Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Karakterisering av inflammatoriska svar under intranasal kolonisering med Streptococcus pneumoniae

Published: January 17, 2014 doi: 10.3791/50490
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

Summary

Kolonisering av murin nasopharynx med Streptococcus pneumoniae och efterföljande extraktion av vidhäftande eller rekryterade celler beskrivs. Denna teknik innebär att spola nasopharynx och insamling av vätskan genom nares och är anpassningsbar för olika avläsningar, inklusive differentialcell kvantifiering och analys av mRNA uttryck in situ.

Abstract

Nasopharyngeal kolonisering av Streptococcus pneumoniae är en förutsättning för invasion till lungorna eller blodomloppet1. Denna organism kan kolonisera nasofarynxens slemhinna, där den kan bo, multiplicera och så småningom övervinna värdförsvar för att invadera till andra vävnader i värden. Etablering av en infektion i de normalt nedre luftvägarna resulterar i lunginflammation. Alternativt kan bakterierna spridas i blodomloppet som orsakar bakteriemi, vilket är förknippat med högdödlighet 2, eller annars leda direkt till utvecklingen av pneumokockhinneinflammation. Att förstå kinetiken i och immunsvar på nasopharyngeal kolonisering är en viktig aspekt av S. pneumoniae infektion modeller.

Vår musmodell av intranasal kolonisering är anpassad från mänskligamodeller 3 och har använts av flera forskargrupper i studien av värdpatogena svar i nasopharynx4-7. I den första delen av modellen använder vi ett kliniskt isolat av S. pneumoniae för att upprätta en självbegränsande bakteriell kolonisering som liknar transporthändelser hos mänskliga vuxna. Förfarandet som beskrivs häri innebär beredning av en bakteriell inokulat, följt av upprättandet av en kolonisering händelse genom leverans av inokulat via en intranasal administreringsväg. Bosatta makrofager är den dominerande celltypen i nasopharynx under steady state. Vanligtvis finns det få lymfocyter närvarande hos oinfekterade möss8, men slemhinnor kolonisering kommer att leda till låg till höggradig inflammation (beroende på bakteriearternas och stammens virulens) som kommer att resultera i ett immunsvar och efterföljande rekrytering av värd immunceller. Dessa celler kan isoleras av en lavage av trakealinnehållet genom narerna och korreleras till koloniseringsbakteriernas densitet för att bättre förstå infektionens kinetik.

Protocol

Innan du börjar: alla steg görs i ett biohazard nivå 2 (BSL2) biologiskt säkerhetsskåp (BSC) om inget annat anges. Se till att du har erhållit lämpligt biohazardgodkännande för användning av infektiösa bakteriella patogener enligt institutionella riktlinjer innan experimenten inleds. Se dessutom till att du har alla material och reagenser som krävs för att genomföra proceduren i förväg. Möss som används i dessa experiment har inkluderat kvinnliga C57BL/6 möss från Jackson Laboratories, Charles River eller Taconic och var 10-14 veckors ålder (även om vi inte har hittat några könsberoende signifikanta skillnader i kinetik av nasal kolonisering klarering eller infektion). Alla möss som användes i dessa experiment uppföddes och bibehölls under specifika patogenfria förhållanden och var fria från vanliga virus ( LCMV, MNV, MPV, reovirus ECTV och andra) bakterier (t.ex. H. pylori) och parasiter (t.ex. pinworm, ektoparasiter) genom fekal provtestning samt frekvent anatomisk bedömning av sentinelmöss som är instängda i deras anläggningsrum. När du utför dessa experiment rekommenderar vi att du använder kontrollmöss som inte är yngre än 10-12 veckor och inte äldre än 6 månaders ålder. Möss yngre eller äldre än detta åldersintervall är mer mottagliga för längre nasofaryngeal transporttid och ökad sannolikhet att sprida infektion. Musbakgrund är en annan viktig faktor som kan påverka resultaten av ett koloniseringsexperiment, eftersom flera grupper har visat att möss med olika genetisk bakgrund har olika mottaglighet för S. pneumoniae D39 (serotyp 2)stam 9,10. S. pneumoniae är inte en naturligt förekommande murin patogen och dess enda naturliga reservoar är den mänskliga nasopharynx. Överföring sker via andningsdroppar, och eftersom möss inte producerar andningssekret kan enskilda möss inte överföra bakterien till andra möss, så det finns ingen oro för mus-till-mus-överföring11. En visuell översikt över de förfaranden som beskrivs i detta manuskript finns i figur 1.

