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Immunology and Infection

Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/50490
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

Summary

La colonización del nasopharynx murine con pneumoniae del estreptococo y la extracción subsecuente de células adherentes o reclutadas se describe. Esta técnica consiste en enjuagar la nasofaringe y la recolección del líquido a través de las narinas y es adaptable para varias lecturas, incluyendo la cuantificación celular diferencial y el análisis de la expresión de ARNm in situ.

Abstract

La colonización nasofaríngea por Streptococcus pneumoniae es un requisito previo para la invasión a los pulmones o al torrente sanguíneo1. Este organismo es capaz de colonizar la superficie mucosa de la nasofaringe, donde puede residir, multiplicarse y eventualmente superar las defensas del huésped para invadir a otros tejidos del huésped. El establecimiento de una infección en las vías respiratorias normalmente más bajas da lugar a pulmonía. Alternativamente, las bacterias pueden diseminarse en el torrente sanguíneo causando bacteriemia, que se asocia con altas tasas de mortalidad2,o bien conducir directamente al desarrollo de meningitis neumocócica. La comprensión de la cinética de, y las respuestas inmunes a, colonización nasofaríngea es un aspecto importante de los modelos de la infección de los pneumoniae del S.

Nuestro modelo murino de colonización intranasal está adaptado de los modelos humanos3 y ha sido utilizado por múltiples grupos de investigación en el estudio de las respuestas huésped-patógeno en la nasofaringe4-7. En la primera parte del modelo, utilizamos un aislado clínico de S. pneumoniae para establecer una colonización bacteriana autolimitada que es similar a los eventos de transporte en adultos humanos. El procedimiento detallado aquí implica la preparación de un inóculo bacteriano, seguido por el establecimiento de un evento de colonización con la entrega del inóculo vía una ruta intranasal de la administración. Los macrófagos residentes son el tipo de célula predominante en la nasofaringe durante el estado estacionario. Típicamente, hay pocos linfocitos presentes en ratones no infectados8,sin embargo, la colonización de la mucosa conducirá a una inflamación de bajo a alto grado (dependiendo de la virulencia de la especie bacteriana y la cepa) que resultará en una respuesta inmune y el posterior reclutamiento de células inmunes del huésped. Estas células pueden ser aisladas por un lavado del contenido traqueal a través de las narinas, y correlacionadas con la densidad de las bacterias de colonización para comprender mejor la cinética de la infección.

Protocol

Antes de comenzar: todos los pasos se realizan en un Gabinete de Seguridad Biológica (BSC) de Nivel 2 de Riesgo Biológico (BSL2) a menos que se indique lo contrario. Asegúrese de haber obtenido la aprobación de riesgo biológico apropiada para el uso de patógenos bacterianos infecciosos según las directrices institucionales antes del inicio de los experimentos. Además, asegúrese de tener todos los materiales y reactivos necesarios para llevar a cabo el procedimiento preparado de antemano. Los ratones utilizados en estos experimentos han incluido ratones hembra c57BL/6 de Jackson Laboratories, Charles River o Taconic y tenían 10-14 semanas de edad (aunque no hemos encontrado ninguna diferencia significativa dependiente del género en la cinética de la depuración de colonización nasal o infección). Todos los ratones utilizados en estos experimentos fueron criados y mantenidos bajo condiciones libres de patógenos específicos, y estaban libres de virus comunes , (LCMV, MNV, MPV, reovirus ECTV, y otros) bacterias(por ejemplo, H. pylori) y parásitos(por ejemplo, lombriz intestinal, ectoparásitos) por pruebas de muestras fecales, así como la evaluación anatómica frecuente de ratones centinela cohospedados dentro de sus habitaciones de instalaciones. Al realizar estos experimentos, recomendamos usar ratones control no menores de 10-12 semanas de edad y no mayores de 6 meses de edad. Los ratones más jóvenes o mayores que este rango de edad son más susceptibles a una mayor duración del carro nasofaríngeo y a una mayor probabilidad de diseminación de la infección. El fondo del ratón es otra consideración importante que puede afectar los resultados de un experimento de colonización, ya que varios grupos han demostrado que los ratones de diferentes orígenes genéticos tienen diferentes susceptibilidades a la cepa S. pneumoniae D39 (serotipo2) 9,10. S. pneumoniae no es un patógeno murino natural y su único reservorio natural es la nasofaringe humana. La transmisión ocurre a través de gotitas respiratorias, y como los ratones no producen secreciones respiratorias, los ratones individuales no pueden transmitir la bacteria a otros ratones, por lo que no hay preocupación por la transmisión de ratón a ratón11. Para una visión general visual de los procedimientos descritos en este manuscrito, por favor refiérase a la Figura 1.

