीकरण के बाद अपेक्षित वजन में विशिष्ट परिवर्तनों को चित्रित करने के लिए प्रारंभिक टीका (एन = 6) के बाद दैनिक रूप से ट्रैक किए गए न्यूनतम 2 प्रतिनिधि प्रयोगों से तनाव P1547 के साथ उपनिवेश चूहों का वजन। वजन प्रारंभिक वजन के एक प्रतिशत परिवर्तन के रूप में दिखाया गया है। कृपया 3-5 दिनों के बीच देखे गए अपेक्षित तेज प्रारंभिक वजन घटाने पर ध्यान दें, इसके बाद स्थिरीकरण और जीवित चूहों में वजन में क्रमिक वृद्धि हुई है।

Figure 6
चित्रा 6. श्वासनली जोखिम पर, पार्श्वदक्षिण मांसपेशियों को सावधानी से सांस चीरा से पहले हटा दिया जाता है जिससे आसपास की रक्त वाहिकाएं गंभीर नहीं होती हैं। एक छोटा सा, अर्धचंद्र चीरा तो ठीक सर्जिकल कैंची का उपयोग कर श्वासनली आधे रास्ते बना दिया है । श्वासनली के व्यास के माध्यम से केवल आंशिक रूप से कटौती करना महत्वपूर्ण है, जिससे यह पीछे बरकरार है।

Figure 7
चित्रा 7। नाक की ओर ऊपर की ओर श्वासनली एपर्चर में कैनन्यूल सुई का सम्मिलन। एक बार कैनुला जगह में है, धीरे जांच जब तक प्रतिरोध से मुलाकात की है, तो नार्स के माध्यम से बाहर सामग्री फ्लश ।