1. Förberedelse av S. pneumoniae Kultur

  1. Inokulera 5 ml tryptisk soja agar för suspension tillväxt av Streptococcus pneumoniae.
  2. Odling under statiska förhållanden vid 37 °C i 5% CO2 tills bakteriell inokulat når logfastillväxt med en motsvarande vätsketäthet på 108 CFU/ml enligt en vägmätare inställd på 600 nm. Den exakta avläsningen som motsvarar denna CFU kommer att variera beroende på den specifika valda bakteriestammen; för de flesta stammar av S. pneumoniae motsvarar detta ett OD600-intervall på 0,45-0,55. Vanligtvis kommer S. pneumoniae stammar i flytande kultur att växa till denna densitet inom 1,5-2,5 timmar under de rekommenderade förhållandena, utan behov av subkultur. Kulturen bör inte tillåtas att växa över (utöver en OD-avläsning på 0,75) eftersom detta representerar den punkt där bakterierna inte längre är i timmerfastillväxt och genomgår omfattande autolys.
  3. Varje mus kommer att vaccinelas med cirka 107 bakterier. För varje 9 möss som ska koloniseras, pipett 1 ml inokulat i ett Eppendorfrör och snurra på 15 000 x g i 1 min. En vitaktig pellet ska vara synlig. Ta bort supernatanten, var försiktig så att du inte stör pelleten och återanvänd bakterierna i 100 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS), vilket ökar koncentrationen till 109 CFU/ml. I detta skede bör bakterierna förbli livskraftiga, men kommer inte lätt att replikera.
  4. Om du använder flera alikvoter, kombinera i ett rör för att kontrollera för små variationer mellan proverna i bakteriell densitet.
  5. Håll bakterierna på is tills de är redo för vaccination i högst 1 timme.
  6. För att få ett exakt bakterieantal, utför log-wise seriell utspädning serie som börjar med snyggt bakteriellt inokulat. Späd seriellt 10-faldigt och tillsätt 10 μl till 90 μl steril PBS.
  7. Plätera ut 3 droppar 10 μl prover av utspädningar 10-5 - 10-9, plus en PBS-endast föroreningskontroll, på separat märkta delar av tryptika soja agar (TSA) platta kompletterad med 5% fårblod (Figur 2). Se till att pipettspetsarna ändras för varje steg som späds från en högre CFU-koncentration till en lägre CFU-koncentration för att undvika att transportera överskott av bakterier och öka variabiliteten hos resultaten. Humana blodagarplattor (HBA) kan också användas i stället för TSA. Eftersom många stammar av S. pneumoniae är resistenta mot neomycin (från 5-20 μg/ml), kan detta antibiotikum också tillsättas det agar medium som du väljer under plattberedningsfasen. Detta underlättar uppräkning eftersom det eliminerar icke-resistenta bakterier. Antibiotikakänsligheten hos varje stam måste testas i förväg för att bestämma den optimala koncentrationen av antibiotika att använda för varje bakteriestam.
  8. Låt torka i 15-30 min avtäckta, täck sedan tallrikar och placera upp och ner i bakterieinkubator inställd på 37 °C och 5% CO2. Odla bakteriekolonier på tallrik i 24 timmar.
  9. Bestäm antalet kolonibildande enheter och motsvarande koncentration. Baserat på bestämningar av OD600-värdet bör koncentrationen ligga inom intervallet 1-4 x 109 CFU/ml. S. pneumoniaekolonier bör visas som små, cirkulära kolonier en gulaktig beige i färg, med en liten depression i mitten som ger dem ett munkliknande utseende (Figur 3).