1. Preparación del cultivo de S. pneumoniae

  1. Inocular 5 ml de agar tríptico de soja para el crecimiento en suspensión de Streptococcus pneumoniae.
  2. Cultivo en condiciones estáticas a 37 °C en CO2 al 5% hasta que el inóculo bacteriano alcance la fase logarítmica de crecimiento con una densidad líquida correspondiente de10 8 UFC/ml, según lo determinado por un odómetro establecido en 600 nm. La lectura exacta correspondiente a esta UFC variará dependiendo de la cepa bacteriana específica seleccionada; para la mayoría de las cepas de S. pneumoniae esto corresponde a un rango de OD600 de 0.45-0.55. Típicamente, las cepas de S. pneumoniae en cultivo líquido crecerán hasta esta densidad dentro de 1.5-2.5 hr bajo las condiciones recomendadas, sin necesidad de subcultar. No se debe permitir que el cultivo crezca en exceso (más allá de una lectura de OD de 0,75), ya que esto representa el punto en el que las bacterias ya no están en fase de crecimiento log y están experimentando una autólisis extensa.
  3. Cada ratón será inoculado con aproximadamente 107 bacterias. Por lo tanto, por cada 9 ratones a colonizar, pipetear 1 ml de inóculo en un tubo de Eppendorf y girar a 15.000 x g durante 1 min. Un pellet blanquecino debe ser visible. Retirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar al pellet y resuspend las bacterias en 100 μl de solución salina tamponada de fosfato (PBS), aumentando así la concentración a 109 UFC/ml. En esta etapa, las bacterias deben seguir siendo viables, pero no se replicarán fácilmente.
  4. Si usa múltiples alícuotas, combine en un tubo para controlar las ligeras variaciones entre muestras en la densidad bacteriana.
  5. Mantenga las bacterias en el hielo hasta que estén listas para la inoculación, durante un máximo de 1 hora.
  6. Para obtener un recuento bacteriano exacto, realice series de dilución en serie log-wise comenzando con un inóculo bacteriano ordenado. Diluir en serie 10 veces, añadiendo 10 μl de a 90 μl de PBS estéril.
  7. Platee 3 gotas de muestras de 10 μl de diluciones 10-5 - 10-9,más un control de contaminación solo de PBS, en secciones etiquetadas por separado de agar soja tríptico (TSA) placa complementada con 5% de sangre de oveja (Figura 2). Asegúrese de que las puntas de las pipetas se cambien para cada paso diluyendo de una mayor concentración de UFC a una menor concentración de UFC para evitar el exceso de bacterias y el aumento de la variabilidad de los resultados. Las placas de agar sangre humana (HBA) también se pueden usar en lugar de TSA. Dado que muchas cepas de S. pneumoniae son resistentes a la neomicina (de 5-20 μg/ml), este antibiótico también se puede añadir al medio de agar de elección durante la fase de preparación de la placa. Esto facilita la enumeración, ya que elimina las bacterias noresistentes. La susceptibilidad a los antibióticos de cada cepa debe probarse de antemano para determinar la concentración óptima de antibióticos a utilizar para cada cepa bacteriana.
  8. Dejar secar durante 15-30 min al descubierto, luego cubrir las placas y colocar boca abajo en la incubadora bacteriana a 37 °C y 5% deCO2. Crecer colonias bacterianas en el plato durante 24 horas.
  9. Determinar el número de unidades formantes de colonias y su correspondiente concentración. Sobre la base de las determinaciones del valor de OD600, la concentración debe estar dentro del rango de 1-4 x 109 UFC/ml. Las colonias de S. pneumoniae deben aparecer como colonias pequeñas y circulares de color amarillento-beige, con una pequeña depresión en el centro que les da un aspecto de rosquilla (Figura 3).

2. Colonización Intranasal Murina

  1. Sujete a los ratones colocándolos en un aparato de sujeción de ratón (un tubo Falcon modificado de 50 ml con la punta cortada para crear una abertura) asegurándolos por la base de su cuerpo con el pulgar para que sus narices simplemente emerjan del extremo cónico del aparato de sujeción(Figura 4). El uso de este aparato permite la inmovilización de la cabeza del ratón y la segregación de sus narinas de una manera que minimiza el movimiento, así como impide los intentos del animal para masticar la punta de la pipeta, lo que permite la entrega completa del inóculo. Alternativamente, los ratones pueden ser inmovilizados a través de raspado en el cuello y la sujeción manual. No se recomienda anestesia de los animales antes de la inoculación intranasal. La administración del inóculo a animales bajo anestesia da como resultado que parte del inóculo se propague a los pulmones12,13.
  2. Usando una pipeta P10 o P20, inocular cada ratón depositando 10 μl del cultivo preparado, distribuyéndolo uniformemente entre ambas narinas (permitir que el inóculo gotee en la nariz pulsando la inoculación gradualmente, tomando tiempo para que los ratones inhalen el inóculo). Para lograr la entrega completa del inóculo, pausar la administración en cualquier momento en que el ratón comience a mover la nariz excesivamente. El inóculo entero no se puede inyectar en las narinas como los ratones pueden expulsar algunos a través de la nariz durante la exhalación; sin embargo, como la cantidad expulsada tiende a ser minúscula, y el inóculo contiene una cantidad extremadamente alta de bacterias, esto no afecta significativamente la carga bacteriana colonizadora. Adicionalmente, la superficie disponible para la colonización en la mucosa nasofaríngea es limitada y en consecuencia nosotros y otros hemos encontrado que la dosis recomendada de 107 es suficiente para obtener niveles consistentes de bacterias en todos los ratones, resultando en una variabilidad mínima en las cantidades iniciales de bacterias colonizantes14,15.
  3. Pesar ratones si se utilizan indicadores de peso como parte de su monitoreo de punto final. Monitoree ratones cada 12-24 horas para detectar síntomas clínicos, incluyendo letargo, piel con volantes y pérdida de peso. Los ratones típicamente no mostrarán síntomas de enfermedad hasta 3-5 días después de la colonización, y estos serán precedidos por la pérdida de peso que puede promediar alrededor del 5% del peso corporal total al día. A medida que los ratones se enferman cada vez más, asumirán posturas encorvadas y mostrarán una disminución de la actividad y una menor capacidad de respuesta a la estimulación, incluido el manejo. En esta etapa, la enfermedad es típicamente indicativa de sepsis y/o neumonía y probablemente será terminal, aunque los ratones pueden ser tratados con 1 ml de solución salina subcutánea diariamente para mejorar los resultados. Los ratones supervivientes deben comenzar a mostrar mejoría después de la post-colonización del día 7, como lo demuestra la estabilización del peso seguida de aumento de peso, aunque diferentes cepas de S. pneumoniae pueden inducir la enfermedad más rápidamente y dar lugar a la progresión de los síntomas clínicos a lo largo de una línea de tiempo diferente. Consulte la Figura 5 para obtener un resultado representativo del peso rastreado en ratones colonizados con la cepa P1547.