Figure 8
चित्रा 8। एस निमोनिया तनाव P1547 (ए), P1542 (बी) या P1121 (सी) के साथ C57BL/6 चूहों (त्रिकोण) के उपनिवेशीकरण के बाद वर्णित नाक लावेज प्रक्रिया का उपयोग कर nasopharynx से अलग जीवाणु लोड की एक प्रतिनिधि श्रृंखला । P1121 उपनिवेशीकरण के बाद बाल्ब/सी चूहों (हलकों) का तुलनात्मक उपनिवेशीकरण भी(सी)में प्रदर्शित किया जाता है। उपनिवेशीकरण के दौरान अलग-अलग समय बिंदु दिखाए जाते हैं, जिनमें दिन 3, 7, 14 और 21 शामिल हैं। आम तौर पर, 3 दिन में एक उच्च प्रारंभिक लोड की उम्मीद है, 7 दिन में थोड़ा ह्रास के साथ। निकासी आम तौर पर 14 दिन तक शुरू की जाती है, जिसमें अधिकांश उपभेदों के साथ उपनिवेशीकरण के बाद 21 दिन तक पूर्ण या निकट-पूर्ण निकासी का सबूत होता है। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण के रूप में मुरीन नाक लावगेस से अलग कुल कोशिकाओं के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम (ए) और डॉट प्लॉट (बी) । सेल आबादी पर मार्कर की अंतर अभिव्यक्ति इन प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के उपयोग के माध्यम से ल्यूकोसाइट सबसेट की पहचान के लिए अनुमति देता है। जैसा कि यहां दिखाया गया है, ल्यूकोसाइट आबादी को सिंगल सेल पर पहले गेटिंग द्वारा चुना जाता है, जिसमें फॉरवर्ड स्कैटर (क्षेत्र) बनाम फॉरवर्ड स्कैटर (चौड़ाई) गेट(ए)का उपयोग किया जाता है, और फिर उस सबसेट(बी)के भीतर सीडी 45 + कोशिकाओं के लिए समृद्ध होता है। इस आबादी को CD11b और Ly6G डबल पॉजिटिव न्यूट्रोफिल (सी) के लिए गेटिंग करके विशिष्ट सेल प्रकारों में और विभाजित किया जासकता है। CD11b-जनसंख्या का विश्लेषण F4/80 +, CD11b-मैक्रोफेज(डी)या CD11b-, सीडी 3 और CD4 डबल पॉजिटिव सीडी 4 टी कोशिकाओं(ई)को प्रकट करने के लिए आयोजित किया जा सकता है । सेल आबादी को तब तक फेनोटाइप किया जा सकता है जब तक वे या तो एक व्यक्त करते हैं, या कई अद्वितीय सतह रिसेप्टर्स का संयोजन होता है जिसका उपयोग उन्हें अन्य सेल प्रकारों से अलग करने के लिए किया जा सकता है। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्रा 10। मुरारीन नाक लावेज से अलग एक नमूने के इलेक्ट्रोफोरेसिस स्वचालित अनुक्रमण के बाद प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफेरोग्राम। परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोफेरोग्राम क्वांटिटेशन डेटा और नासोफेरींजियल क्षेत्र से प्राप्त उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए नमूने के विशिष्ट हस्ताक्षर को दर्शाता है। कुल आरएनए का विश्लेषण करते समय, दो प्रमुख राइबोसोमल आरएनए, 18S और 28S के लिए आरएनए चोटियों के तहत क्षेत्रों का उपयोग उनके इसी अनुपात की गणना करने के लिए किया जाता है। 18S और 28S के कारण चोटियों के अनुपात में महत्वपूर्ण परिवर्तन आम तौर पर अवक्रमित आरएनए के संकेत हैं । गिरावट की डिग्री आरएनए अखंडता संख्या (RIN) द्वारा संक्षेप किया जा सकता है; इस प्रतिनिधि नमूने के लिए आरआईआईएन 8.1 है। अत्यधिक अपमानित आरएनए का एक उदाहरण(बी)और(सी)में दिखाया गया है, और बाद में आरआईएन क्रमशः 1.9 और 4.6 है। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 11
चित्रा 11। नाक धोने सेल lysates के qPCR विश्लेषण से प्रवर्धन साजिश (ए) और वियोजन (पिघलने) वक्र (बी), कैसे इन दो readouts आम तौर पर एक कुशल और सही ढंग से पता चला mRNA मुरीन nasopharynx से अलग उत्पादों के प्रवर्धन का पता लगाया जाना चाहिए का एक उदाहरण प्रदान करते हैं । प्रतिनिधित्व हाउसकीपिंग जीन 18S के लिए एक मानक वक्र है। (ए)में प्रदर्शित परिणाम GAPDH के खिलाफ प्राइमर का उपयोग कर प्रवर्धन के बाद वांछित पीसीआर उत्पाद दिखाते हैं । रेखा चक्र सीमा (सीटी) का प्रतिनिधित्व करती है। वह बिंदु जिस पर विभिन्न नमूनों के अनुरूप प्रवर्धन भूखंड इस सीमा को पार करते हैं, नमूनों में तुलना के लिए अनुमति देता है, कम मूल्यों के साथ उसमें निहित ब्याज की आरएनए की उच्च मात्रा के अनुरूप। (बी)में प्लॉट से पता चलता है कि क्यूपीसीआर उत्पाद का अधिकतम पिघलने का तापमान 85 डिग्री सेल्सियस है और इस प्रतिक्रिया में कोई दूषित उत्पाद मौजूद नहीं है, जो वांछित उत्पाद शिखर से अलग एक अतिरिक्त चोटी के रूप में दिखाई देगा। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तनाव का नाम सेरोटाइप उग्रता चूहों में मृत्यु दर अपेक्षित उपनिवेशीकरण अवधि
P1121 23F लक्षणविहीन 0% 21-28 दिन
P1542 4 संख्‍या आदि 0-20% 21-28 दिन
P1547 6ए मध्य 20-50% 14-21 दिन
D39 2 उच्च 70-100% 14-21 दिन

तालिका 1. 4 आमतौर पर नियोजित एस निमोनिया नैदानिक आइसोलेट्स का एक सारणीय अवलोकन, उनकी संबंधित सेरोटाइप संख्या, उग्रता की संबद्ध डिग्री, चूहों के उपनिवेश सबसेट के भीतर आक्रामकता में अपेक्षित अनुपात और नासोफेरींजियल उपनिवेशीकरण की विशिष्ट अवधि।