2. Murine intranasal kolonisering

  1. Håll fast möss genom att placera dem i en mushållarapparatur (ett modifierat 50 ml Falcon-rör med spetsen avskuren för att skapa en bländare) som säkrar dem vid kroppens botten med tummen så att deras näsor bara kommer ut ur den avsmalnande änden av fasthållningsapparaten (figur 4). Användning av denna apparat möjliggör immobilisering av musens huvud och segregering av dess nares på ett sätt som minimerar rörelse samt hindrar försök från djuret att masticate pipettspetsen, vilket möjliggör fullständig leverans av inokulatet. Alternativt kan möss immobiliseras genom nötning i nacken och manuell fasthållning. Vi rekommenderar inte anestesi hos djuren före intranasal inokulering. Administrering av inokulat till djur under anestesi resulterar i att en del av inokulatet sprider sig tilllungorna 12,13.
  2. Använd en P10- eller P20-pipett, inokulera varje mus genom att deponera 10 μl av den beredda kulturen och fördela den jämnt mellan båda narerna (låt inokulat droppa i näsan genom att pulsera vaccinationen gradvis, vilket tar tid för möss att andas in inokulat). För att uppnå fullständig leverans av inokulat, pausa administrationen när som helst musen börjar flytta näsan överdrivet. Hela inokulat får inte injiceras i narerna eftersom mössen kan utvisa en del genom näsan under utandning. Men eftersom den utvisade mängden tenderar att vara minimal, och inokulat innehåller en extremt hög mängd bakterier, påverkar detta inte signifikant den koloniserande bakteriebelastningen. Dessutom är ytan som är tillgänglig för kolonisering i nasopharyngeal slemhinnan begränsad och följaktligen har vi och andra funnit att den rekommenderade 107 dosen är tillräcklig för att erhålla konsekventa nivåer av bakterier hos alla möss, vilket resulterar i minimal variabilitet i initiala mängder koloniserande bakterier14,15 .
  3. Väg möss om du använder viktindikatorer som en del av din slutpunktsövervakning. Övervaka möss var 12-24 timme för kliniska symtom, inklusive letargi, rufsig päls och viktminskning. Möss kommer vanligtvis inte att visa symtom på sjukdom förrän 3-5 dagar efter koloniseringen, och dessa kommer att föregås av viktminskning som i genomsnitt kan vara cirka 5% av den totala kroppsvikten per dag. När mössen blir allt sjukare kommer de att anta hunched hållningar och visa minskad aktivitet och minskad lyhördhet för stimulering, inklusive hantering. I detta skede är sjukdom vanligtvis vägledande för sepsis och/eller lunginflammation och kommer sannolikt att vara terminal, även om möss kan behandlas med 1 ml subkutan saltlösning dagligen för att förbättra resultaten. Överlevande möss bör börja visa förbättring efter dag 7 efter kolonisering, vilket framgår av stabilisering av vikt följt av viktökning, även om olika stammar av S. pneumoniae kan inducera sjukdom snabbare och resultera i progression av kliniska symtom längs en annan tidslinje. Se figur 5 för ett representativt resultat av vikt som spåras hos möss som koloniserats med P1547-stammen.

3. Nasal Lavage Provsamling

Före start: förbered kanylerade nålar med 1 ml sprutor med 26 3/8 G avfasade nålar. Skär 2,5 cm bitar AV PE20 polyetenrör med en innerdiameter på 0,38 mm, vilket säkerställer att varje ände har en avfasad spets. Använd tång, skjut en 2,5 cm lång bit PE20 polyetenrör (innerdiameter 0,38 mm) på nålspetsen och undvik att punktera slangsidan. Kanylerade nålar kan förvaras i 70% etanol tills det behövs.