3. Recolección de muestras de lavado nasal

Antes de comenzar: prepare agujas canuladas usando jeringas de 1 ml tapadas con agujas biselas 26 3/8 G. Corte piezas de 2,5 cm de tubo de polietileno PE20 con un diámetro interior de 0,38 mm, asegurando que cada extremo tenga una punta biselinada. Usando fórceps, deslice una pieza de 2,5 cm de largo de tubo de polietileno PE20 (diámetro interior 0,38 mm) sobre la punta de la aguja, evitando perforar el lado del tubo. Las agujas canuladas se pueden mantener en etanol al 70% hasta que sea necesario.

  1. Eutanasia ratones experimentales. Pues la dislocación cervical puede dañar potencialmente la tráquea, este método de eutanasia debe ser evitado. Nuestro método preferido es la anestesia con isoflurano seguida de exsanguinación, sin embargo, asegúrese de seguir las pautas institucionales al seleccionar el modo de eutanasia.
  2. Utilizando etanol acuoso al 70%, esteriliza el pelaje superoanterior del animal, particularmente el cuello, teniendo cuidado de evitar que el etanol acceda a las narinas.
  3. Haga un solo corte longitudinal a lo largo de la línea media del cuello del animal, y dos cortes horizontales en cada extremo, creando una abertura para visualizar la tráquea.
  4. Desprenda cuidadosamente la piel hacia a cada lado, revelando el tejido del cuello debajo.
  5. La tráquea debe ser visible, rodeada de músculos longitudinales a cada lado. Snip cuidadosamente estos para proporcionar una visión clara de la tráquea en sí, teniendo cuidado de no cortar la vasculatura circundante.
  6. Si la vasculatura se cortó y la sangre está presente, antes de proceder, permita que el sangrado se detenga y luego limpie el área varias veces dispensando PBS estéril y usando gasa estéril para absorber suavemente el exceso de humedad en el área.
  7. Una vez que la tráquea está correctamente expuesta, hacer un corte transversal y semilunar en la tráquea a mitad de camino hacia arriba (Figura 6).
  8. Elabore 1.000 μl de PBS esterilizado en una aguja cannulada previamente preparada.
  9. Inserte la cánula en la tráquea hacia la nariz, manteniendo el borde biselizado apuntando hacia abajo para facilitar la inserción (Figura 7). Una vez que la aguja esté en su lugar, rótela 180° y sondee suavemente hacia arriba hasta que sienta resistencia a la luz.
  10. Coloque Eppendorf designado para la recolección de muestras justo debajo de la nariz del ratón.
  11. Pruebe la colocación correcta de la aguja dispensando una cantidad mínima (~ 20 μl) de líquido de lavado PBS: se debe formar una gota de líquido alrededor de las narinas del ratón; si éste es el caso, vaya al paso 3.13).
  12. Si el PBS de prueba emerge directamente de la boca del animal, tire de la cánula hacia atrás y reposicione de nuevo sondeando suavemente hacia adelante hasta que se sienta una resistencia muy leve: tenga cuidado de no empujar la cánula demasiado lejos más allá de esta resistencia, ya que la moverá más allá del paladar nasal y a través de la cavidad oral.
  13. Dispense el contenido de la aguja rápidamente para ayudar a desplazar y recoger la cantidad máxima de células - el contenido debe fluir a través de las narinas del ratón y en el tubo de recolección. Coloque la muestra inmediatamente sobre el hielo.
  14. Para recoger muestras para el análisis de ARN, repita los pasos 3.8-3.13) utilizando una aguja cannulada que contiene 500 μl de tampón de lisis de ARN en el mismo ratón. Esto permitirá la recolección de muestras de lisato de las poblaciones celulares restantes, compuestas en gran parte por el epitelio de la mucosa nasofaríngea, ya que las células no acomodantes deberían haber sido eliminadas después del lavado inicial de PBS. Tenga en cuenta que el tampón de lisis de ARN denude el epitelio y destruirá el tejido circundante, por lo que se debe tener cuidado para evitar el contacto con órganos como los pulmones, si se desea la retención de estos tejidos. Una vez recolectada, coloque la muestra en el tampón de lisis de ARN directamente sobre el hielo seco para congelarse. Una vez en el tampón de lisis, las muestras se pueden almacenar según las instrucciones del fabricante, y son estables normalmente a -70 °C durante varios meses.