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Discussion

इस अध्ययन में हमने स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया के नैदानिक आइसोल्यूजन तनाव और बैक्टीरिया के जवाब में नासोफेरिंक्स में भर्ती प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बाद के अलगाव और लक्षण वर्णन का उपयोग करके चूहों के इंट्रानासाल उपनिवेशीकरण के लिए विस्तृत तरीके प्रस्तुत किए। हमने प्रदर्शन किया कि कैसे एक जीवाणु इनोकुलम पोषक तत्वों से भरपूर मीडिया में सुसंस्कृत किया जा सकता है और चूहों में एक उपनिवेशीकरण घटना स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, जो शुरू में nasopharynx तक ही सीमित है। फिर हमने दिखाया कि कैसे नासोफेरिनक्स में भर्ती किए गए प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों का जवाब एक कैनुलेटेड सुई के उपयोग के माध्यम से श्वासनली एक्सपोजर, चीरा और नाक के लाव के बाद अलग किया जा सकता है। नाक लावेज नमूनों को पीबीएस में एकत्र किया जा सकता है ताकि बरकरार, हल्के अनुयायी कोशिकाओं को अलग किया जा सके; अधिक कसकर अनुयायी कोशिकाओं और आसपास के एपिथेलियल म्यूकोसल परत से आरएनए को आरएनए लाइसिस बफर से मिलकर एक माध्यमिक धोने को लागू करके अलग किया जा सकता है। इन नमूनों के पूर्व तो प्रवाह साइटोमेट्री तकनीकों के माध्यम से उपनिवेशीकरण के संदर्भ में भर्ती विशिष्ट कोशिकाओं फेनोटाइप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि बाद क्यू पीसीआर विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है, ब्याज की प्रतिरक्षा नियामकों की प्रतिलेखनात्मक अभिव्यक्ति को देखकर इन भर्ती कोशिकाओं के प्रभावकार कार्यों का निर्धारण करने के लिए । नाक लावेज नमूनों का उपयोग विशिष्ट शोध प्रश्नों को संबोधित करने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों की तुलना में बैक्टीरियल उपनिवेशीकरण घटना की निकासी की गतिज को निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त रूप से किया जा सकता है।

इंट्रानासल उपनिवेशीकरण की इस विधि का उपयोग उपनिवेशीकरण घटना की स्थापना के लिए अनुमति देता है जो शुरू में जानवर के नासोफेरिक्स तक सीमित है। इसलिए रक्त या अंगों के लिए बैक्टीरिया का कोई बाद का प्रसार नासोफेरिंजियल म्यूकोसा के भीतर स्थानीय प्रतिरक्षा सुरक्षा में उल्लंघनों के लिए माध्यमिक होता है। इस मॉडल के माध्यम से हासिल की गई स्टेपवाइज प्रगति मनुष्यों में न्यूमोकोकल आक्रमण की प्रक्रिया को अधिक सटीक रूप से दर्शाती है, जिससे एक उपनिवेश बैक्टीरिया और मेजबान नाक म्यूकोसा के बीच गतिशीलता का अध्ययन करने की अनुमति देता है - और शायद बैक्टीरियल रोगजनकता में बदलाव को बेहतर ढंग से समझते हैं और/ यह उन मॉडलों के विपरीत है जो प्रारंभिक उपनिवेशीकरण घटना की स्थापना को छोड़ देते हैं और इंट्राट्रेचेल इन्स्टिलेशन के माध्यम से फेफड़ों में बैक्टीरियल इनोकुलम के प्रत्यक्ष वितरण के माध्यम से अलगाव में आक्रामक रोग का अध्ययन करने का चुनाव करते हैं, संवहनी इंजेक्शन के माध्यम से रक्त के लिए या पेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से पेरिटोनम के लिए।