  1. Avliva experimentella möss. Eftersom livmoderhalscancer förskjutning potentiellt kan skada luftstrupen, måste denna metod för dödshjälp undvikas. Vår föredragna metod är isofluranbedövning följt av exsanguination, men se till att du följer institutionella riktlinjer när du väljer dödshjälpssätt.
  2. Använd 70% vatten etanol, sterilisera djurets superoanterior päls, särskilt nacken, var noga med att förhindra etanol från att komma åt nares.
  3. Gör ett enda längsgående snitt längs mitten av djurets nacke och två horisontella snitt i vardera änden, vilket skapar en öppning för att föreställa sig luftstrupen.
  4. Skala försiktigt tillbaka huden till vardera sidan och avslöja nackvävnaden under.
  5. Luftstrupen ska vara synlig, omgiven av längsgående muskler på vardera sidan. Klipp försiktigt dessa för att ge en tydlig bild av luftstrupen själv, var försiktig så att du inte skär av den omgivande vaskulaturen.
  6. Om vaskulaturen skars och blod finns, innan du fortsätter, låt blödningen stoppas och rengör sedan området flera gånger genom att dosera steril PBS och använda steril gasväv för att försiktigt suga upp överskott av fukt i området.
  7. När luftstrupen är ordentligt exponerad, gör en tvärgående, semilunarskuren i luftstrupen ungefär halvvägs upp (figur 6).
  8. Dra upp 1 000 μl steriliserad PBS till tidigare beredd kanylerad nål.
  9. För in kanylen i luftstrupen mot näsan och håll den fasade kanten nedåtriktad för enkel införing (bild 7). När nålen är på plats roterar du den 180°, och sonderar försiktigt uppåt tills du känner ljusbeständighet.
  10. Placera Eppendorf avsedd för provsamling precis under musens näsa.
  11. Testa korrekt placering av nålen genom att dosera en minimal (~ 20 μl) mängd PBS-lavagevätska - droppe vätska bör bildas runt musens nares; Om så är fallet, fortsätt till steg 3.13).
  12. Om test PBS dyker upp direkt ut ur djurets mun, dra kanylen tillbaka och flytta genom att återigen försiktigt sondera framåt tills mycket litet motstånd känns - var försiktig så att du inte skjuter kanylen för långt förbi detta motstånd, eftersom du kommer att flytta den förbi nässpalten och till munhålan.
  13. Dispensera innehållet i nålen snabbt för att hjälpa till att förskjuta och samla maximal mängd celler - innehållet bör flöda ut genom musens nares och in i insamlingsröret. Placera provet omedelbart på isen.
  14. För att samla in prover för RNA-analys, upprepa steg 3.8-3.13) med en kanylerad nål som innehåller 500 μl RNA lysisbuffert på samma mus. Detta kommer att göra det möjligt att samla in lysatprov från de återstående cellpopulationerna, som till stor del består av nasopharyngeal mucosal epitel, eftersom icke-stilla celler borde ha avlägsnats efter den ursprungliga PBS-lavagen. Observera att RNA lysis-bufferten kommer att förneka epitelet och förstöra omgivande vävnad, så var försiktig så att du undviker kontakt med organ som lungorna, om retention av dessa vävnader önskas. När provet har samlats in, placera provet i RNA lysisbuffert direkt på torris för att snäppa upp. Väl i lysbufferten kan proverna förvaras enligt tillverkarens anvisningar och är stabila vanligtvis vid -70 °C i flera månader.

4. Bestämning av bakteriebelastning i Nasopharynx

  1. Kvantifiera bakterier genom att förbereda en seriell utspädningsserie för varje murin nasal lavageprov. I allmänhet kan bakteriebelastning förväntas vara mellan 0-104 CFU, därför genomföra tre 10-faldiga seriella utspädningar. Tillsätt 10 μl av det snygga nasala lavageprovet (100 CFU/ml) till det första röret till en koncentration av 10-1 CFU/ml. Vortex noggrant.
  2. Dela bakteriologisk platta i kvadranter och märk kvadranter var och en med en medlem av utspädningsserien (100-10-3 CFU/ml). Plätera ut 3 droppar 10 μl prover av de 3 utspädningarna och det snygga provet på tryptika sojaagarplattor kompletterade med 5% fårblod, som i figur 2.
  3. Låt torka i 15-30 min avtäckta, täck sedan tallrikar och placera upp och ner i bakterieinkubator med optimala förhållanden för bakterietillväxt (vanligtvis 37 °C och 5% CO2).
  4. Odla bakteriekolonier på tallrik i 18-24 timmar.
  5. Bestäm antalet koloniserande bakterier genom att beräkna medelvärdet av de kolonier som bildas på plattan för varje utspädning (figur 3). Figur 8 visar bakteriell densitet under olika tidspunkter, som bestäms av odling av nasala lavar, hos möss koloniserade med 3 olika stammar av S. pneumoniae i upp till 21 dagar.