4. Determinación de la carga bacteriana en la nasofaringe

  1. Quantitate bacteria mediante la preparación de una serie de dilución en serie para cada muestra de lavado nasal murino. En general, se puede esperar que la carga bacteriana esté entre 0-104 UFC, por lo tanto, realice tres diluciones en serie de 10 veces. Añadir 10 μl de la muestra de lavado nasal ordenada (100 UFC/ml) al primer tubo a una concentración de 10-1 UFC/ml. Vórtice a fondo.
  2. Divida la placa bacteriológica en cuadrantes y etiquete los cuadrantes cada uno con un miembro de la serie de dilución (100-10-3 UFC/ml). Platee 3 gotas de muestras de 10 μl de las 3 diluciones y la muestra ordenada en placas de agar soja trípticas complementadas con 5% de sangre de oveja, como en la Figura 2.
  3. Dejar secar durante 15-30 min al descubierto, luego cubrir las placas y colocar boca abajo en la incubadora bacteriana con condiciones óptimas para el crecimiento bacteriano (típicamente 37 °C y 5% CO2).
  4. Crecer colonias bacterianas en el plato durante 18-24 horas.
  5. Determinar el número de bacterias colonizadoras promediando las colonias formadas en placa para cada dilución (Figura 3). La Figura 8 demuestra la densidad bacteriana durante diferentes puntos de tiempo, según lo determinado por el cultivo de lavados nasales, en ratones colonizados con 3 cepas diferentes de S. pneumoniae durante un período de hasta 21 días.

5. Preparación de muestras para el citómetro de flujo

Antes de comenzar: Preparar mezcla de anticuerpos. Para la cuantificación de poblaciones de leucocitos, recomendamos la siguiente mezcla en las diluciones especificadas: PE-Ly6G (clon 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (clon AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (clon 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (clon PM8 RUO, 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5.5-CD11c (clon N418 RUO, 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (clon M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (clon 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (clon GK1.5, 6,67 μg/ml). Tenga en cuenta que esta mezcla es de 2x concentración (ver paso 5.5). Todos los anticuerpos deben diluirse en Tampón de lavado de FACs (0,5% suero fetal de terneros, 2mM de EDTA, 0,1% de azida de sodio en PBS) que también debe prepararse de antemano. En una mezcla de isotipo emparejado, se deben preparar anticuerpos de control, idealmente del mismo proveedor que los anticuerpos etiquetados y en las mismas concentraciones que los anticuerpos específicos. Las muestras tratadas con los anticuerpos de control de isotipo funcionarán como el control negativo. Cualquier fluorescencia observada en las muestras tratadas con los anticuerpos de control del isotipo debe considerarse de fondo.

  1. Prechill una centrífuga capaz de hacer girar 1,5 ml tubos Eppendorf a 4 °C.
  2. Centrífuga nasal de lavado muestras a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C. Pipetear cuidadosamente el sobrenadante y reservar. Nota: debido a la pequeña cantidad de células dentro de la nasofaringe, el pellet celular no será visible a menos que haya contaminación de glóbulos rojos no deseados, que será de color rojo brillante. Si esto se ve, la muestra debe ser desechada.
  3. ¿Resuspend muestra en 50 μl de Fc? Anticuerpo RIIb/CD16-2 (2.4G2) (que se une a los receptores Fc y reduce la unión a anticuerpos inespecíficos) en facs Wash Buffer a una concentración de 4 μg/ml.
  4. Incubar la muestra sobre hielo durante 30 min.
  5. Añadir 50 μl de preprepared 2x mezcla de anticuerpos fluorescentes concentrados a la muestra. Apartar una muestra representativa de cada grupo experimental para que actúe como control de isotipos. Agregue la mezcla de anticuerpos de isotipo a esta muestra en lugar de la mezcla de manchas.
  6. Incubar la muestra sobre hielo durante 1 hora.
  7. Muestras de centrífuga a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y resuspend en 200 μl de PBS.
  8. Repita el paso 5.7.
  9. Después del segundo lavado, centrífuga muestre de nuevo a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  10. Resuspend en cualquiera en PBS (si se ejecuta la muestra inmediatamente) o 2% paraformadehído (si se ejecutan muestras 1-3 días después de la tinción).
  11. Al realizar citometría de flujo recoger la cantidad máxima de eventos por muestra o hasta que toda la muestra ha sido aspirada. En ratones jóvenes, sanos y no infectados, esto será tan poco como 1,000-2,000 eventos totales; Durante un evento de colonización bacteriana, este número puede aumentar más de 2 a 5 veces dependiendo del estado de la enfermedad en animales y factores como la edad y el fondo genético. La Figura 9 muestra los resultados representativos de la citometría de flujo recogidos de un citómetro de flujo Becton Dickenson LSRII de 3 láseres utilizando una dispersión directa de 450 y una dispersión lateral de 300, aunque recomendamos optimizar los parámetros para el citómetro de flujo específico que pretende utilizar antes de la recolección de muestras. Nota: si una muestra contiene incluso trazas de contaminación de la sangre, los eventos totales recogidos serán significativamente más altos de lo esperado y la muestra debe descartarse del análisis.