उपनिवेशीकरण घटना के बाद पीबीएस नाक लावगे का आयोजन नसोफेरिंक्स के साथ-साथ किसी भी म्यूकोसैली से जुड़े बैक्टीरिया में भर्ती गैर-या हल्के-अनुयायी कोशिकाओं के अलगाव के लिए अनुमति देता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह तकनीक सीमित है क्योंकि यह उन कोशिकाओं या बैक्टीरिया को जारी नहीं करेगा जो एपिथेलियम के बीच या उसके नीचे यात्रा कर चुके हैं, न ही यह उन कोशिकाओं या बैक्टीरिया की कटाई के लिए अनुमति देगा जो नाक से जुड़े लिम्फोइड ऊतक (NALT) के लिए स्थानीयकृत हैं, एक लिम्फोइड अंग जिसे न्यूमोकोकोकल कोलोनाइजेशन17,18के बाद संक्रमण की संभावित साइट होने की सूचना दी गई है। यदि एनएएलटी का आगे का अध्ययन वांछित है, तो हम पीबीएस नाक लावगे के बाद अध्ययन के लिए इस ऊतक थोक को माइक्रोडिसेक्शन और हटाने की सलाह देते हैं; चूंकि ये दोनों तकनीकें पारस्परिक रूप से अनन्य नहीं हैं, इसलिए उन्हें एक ही जानवर पर आयोजित किया जा सकता है। हालांकि, आरएनए हार्वेस्टिंग स्टेप (आरएनए लाइसिस बफर का उपयोग करके माध्यमिक लावगे) की lytic और विनाशकारी प्रकृति के कारण, यदि NALT फसल का इरादा है तो इस कदम को छोड़ दिया जाना चाहिए। हालांकि नाक लावज एक कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है, बैक्टीरियल लोड का अधिक व्यापक आकलन प्राप्त करने के इच्छुक समूहों के लिए जिसमें न केवल म्यूकोसैली से जुड़े बैक्टीरिया शामिल हैं, बल्कि उन लोगों ने भी जो नासोफेरींगल ऊतक पर हमला किया है, हम उपनिवेश चूहों की ऊपरी खोपड़ी की हड्डी को हटाने और नाक के शंकु के भीतर ऊतक के विच्छेदन के बाद नासोफेरींगियल ऊतक की कटाई का सुझाव देतेहैं,जैसा कि दूसरों द्वारा वर्णित है।

एक elicited प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रकृति मेजबान और रोगजनक के बीच बातचीत पर निर्भर है। एस निमोनिया के 90 से अधिक सेरोटाइप को आज तक विशेषता दी गई है, सभी रोगजनकता और उग्रता कारक अभिव्यक्ति के अलग-अलग स्तर के साथ, जिसके परिणामस्वरूप मानव आबादी में अंतर व्यापकता20-23है। इसी तरह, चूहों में, यह सूचित किया गया है कि नासोफेरिंजियल उपनिवेशीकरण के जवाब में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की सीमा, और काइनेटिक्स उपनिवेश पर निर्भर है24। इस प्रकार, एक नासोफेरिंजियल उपनिवेशीकरण की स्थापना के लिए उपयोग करने के लिए एक उपयुक्त तनाव का चयन एक मामूली बात नहीं है, और न ही माउस आनुवंशिक पृष्ठभूमि का चयन है। चित्रा 8 नमूना डेटा प्रदान करता है जो C57BL/6 पृष्ठभूमि पर मादा चूहों के इंट्रानासाल उपनिवेशीकरण के बाद 3 अलग एस निमोनिया उपभेदों से एक नासोफेरींजियल उपनिवेशीकरण की निकासी की गतिज को दर्शाता है। तालिका 1 साहित्य में वर्णित 4 एस निमोनिया नैदानिक आइसोलीय उपभेदों के साथ उपनिवेशीकरण समय की उग्रता और लंबाई की डिग्री का अवलोकन प्रदान करता है और25:अविरुल P1121 (सेरोटाइप 23F)26,27 कम उग्रता P1542 (सेरोटाइप 4)28,मध्य उग्रता P1547 (सेरोटाइप 6A)29-31,और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, अच्छी तरह से विशेषता, अत्यधिक उग्र D39 (सेरोटाइप 2)32-36. यदि प्रयोगात्मक लक्ष्य अन्य ऊतकों के लिए कोई साथ जीवाणु प्रसार के साथ एक स्पर्शोन्मुख नाक उपनिवेशीकरण घटना का कड़ाई से अध्ययन करना है, तो हम एकवायरुलेंट P1121 तनाव के उपयोग की सलाह देते हैं, जिसे एक शक्तिशाली उपनिवेशीकरण के रूप में चिह्नित किया जाता है, क्योंकि अब उपनिवेशीकरण की घटनाएं (अवलोकन निकासी से 28 दिन पहले तक) इस तनाव की एक बानगी हैं। आमतौर पर P1121 के साथ उपनिवेश चूहों आक्रामक रोग का कोई खतरा नहीं चलेंगे और बीमारी का कोई नैदानिक संकेतक प्रदर्शित करेगा (अस्थायी वजन घटाने के अपवाद के साथ)। उपभेदों के शेष उग्रता और संबद्ध मृत्यु दर की वांछित डिग्री के आधार पर नियोजित किया जाना चाहिए, उग्रता के साथ संक्रमण की डिग्री है कि एक व्यक्ति माउस के भीतर विकसित नहीं मतलब लिया है, बल्कि चूहों का अनुपात है कि बीमारी के नैदानिक लक्षण प्रदर्शित करते हैं । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि आम तौर पर, उग्रता की डिग्री उपनिवेशीकरण अवधि की लंबाई के साथ उलटा होता है, जिसमें अधिक उग्र उपभेदों को कम अवधि के लिए उपनिवेशित किया जाता है। वर्णित उग्र उपभेदों के सभी 3 के कारण चूहों में मृत्यु दर के लिए नेतृत्व, सबसे अधिक, सेप्सिस, फुलमिनेंट निमोनिया के साथ, या समवर्ती निमोनिया और सेप्सिस चूहों के एक सबसेट में विकसित । आक्रामक बैक्टीरिया के स्थानीयकरण में अंतर तनाव-विशिष्ट हो सकता है, क्योंकि यह पहले बताया गया है कि कुछ उपभेद विशेष अंगों37के लिए ट्रोपिज्म दिखाते हैं। जानवरों के एक छोटे प्रतिशत में, सहज दिमागी बुखार उपनिवेशीकरण के बाद भी विकसित हो सकता है। मृत्यु के कारण का निर्धारण, साथ ही आक्रामकता की डिग्री, अंत बिंदु पर जानवरों से संबद्ध ऊतकों (फेफड़ों, तिल्ली और/या मस्तिष्क) के संग्रह के माध्यम से पूरा किया जा सकता है । इन ऊतकों और बाद में चढ़ाना के समरूपीकरण आक्रामक बैक्टीरिया और इसी टिट्रेस की उपस्थिति का संकेत कर सकते हैं।