5. Beredning av prover för flödescytometeri

Innan du börjar: Förbered blandning av antikroppar. För kvantifiering av leukocytpopulationer rekommenderar vi följande blandning vid de angivna utspädningarna: PE-Ly6G (klon 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (klon AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (klon 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (klon PM8 RUO, 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5,5-CD11c (klon N418 RUO, 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (klon M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (klon 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (klon GK1.5, 6.67 μg/ml). Observera att denna blandning är 2x koncentration (se steg 5.5). Alla antikroppar ska spädas ut i FACs Wash buffer (0, 5% fetala kalvserum, 2mM EDTA, 0, 1% natriumazid i PBS) som också bör beredas i förväg. I en blandning av isotypmatchade kontrollantikroppar bör helst från samma leverantör som de märkta antikropparna och i samma koncentrationer som de specifika antikropparna beredas. De prover som behandlas med isotypkontrollantikropparna fungerar som negativ kontroll. Eventuell fluorescens som observerats i de prover som behandlats med isotypkontrollantikropparna bör betraktas som bakgrund.

  1. Prechill en centrifuge som kan snurra 1,5 ml Eppendorf rör till 4 °C.
  2. Centrifuge nässköljprover vid 2 000 x g i 10 min vid 4 °C. Försiktigt pipett ut supernatant och reservera. Obs: På grund av den lilla mängden celler i nasopharynxen kommer cellpelleten inte att vara synlig om det inte finns oönskad förorening av röda blodkroppar, vilket kommer att lysa rött. Om detta ses bör provet kasseras.
  3. Återanvända prov i 50 μl Fc? RIIb/CD16-2 (2,4G2) antikroppar (som binder Fc-receptorer och minskar ospecificerad antikroppsbindning) i FAC-tvättbuffert vid en koncentration av 4 μg/ml.
  4. Inkubera provet på is i 30 minuter.
  5. Tillsätt 50 μl prepreparerad 2x koncentrerad fluorescerande antikroppsblandning till prov. Avsätt ett representativt prov från varje försöksgrupp för att fungera som en isotypkontroll. Tillsätt isotyp antikroppsblandningen till detta prov i stället för fläckblandning.
  6. Inkubera provet på is i 1 timme.
  7. Centrifugprover vid 2 000 x g i 10 min vid 4 °C. Kassera supernatant och återanvänd i 200 μl PBS.
  8. Upprepa steg 5.7.
  9. Efter den andra tvätten provspringar centrifugera igen vid 2 000 x g i 10 min vid 4 °C.
  10. Återanvänds antingen i PBS (om provet körs omedelbart) eller 2 % paraformaldehyd (om proverna körs 1–3 dagar efter färgningen).
  11. Vid flödescytometri samla in den maximala mängden händelser per prov eller tills hela provet har aspirerades. Hos oinfekterade, friska, unga möss kommer detta att vara så lite som 1 000-2 000 totala händelser; Under en bakteriell koloniseringshändelse kan detta antal öka mer än 2 till 5 gånger beroende av sjukdomsstatus hos djur och faktorer som ålder och genetisk bakgrund. Figur 9 visar representativa flödescytometriresultat som samlats in från en 3-laser Becton Dickenson LSRII flödescytometer med en framåtspridning på 450 och sidospridning på 300, även om vi rekommenderar att du optimerar parametrarna för den specifika flödescytometern du tänker använda före provsamlingen. Observera: Om ett prov innehåller jämna spårmängder av blodförorening kommer de totala uppsamlade händelserna att vara betydligt högre än förväntat och provet bör diskonteras från analysen.