6. Análisis cuantitativo de PCR (qPCR) de lavados nasales

  1. Descongelar la célula se liste a partir del paso 3.14 a temperatura ambiente.
  2. Siga el protocolo recomendado proporcionado con la extracción de ARN preferida de elección.
  3. Después de completar el procedimiento de extracción de ARN según las instrucciones, cuantifique la cantidad de ARN utilizando un espectrofotómetro o un método basado en electroforesis (Figura 10). Obtenemos rutinariamente entre 975 y 3.250 ng de ARN total por muestra con una relación de 260/280 nm de >1,7 o un número de integridad de ARN (RIN) alrededor, 8,1±0,13.
  4. Transcriba el ADNc usando la transcriptasa inversa M-MULV según el protocolo del fabricante con 1.000 ng de ARN (máximo 13 μl).
  5. Diluir las muestras de ADNc resultantes 8x, y alícuota igualmente en 4 tubos separados para su almacenamiento a largo plazo a -20 u -80 °C.
  6. Para medir la expresión génica por qPCR, prepare 25 μl de muestras de reacciones en triplicado sobre hielo o bloque frío que contengan: 12,5 μl de 2x qPCR master mix del kit qPCR de su elección, 0,25 μl de colorante de referencia, 2 μl de ADNc diluido (paso 7,5), 1 μl de cebadores mixtos delanteros e inversos (400 nM final), 9,25 μl de agua libre de RNAse-DNAse. Este protocolo es una adaptación de métodos previamente publicados16.
  7. En general encontramos que una amplificación qPCR de dos pasos (95 °C durante 10 min seguida de hasta 40 ciclos x [95 °C x 15 seg, 60 °C x 1 min]) es efectiva (Figura 11a); sin embargo, cada par de cebadores debe optimizarse. Las curvas de disociación (fusión) deben realizarse después de la amplificación para garantizar que no se produzca ninguna amplificación inespecífica. amplificación (Figura 11b)
  8. Rutinariamente ejecutamos curvas estándar para cada gen analizado, así como un calibrador estándar (derivado de homogeneizar de pulmón o bazo) para cada placa de 96 pozos analizada. Las cantidades relativas de transcripción se obtienen normalizando primero los valores del umbral de ciclo bruto (Ct) por el tinte de referencia y transformando los valores resultantes a través de la curva estándar respectiva. Estas cantidades relativas se normalizan posteriormente al calibrador estándar y a un gen de limpieza, según corresponda.

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Representative Results

La figura 1 representa un esquema general que resume los pasos principales del protocolo. Las figuras 2-3 proporcionan una visualización de la metodología microbiológica inherente a los protocolos aquí descritos. La Figura 4 representa el posicionamiento adecuado de un ratón para realizar una colonización intranasal, mientras que la Figura 5 representa típicamente los cambios en el peso de los ratones colonizados con S. pneumoniae cepa P1547. Las figuras 6-7 representan etapas específicas de la porción de lavado nasal del proceso, para la visualización asistida de estas dos técnicas. Las figuras 8-11 consisten en resultados representativos de análisis realizados en muestras recogidas de la nasofaringe de un ratón después del lavado nasal. Específicamente, la Figura 8 es un resultado representativo de la carga bacteriana en la nasofaringe, según se determina mediante el cultivo de lavados nasales obtenidos de ratones colonizados con la cepa P1121, P1547 o P1542 de S. pneumoniae. La Figura 9 representa el fenotipado celular de células inmunes nasofaríngeas aisladas utilizando técnicas citométricas de flujo. Las figuras 10-11 muestran resultados representativos relacionados con el análisis expresional del ARNm nasofaríngeo mediante PCR cuantitativa.

Figure 1
Figura 1. Diagrama de flujo de los procedimientos intranasales de la inoculación y del aislamiento nasal de la célula del lavado usando un modelo del ratón. En primer lugar, las bacterias se preparan para la inoculación, y luego se dan a los sujetos murinos por vía intranasal. Después de que transcurra el período de tiempo deseado, los ratones son eutanasiados a través de sangrado terminal, y sus células nasofaríngeas se aíslan a través de dos pasos de lavado nasal: un paso de lavado de PBS seguido de un lavado secundario en el tampón de lisis de ARN. Las células del lavado preliminar de PBS se aíslan y analizan mediante técnicas de citometría de flujo, mientras que el ARN aislado de la segunda muestra se puede utilizar para investigar las abundancias relativas de moléculas de interés a nivel transcripcional.

Figure 2
Figura 2. Para determinar la concentración bacteriana, las gotas de 10 μl se platea por triplicado en una placa dividida en secciones que representan una dilución en serie diferente. Estas gotas se deja secar y las placas se incuban durante la noche a 37 °C, 5% de CO2.

Figure 3
Figura 3. Concentración de Streptoccous pneumoniae aislado de la nasofaringe de un animal representativo. Cada colonia discreta representa una unidad formadora de colonia, cada colección de colonias representa una gota de 10 μl (plateada en triplicados) y cada cuadrante en la placa representa una dilución serial separada. La concentración bacteriana se determina en UFC/ml promediando el número de colonias numerables y completamente formadas dentro de los cuadrantes calificados y luego entre ellos.

Figure 4
Figura 4. El movimiento de cualquier ratón a inocular debe minimizarse, particularmente en el cuello, para permitir la entrega adecuada de inóculo bacteriano. Para lograr esto, el ratón sujeto se sujeta en un aparato de restricción modificado que consiste en un tubo Falcon de 50 ml con una abertura en su extremo cónico. A continuación, se coloca el ratón de manera que su nariz emerge de la abertura, donde el investigador puede acceder a él, lo que permite realizar la inoculación intranasal.

Figure 5
Figura 5. Peso de ratones colonizados con la cepa P1547 de un mínimo de 2 experimentos representativos rastreados diariamente después de la inoculación inicial (n = 6) para representar los cambios típicos en el peso esperado después de la colonización nasofaríngea. El peso se muestra como un cambio porcentual del peso inicial. Tenga en cuenta la pérdida de peso inicial aguda esperada visto entre los días 3-5, seguido de estabilización y aumento gradual de peso en ratones sobrevivientes.