बैक्टीरियल कल्चर घनत्व परिमाणीकरण का एक उदाहरण चित्र 3 में दिखाया गयाहै । यदि संस्कृति बहुत केंद्रित है, तो कालोनियों को व्यक्तिगत रूप से गिना जाने के लिए बहुत घनी वृद्धि होती है, हालांकि एकल कोशिकाओं से प्राप्त उपनिवेशों को प्रतिष्ठित किया जा सकता है यदि लॉग-वार कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला को चढ़ाया जाता है। प्रति कमजोर पड़ने वाले तीन तकनीकी प्रतिकृति चढ़ाना परिवर्तनशीलता को कम करता है। कृपया ध्यान दें कि जब नाक उपनिवेशीकरण घटना से प्राप्त बैक्टीरिया की मात्रा, एक cocultured प्रदूषकों का सामना कर सकते हैं, अंय जीवाणु प्रजातियों का प्रतिनिधित्व समवर्ती murine nasopharynx से अलग । यदि ब्याज के जीवाणु तनाव में कोई ज्ञात एंटीबायोटिक प्रतिरोध है (उदाहरण के लिए, एस निमोनिया के कई उपभेदों 5 μg/ml तक gentamycin या neomycin के लिए प्रतिरोधी हैं), एक एक उचित एकाग्रता पर एंटीबायोटिक के साथ विकास मीडिया के पूरक द्वारा संदूषकों की घटनाओं को कम कर सकते हैं, जिससे संदूषक विकास सीमित ।