6. Kvantitativ PCR-analys (qPCR) av nasala lavar

  1. Tina cell lysates från steg 3.14 rumstemperatur.
  2. Följ det rekommenderade protokollet som medföljer den föredragna RNA-extraktionen.
  3. Efter avslutad RNA-extraktion enligt instruktionerna kvantifiera mängden RNA med hjälp av en spektrofotometer eller elektroforesbaserad metod (figur 10). Vi erhåller rutinmässigt mellan 975 och 3 250 ng totalt RNA per prov med ett 260/280 nm förhållande på >1,7 eller ett RNA-integritetsnummer (RIN) runt, 8,1±0,13.
  4. Transkribera cDNA med M-MULV Reverse Transcriptase enligt tillverkarens protokoll med 1 000 ng RNA (maximalt 13 μl).
  5. Späd resulterande cDNA-prover 8x och alikvot lika i 4 separata rör för långtidslagring vid -20 eller -80 °C.
  6. För att mäta genuttryck med qPCR, förbered 25 μl provreaktioner i tre exemplar på is eller kallblock som innehåller: 12,5 μl 2x qPCR master mix från qPCR kit efter eget val, 0,25 μl referensfärg, 2 μl utspädd cDNA (steg 7,5), 1 μl blandade framåt- och omvända primers (400 nM slutlig), 9,25 μl RNAse-DNAse fritt vatten. Detta protokoll är en anpassning av tidigare publicerade metoder16.
  7. I allmänhet finner vi att en qPCR-förstärkning i två steg ( 95 °C i 10 min följt av upp till 40 cykler x [95 °C x 15 sek, 60 °C x 1 min]) är effektiv (figur 11a). Varje primerpar måste dock optimeras. Dissociationskurvor (smältning) måste utföras efter förstärkning för att säkerställa att ingen ospecificerad förstärkning inträffade. förstärkning (figur11b)
  8. Vi kör rutinmässigt standardkurvor för varje analyserad gen samt en standardkalibrator (härledd från lung- eller mjältehom homogenat) för varje 96-brunnsplatta analyserad. Relativa transkriptionsmängder erhålls genom att först normalisera råcykeltröskelvärden (Ct) genom referensfärgämnet och omvandla de resulterande värdena genom respektive standardkurva. Dessa relativa mängder normaliseras därefter till standardkalibratorn och en hushållningsgen, i förekommande fall.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 representerar en översikt schematisk sammanfattning av protokollets huvudsteg. Figurerna 2-3 ger visualisering av den mikrobiologiska metodik som är inneboende i de protokoll som beskrivs häri. Figur 4 representerar korrekt positionering av en mus för att utföra en intranasal kolonisering, medan figur 5 visar typiskt förändringar i vikt hos möss koloniserade med S. pneumoniae stam P1547. Figurerna 6-7 representerar specifika stadier av den nasala lavagedelen av processen, för assisterad visualisering av dessa två tekniker. Figurerna 8-11 består av representativa resultat av analyser utförda på prover som samlats in från nasopharynx av en mus efter nasal lavage. Specifikt är figur 8 ett representativt resultat av bakteriebelastning i nasofarynxen, som bestäms genom odling av nasala lavar som erhållits från möss koloniserade antingen med S. pneumoniae stam P1121, P1547 eller P1542. Figur 9 representerar cellfenotypning av isolerade nasofaryngeala immunceller med hjälp av flödescytometriska tekniker. Figurerna 10-11 visar representativa resultat avseende expressional analys av nasopharyngeal mRNA via kvantitativ PCR.

Figure 1
Figur 1. Flöde diagram över intranasal inokulering och nasala lavage cell isolering förfaranden med hjälp av en mus modell. Först förbereds bakterierna för inokulering och ges sedan till murinämnen intranasally. Efter den önskade tidens förflutningar avlivas möss via terminal blödning, och deras nasopharyngeal celler isoleras via två nasala lavage steg: en PBS tvättsteg följt av en sekundär tvätt i RNA lysis buffert. Cellerna från den preliminära PBS-tvätten isoleras och analyseras med hjälp av flödescytometritekniker, medan RNA isolerat från det andra provet kan användas för att undersöka de relativa överflöden av molekyler av intresse på transkriptionsnivå.

Figure 2
Figur 2. För att bestämma bakteriekoncentrationen pläterar 10 μl droppar i tre exemplar påen platta uppdelad i sektioner som representerar en annan seriell utspädning . Dessa droppar får sedan torka och plattorna inkuberas över natten vid 37 °C, 5% CO2.

Figure 3
Figur 3. Koncentration av Streptoccous pneumoniae isolerad från nasopharynx av ett representativt djur. Varje diskret koloni representerar en kolonibildande enhet, varje samling kolonier representerar en 10 μl droppe (pläterad i triplikater) och varje kvadrant på plattan representerar en separat seriell utspädning. Bakteriekoncentrationen bestäms i CFU/ml genom att antalet räknande, fullt formade kolonier i och mellan kvalificerande kvadranter i genomsnitt är beräknat.