Figure 6
Figura 6. Tras la exposición traqueal, los músculos longitudinales que flanquean se quitan cuidadosamente antes de la incisión traqueal de una manera que no severo los vasos sanguíneos circundantes. Una pequeña incisión semilunar entonces se hace a mitad de camino hasta la tráquea usando tijeras quirúrgicas finas. Es importante cortar a través del diámetro de la tráquea sólo parcialmente, dejándola intacta posteriormente.

Figure 7
Figura 7. Inserción de la aguja cannulada en la abertura traqueal hacia arriba hacia la nariz. Una vez que la cánula está en su lugar, sondear suavemente hasta que se cumpla la resistencia, a continuación, enjuague el contenido a través de las narinas.

Figure 8
Figura 8. Una serie representativa de carga bacteriana aislada de la nasofaringe mediante el procedimiento de lavado nasal descrito después de la colonización de ratones C57BL/6 (triángulos) con S. pneumoniae cepa P1547 (A), P1542 (B) o P1121 (C). Una colonización comparativa de ratones BALB/C (círculos) después de la colonización P1121 también se muestra en (C). Se muestran diferentes puntos de tiempo a lo largo del curso de la colonización, incluidos los días 3, 7, 14 y 21. En general, se espera una carga inicial alta en el día 3, con poca disminución en el día 7. El aclaramiento se inicia típicamente por el día 14, con el aclaramiento completo o casi completo evidenciado por el día 21 después de la colonización con la mayoría de las cepas. Haga clic aquí para ver la figura más grande.

Figure 9
Figura 9. Histograma representativo (A) y gráfica de puntos (B) de células totales aisladas de lavados nasales murinos analizados por citometría de flujo. La expresión diferencial de marcadores en poblaciones celulares permite la identificación de subconjuntos leucocitarios mediante el uso de anticuerpos fluorescentes dirigidos contra estas proteínas. Como se muestra aquí, las poblaciones de leucocitos se seleccionan primero mediante el gating en las células singlete utilizando una dispersión directa (área) frente a la dispersión directa (ancho) puerta (A), y luego enriqueciendo para las células CD45 + dentro de ese subconjunto(B). Esta población se puede subdividir más a fondo en tipos específicos de la célula por gating para los neutrófilos positivos dobles CD11b y Ly6G (C). El análisis de la población de CD11b- se puede conducir para revelar F4/80+, CD11b-macrófagos(d)o CD11b-, CD3 y CD4 doble positivo CD4 células de T(E). Las poblaciones celulares pueden ser fenotipadas siempre y cuando expresen uno, o una combinación de varios receptores de superficie únicos que se pueden utilizar para distinguirlos de otros tipos de células. Haga clic aquí para ver la figura más grande.

Figure 10
Figura 10. Electropherogram representativo que sigue la secuencia automática de la electroforesis de una muestra aislada de lavados nasales murine. El electroferograma resultante muestra los datos de cuantificación y la firma característica de una muestra de ARN total de alta calidad derivada de la región nasofaríngea. Al realizar análisis de ARN total, las áreas bajo los picos de ARN para los dos PRINCIPALES ARN ribosómicos, 18S y 28S, se utilizan para calcular su relación correspondiente. Los cambios significativos en los cocientes de picos atribuibles a 18S y a 28S son típicamente indicativos de ARN degradado. El grado de degradación se puede resumir por el número de integridad del ARN (RIN); el RIN para esta muestra representativa es 8.1. Un ejemplo de ARN altamente degradado se muestra en (B) y (C), y el RIN posterior es 1.9 y 4.6, respectivamente. Haga clic aquí para ver la figura más grande.

Figure 11
Figura 11. Gráfica de amplificación (A) y curva de disociación (fusión) (B) del análisis qPCR de los lisiados nasales de células de lavado, proporcionando un ejemplo de cómo estas dos lecturas deben verse típicamente después de una amplificación eficiente y correctamente detectada de productos de ARNm aislados de la nasofaringe murina. Se representa una curva estándar para el gen de limpieza 18S. Los resultados mostrados en(a)muestran el producto deseado de la polimerización en cadena después de la amplificación usando los cebadores contra GAPDH. La línea representa el umbral de ciclo (Ct). El punto en el que las gráficas de amplificación correspondientes a diferentes muestras cruzan este umbral permite la comparación entre muestras, con valores más bajos correspondientes a mayores cantidades de ARN de interés contenidas en ellas. La gráfica en (B) muestra que la temperatura máxima de fusión del producto qPCR es de 85 °C y que no hay productos contaminantes presentes en esta reacción, lo que aparecería como un pico adicional separado del pico del producto deseado. Haga clic aquí para ver la figura más grande.

Nombre de la cepa serotipo Virulencia Mortalidad en ratones Duración esperada de la colonización
P1121 23F Asintomático 0% 21-28 días
P1542 4 Bajo 0-20% 21-28 días
P1547 6A medio 20-50% 14-21 días
D39 2 Alto 70-100% 14-21 días

Tabla 1. Una descripción tabular de 4 tensiones clínicas comúnmente empleadas del aislante de los pneumoniae del S., su número correspondiente del serotipo, grado asociado de virulencia, proporción esperada de en invasividad dentro de un subconjunto colonizado de ratones y duración típica de una colonización nasofaríngea.