प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग नाक लावेज नमूनों पर सेल सतह मार्कर का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, संक्रमण के संदर्भ में भर्ती किए गए सेल प्रकारों के विश्लेषण के लिए, मैक्रोफेज (एफ 4/80+),न्यूट्रोफिल (सीडी 11बी+ और Ly6G+) सहित ल्यूकोसाइट्स के सकल भेदभाव के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का मिश्रण, और टी-सेल (सीडी 3 + और सीडी 4+ + या सीडी 8++)का उपयोग पहले प्रकाशित के रूप में किया जा सकता है। इसके अलावा, इन विश्लेषणों को संक्रमण के दौरान प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी को बेहतर ढंग से समझने के लिए विभिन्न ऊतकों या रक्त पर किए गए प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है। कोशिकाओं की सीमित संख्या के कारण (आमतौर पर कम हजारों में संख्या) है कि nasopharynx से अलग किया जा सकता है, दुर्लभ सबसेट की पहचान आम तौर पर चुनौतीपूर्ण है, हालांकि इसे पूरा करने के इच्छुक शोधकर्ताओं को वांछित सेल मायने रखता है प्राप्त करने के लिए कई चूहों से नमूने पूलिंग पर विचार करना चाहिए । इसके अलावा, क्योंकि इस क्षेत्र से कोशिकाओं की एक सीमित संख्या निकाली जा सकती है, हम कुल सेल संख्याओं के संबंध में इस डेटा का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं।

हालांकि प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर आमतौर पर नासोफेरिक्स में कम होता है जो प्रोटीन उत्पादन को परखने की संभावना को सीमित करता है, आरएनए स्तर पर उपनिवेश बैक्टीरिया के जवाब में मेजबान अणुओं के उत्पादन का विश्लेषण करना संभव है। इसे पूरा करने के लिए, पीबीएस के बदले आरएनए लाइसिस बफर का उपयोग करके नाक लैवगेस आयोजित किए जा सकते हैं, जो जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। क्यूपीसीआर प्रवर्धन का पता लगाने के लिए, सही और वांछित उत्पाद का पता लगाने के लिए एक संबंधित वियोजन वक्र(चित्रा 11)चलाना महत्वपूर्ण है। यह इस तथ्य के कारण है कि परख किसी भी डबल फंसे डीएनए का पता लगाएगी जिसमें प्राइमर डिमर, दूषित डीएनए और पीसीआर उत्पाद गलत प्राइमर से शामिल हैं ।

हमें उम्मीद है कि यहां वर्णित तरीके आपको इस अंडरस्टऑड किए गए क्षेत्र के संदर्भ में महत्वपूर्ण रोगजनकों के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक इंट्रानासाल उपनिवेशीकरण मॉडल लागू करने के लिए प्रोत्साहित करेंगे। कुछ मानव रोगजनकों के लिए, जैसे कि एस निमोनिया,एक पूर्ववर्ती नासोफेरींजियल उपनिवेशीकरण घटना आगामी बैक्टीरियल प्रसार और घातक सीक्वेल के लिए एक महत्वपूर्ण अग्रदूत के रूप में कार्य करती है, जिसका पालन फेफड़ों में प्रचार शामिल है, जो निमोनिया का कारण बन सकता है, या किसी और को रक्त के लिए, और परिणामी जीवाणु और सेप्टिक शॉक। इस प्रकार, इस क्षेत्र में बैक्टीरियल उपनिवेशीकरण का अध्ययन करके, हम बेहतर समझ सकते हैं कि इसे कैसे नियंत्रित किया जाए और अधिक गंभीर विकृति को पूरी तरह से होने से रोका जाए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक स्ट्रेप्टोकोकस निमोनियाके नैदानिक उपभेदों के उपहार के लिए पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय के डॉ जेफरी वीसर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । यह काम स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा के संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था । सीवी एक एम जी DeGroote फैलोशिप और कनाडा के वक्ष सोसायटी से एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था । यह काम ओंटारियो फेफड़े एसोसिएशन और स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडा के संस्थानों (CIHR) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । बॉडिश प्रयोगशाला में काम करने के हिस्से में उनका समर्थन किया जाता है माइकल जी डिग्रूट सेंटर फॉर संक्रामक रोग अनुसंधान और मैकमास्टर इम्यूनोलॉजी रिसर्च सेंटर।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1 ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 83 स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया,नाक लावज नासोफेरिन्स मुरीन फ्लो साइटोमेट्री आरएनए मात्रात्मक पीसीआर भर्ती मैक्रोफेज न्यूट्रोफिल टी-सेल प्रभावक कोशिकाएं इंट्रानासाल उपनिवेशीकरण
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Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).

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