Figure 4
Figur 4. Rörelsen hos varje mus som ska vaccinerades måste minimeras, särskilt i nacken, för att möjliggöra korrekt leverans av bakteriellt inokulat. För att åstadkomma detta hålls ämnesmusen fast i en modifierad begränsningsapparat som består av ett 50 ml Falcon-rör med en bländare i sin avsmalnande ände. Musen placeras sedan så att näsan kommer ut ur bländaren, där den kan nås av forskaren, vilket gör det möjligt att utföra intranasal inokulering.

Figure 5
Figur 5. Vikt av möss koloniserade med stam P1547 från minst 2 representativa experiment spåras dagligen efter inledande inokulering (n=6) för att skildra typiska förändringar i vikt som förväntas efter nasopharyngeal kolonisering. Vikt visas som en procentförändring av utgångsvikten. Observera den förväntade kraftiga initiala viktminskningen mellan dag 3-5, följt av stabilisering och gradvis ökning av vikt hos överlevande möss.

Figure 6
Figur 6. Vid trakeal exponering avlägsnas flankerande längsgående muskler försiktigt före trakeal snitt på ett sätt som inte skär de omgivande blodkärlen. Ett litet halvlunarsnitt görs sedan halvvägs upp i luftstrupen med fin kirurgisk sax. Det är viktigt att skära igenom luftstrupens diameter endast delvis, vilket lämnar den intakt bakvänt.

Figure 7
Figur 7. Införing av den kanylerade nålen i luftstrupens öppning uppåt mot näsan. När kanylen är på plats, sondera försiktigt tills motståndet är uppfyllt och spola sedan ut innehållet genom naresna.

Figure 8
Figur 8. En representativ serie bakteriebelastning isolerad från nasopharynx med hjälp av nasal lavage förfarande beskrivs efter kolonisering av C57BL/6 möss (trianglar) med S. pneumoniae stam P1547 (A), P1542 (B) eller P1121 (C). En jämförande kolonisering av BALB/C möss (cirklar) efter P1121 kolonisering visas också i (C). Olika tidpunkter visas under koloniseringen, inklusive dag 3, 7, 14 och 21. I allmänhet förväntas en hög initial belastning dag 3, med liten minskning dag 7. Clearance initieras vanligtvis av dag 14, med fullständig eller nästan fullständig klarering bevisad dag 21 efter kolonisering med de flesta stammar. Klicka här om du vill visa större bild.

Figure 9
Figur 9. Representativ histogram (A) och punkt plot (B) av totala celler isolerade från murin nasala lavages som analyseras av flöde cytometri. Differentiella uttryck av markörer på cellpopulationer gör det möjligt att identifiera leukocytundergrupper genom användning av fluorescerande antikroppar riktade mot dessa proteiner. Som visas här väljs leukocytpopulationer genom att först gating på enstaka celler med hjälp av en framåtspridning (område) kontra framåtspridning (bredd) grind (A), och sedan berika för CD45 + celler i den delmängden (B). Denna population kan delas in ytterligare i specifika celltyper genom att gating för CD11b och Ly6G dubbla positiva neutrofiler (C). Analys av CD11b- populationen kan utföras för att avslöja F4/80+, CD11b-makrofager(D)eller CD11b-, CD3- och CD4 dubbelpositiva CD4 T-celler (E). Cellpopulationer kan fenotypas så länge de uttrycker antingen en, eller en kombination av flera unika ytreceptorer som kan användas för att skilja dem från andra celltyper. Klicka här om du vill visa större bild.

Figure 10
Bild 10. Representativa elektropherogram efter elektrofores automatisk sekvensering av ett prov isolerat från murin nasala lavages. Det resulterande elektroferogrammet visar kvantifieringsdata och den karakteristiska signaturen för ett högkvalitativt totalt RNA-prov som härrör från nasopharyngeal-regionen. Vid analys av totalt RNA används områdena under RNA-topparna för de två stora ribosomala RNA, 18S och 28S, för att beräkna motsvarande förhållande. Betydande förändringar i kvoterna för toppar hänförliga till 18S och 28S är vanligtvis vägledande för försämrat RNA. Graden av nedbrytning kan sammanfattas med RNA-integritetsnummer (RIN); RIN för detta representativa prov är 8.1. Ett exempel på mycket försämrat RNA visas i (B) och (C), och efterföljande RIN är 1,9 respektive 4,6. Klicka här om du vill visa större bild.