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Discussion

En este estudio se presentaron métodos detallados para la colonización intranasal de ratones utilizando una cepa aislada clínica de Streptococcus pneumoniae y el posterior aislamiento y caracterización de las células inmunes reclutadas a la nasofaringe en respuesta a las bacterias. Demostramos cómo un inóculo bacteriano puede ser cultivado en medios ricos en nutrientes y utilizado para establecer un evento de colonización en ratones, que inicialmente se restringe a la nasofaringe. Luego mostramos cómo los tipos de células inmunes que responden que se reclutan para la nasofaringe se pueden aislar después de la exposición traqueal, la incisión y un lavado nasal mediante el uso de una aguja cannulada. Las muestras de lavado nasal se pueden recolectar en PBS para aislar las células intactas y ligeramente adherentes; el ARN de células más firmemente adherentes y de la capa de la mucosa epitelial circundante se puede aislar aplicando un amortiguador secundario de la lisis del ARN que consiste en la colada. La primera de estas muestras se puede utilizar para fenotipo de las células específicas reclutadas en el contexto de la colonización a través de técnicas de citometría de flujo, mientras que la segunda se puede aplicar al análisis Q-PCR, para determinar las funciones efectoras de estas células reclutadas mediante la búsqueda de la expresión transcripcional de los reguladores inmunes de interés. Las muestras de lavado nasal se pueden utilizar además para determinar la cinética de la separación de un evento bacteriano de la colonización comparando diversos grupos experimentales para dirigir preguntas específicas de la investigación.

La utilización de este método de colonización intranasal permite el establecimiento de un evento de colonización que se limita inicialmente a la nasofaringe del animal. Por lo tanto, cualquier diseminación posterior de las bacterias a la sangre u órganos es secundaria a las brechas en las defensas inmunes localizadas dentro de la mucosa nasofaríngea. La progresión gradual lograda a través de este modelo refleja con mayor precisión el proceso de invasión neumocócica en humanos, lo que permite estudiar la dinámica entre las bacterias colonizantes y la mucosa nasal del huésped , y tal vez comprender mejor los cambios en la patogenicidad bacteriana y / o la inmunidad del huésped que permiten el desarrollo de la diseminación de la enfermedad. Esto contrasta con los modelos que renuncian al establecimiento de un evento de colonización inicial y optan por estudiar la enfermedad invasiva de forma aislada a través de la entrega directa del inóculo bacteriano a los pulmones a través de la instilación intratrachael, a la sangre a través de la inyección vascular o al peritoneo a través de la inyección peritoneal.

La realización de un lavado nasal de PBS después de un evento de colonización permite el aislamiento de las células no adherentes o ligeramente adherentes reclutadas a la nasofaringe, así como cualquier bacteria asociada mucosally. Cabe señalar, sin embargo, que esta técnica es limitada, ya que no liberará células o bacterias que hayan viajado entre o debajo del epitelio, ni permitirá la recolección de células o bacterias que se han localizado en el tejido linfoide asociado a la nasal (NALT), un órgano linfoide que se ha reportado como un sitio potencial de infección después de una colonización neumocócica17,18. Si el estudio adicional del NALT se desea, recomendamos el microdissection y el retiro de este tejido al por mayor para el estudio que sigue lavado nasal de PBS; como estas dos técnicas no son mutuamente excluyentes, pueden llevarse a cabo en el mismo animal. Sin embargo, debido a la naturaleza lítica y destructiva de la etapa de recolección de ARN (el lavado secundario utilizando tampón de lisis de ARN), este paso debe omitirse si se pretende cosechar el NALT. Aunque el lavado nasal es un procedimiento menos desafiante técnicamente, para los grupos que deseen obtener una evaluación más completa de la carga bacteriana que incluya no sólo las bacterias asociadas a la mucosalidad, sino también aquellas que han invadido el tejido nasofaríngeo, sugerimos la recolección del tejido nasofaríngeo después de la extracción del hueso superior del cráneo de ratones colonizados y la disección del tejido dentro de las conchas nasales, como lo describen otros19.

La naturaleza de una respuesta inmune provocada depende de la interacción entre el huésped y el patógeno. Hasta la fecha se han caracterizado más de 90 serotipos de S. pneumoniae, todos con diferentes niveles de patogenicidad y expresión del factor de virulencia, resultando en prevalencia diferencial en la población humana20-23. Del mismo modo, en ratones, se ha reportado que la extensión y cinética asociada a la respuesta inmune provocada en respuesta a una colonización nasofaríngea depende de la propia cepa colonizadora24. Por lo tanto, la selección de una cepa apropiada para utilizar para el establecimiento de una colonización nasofaríngea no es un asunto trivial, como tampoco lo es la selección de antecedentes genéticos de ratón. La Figura 8 proporciona datos de muestra que representan la cinética del aclaramiento de una colonización nasofaríngea a partir de 3 cepas diferentes de S. pneumoniae después de la colonización intranasal de ratones hembra en un fondo C57BL/6. La Tabla 1 proporciona una visión general del grado de virulencia y la duración del tiempo de colonización esperado (cuando se utiliza en el fondo C57BL/6) con 4 cepas aisladas clínicas de S. pneumoniae descritas en la literatura y que se sabe que son capaces de establecer una colonización nasofaríngea25:la avirulente P1121 (serotipo23F) 26,27 la baja virulencia P1542 (serotipo 4)28,la media virulencia P1547 (serotipo 6A)29-31,y la ampliamente utilizada, bien caracterizada, altamente virulenta D39 (serotipo 2)32-36. Si la meta experimental es estudiar terminantemente un acontecimiento nasal asintomático de la colonización sin la difusión bacteriana de acompañamiento a otros tejidos, recomendamos el uso de la tensión avirulent P1121, que se caracteriza como colonizador potente, pues los acontecimientos más largos de la colonización (hasta 28 días antes de la separación observada) son un sello distintivo de esta tensión. Por lo general, los ratones colonizados con P1121 no correrán ningún riesgo de enfermedad invasiva y no mostrarán indicadores clínicos de enfermedad (con la excepción de la pérdida de peso temporal). El resto de las cepas deben emplearse dependiendo del grado deseado de virulencia y la mortalidad asociada, con virulencia tomada para significar no el grado de infección que se desarrolla dentro de un ratón individual, sino más bien la proporción de ratones que muestran signos clínicos de enfermedad. También debe tenerse en cuenta que típicamente, el grado de virulencia se correlaciona inversamente con la duración de la colonización, con cepas más virulentas colonizando durante un período de tiempo más corto. Las 3 cepas virulentas descritas conducen a la mortalidad en ratones debido, más comúnmente, a la sepsis, con neumonía fulminante, o neumonía concurrente y sepsis que se desarrolla en un subconjunto de ratones. Las diferencias en la localización de bacterias invasoras pueden ser específicas de la cepa, ya que se ha informado previamente que ciertas cepas muestran tropismos para órganos particulares37. En un pequeño porcentaje de animales, la meningitis espontánea también puede desarrollarse después de la colonización. La determinación de la causa de muerte, así como el grado de invasividad, se puede lograr a través de la recolección de tejidos asociados (pulmones, bazo y/o cerebro) de animales en el punto final. La homogeneización de estos tejidos y el posterior revestimiento pueden indicar la presencia de bacterias invasoras y los títulos correspondientes.

Un ejemplo de una cuantificación de densidad de cultivo bacteriano se muestra en la Figura 3. Si el cultivo está demasiado concentrado, las colonias crecen demasiado densamente para ser contadas individualmente, sin embargo, las colonias derivadas de células individuales se pueden distinguir si se platea una serie de dilución logarítmica. El revestimiento de tres réplicas técnicas por dilución minimiza la variabilidad. Tenga en cuenta que al cuantificar las bacterias recuperadas de un evento de colonización nasal, uno puede encontrar contaminantes cocultivos, que representan otras especies bacterianas aisladas simultáneamente de la nasofaringe murina. Si la cepa bacteriana de interés tiene resistencias a los antibióticos conocidas (por ejemplo, muchas cepas de S. pneumoniae son resistentes a la gentamicina o neomicina hasta 5 μg/ml), se puede minimizar la incidencia de contaminantes complementando los medios de crecimiento con el antibiótico a una concentración adecuada, limitando así el crecimiento de contaminantes.

La citometría de flujo se puede utilizar para analizar marcadores de superficie celular en muestras de lavado nasal. Por ejemplo, para el análisis de tipos celulares reclutados en el contexto de una infección, se puede utilizar una mezcla de anticuerpos específicos para la diferenciación gruesa de leucocitos, incluyendo macrófagos (F4/80+),neutrófilos (CD11b+ y Ly6G+),y células T (CD3+ y CD4+ o CD8+),como se publicó anteriormente. Además, estos análisis se pueden combinar con análisis citométricos de flujo realizados en diferentes tejidos o sangre, para comprender mejor el tráfico de células inmunes durante el curso de una infección. Debido al número limitado de células (típicamente numeradas en los miles bajos) que se pueden aislar de la nasofaringe, la identificación de subconjuntos raros es típicamente un desafío, aunque los investigadores que deseen lograr esto deben considerar la agrupación de muestras de múltiples ratones para lograr los recuentos celulares deseados. Además, debido a que se puede extraer un número finito de celdas de esta región, se recomienda analizar estos datos con respecto a los números totales de celdas.

Aunque los niveles de expresión de proteínas son típicamente bajos en la nasofaringe limitando la posibilidad de ensayar la producción de proteínas, es posible analizar la producción de moléculas huésped en respuesta a las bacterias colonizantes a nivel de ARN. Para lograr esto, los lavados nasales se pueden llevar a cabo utilizando tampón de lisis de ARN en lugar de PBS, lo que permite el análisis de la expresión génica. Para la detección de amplificación de qPCR, es importante ejecutar una curva de disociación correspondiente (Figura 11) para asegurar que se detectó el producto correcto y deseado. Esto se debe al hecho de que el ensayo detectará cualquier ADN de doble cadena, incluidos los dímeros de cebadores, el ADN contaminante y el producto de PCR de la imprimación malanada.

Esperamos que los métodos descritos aquí le animen a aplicar un modelo de colonización intranasal para estudiar las respuestas del huésped a patógenos importantes en el contexto de esta región poco estudiada. Para ciertos patógenos humanos, como S. pneumoniae,un evento de colonización nasofaríngea precedente actúa como un precursor importante de la diseminación bacteriana subsiguiente y las secuelas fatales que pueden seguir, incluida la propagación en los pulmones, que puede conducir a neumonía, o bien a la sangre, y la bacteriemia y el shock séptico resultantes. Así, estudiando la colonización bacteriana en esta región, podemos entender mejor cómo controlarla y prevenir patologías más graves que ocurran por completo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer al Dr. Jeffery Weiser de la Universidad de Pennsylvania por su regalo de las cepas clínicas de Streptococcus pneumoniae. Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud. CV fue financiado por una beca M. G. DeGroote y una beca de la Sociedad Torácica Canadiense. Este trabajo fue financiado por la Asociación de Pulmón de Ontario y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). El trabajo en el laboratorio Bowdish es apoyado en parte por el Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research y el McMaster Immunology Research Centre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1 ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

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References

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