Figure 11
Figur 11. Förstärkningsdiagram (A) och dissociation (smältning) kurva (B) från qPCR analys av nasala tvätt cell lysates, vilket ger ett exempel på hur dessa två avläsningar vanligtvis bör se ut efter en effektiv och korrekt detekterad förstärkning av mRNA produkter isolerade från murine nasopharynx. Representerad är en standardkurva för hushållningsgenen 18S. Resultaten som visas i (A) visar önskad PCR-produkt efter förstärkning med primers mot GAPDH. Linjen representerar cykeltröskeln (Ct). Den punkt där de förstärkningsområden som motsvarar olika prover passerar denna tröskel möjliggör jämförelse mellan proverna, med lägre värden som motsvarar högre mängder RNA av intresse som finns däri. Tomten i (B) visar att den maximala smälttemperaturen för qPCR-produkten är 85 °C och att det inte finns några förorenande produkter i denna reaktion, vilket skulle visa sig som en extra topp skild från önskad produkttopp. Klicka här om du vill visa större bild.

Stamnamn Serotyp Virulens Dödlighet hos möss Förväntad koloniseringstid
P1121 23F (23F) asymptomatisk 0% 21-28 dagar
P1542 4 låg 0-20% 21-28 dagar
P1547 6A (på 6A) mid 20-50% 14-21 dagar
D39 (på 19) 2 hög 70-100% 14-21 dagar

Tabell 1. En tabell översikt över 4 vanligen anställda S. pneumoniae kliniska isolatet stammar, deras motsvarande serotyp nummer, associerade graden av virulens, förväntad andel i invasivitet inom en koloniserad delmängd av möss och typiska varaktigheten av en nasopharyngeal kolonisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna studie presenterade vi detaljerade metoder för intranasal kolonisering av möss med hjälp av en klinisk isolate stam av Streptococcus pneumoniae och efterföljande isolering och karakterisering av immunceller rekryteras till nasopharynx som svar på bakterierna. Vi visade hur ett bakteriellt inokulat kan odlas i näringsrika medier och användas för att etablera en koloniseringshändelse hos möss, som ursprungligen är begränsad till nasofarynx. Vi visade sedan hur svara immun cell typer som rekryteras till nasopharynx kan isoleras efter trakeal exponering, snitt och en nasal lavage genom användning av en kanylerad nål. Nasala lavageprover kan samlas in i PBS för att isolera intakta, lätt vidhäftande celler; RNA från tätare vidhäftande celler och omgivande epitelial slemhinnor skikt kan isoleras genom att tillämpa en sekundär tvätt bestående av RNA lysis buffert. Den förstnämnda av dessa prover kan sedan användas för att fenotyp de specifika celler som rekryteras i samband med koloniseringen via flöde cytometri tekniker, medan den senare kan tillämpas på Q-PCR analys, för att bestämma effektor funktioner av dessa rekryterade celler genom att titta på transkriptionellt uttryck för immun regulatorer av intresse. Nasala lavageprover kan dessutom användas för att bestämma kinetiken för clearance av en bakteriell koloniseringshändelse som jämför olika experimentella grupper för att ta itu med specifika forskningsfrågor.

Användning av denna metod för intranasal kolonisering möjliggör upprättandet av en koloniseringshändelse som ursprungligen är begränsad till djurets nasofarynx. All efterföljande spridning av bakterierna till blodet eller organen sker därför sekundärt till överträdelser i immunförsvaret lokaliserade inom nasopharyngeal slemhinnan. Den stegvisa progressionen som uppnås genom denna modell återspeglar mer exakt processen med pneumoccocal invasion hos människor, så att man kan studera dynamiken mellan koloniserande bakterier och värd nasala slemhinnor - och kanske bättre förstå förändringar i bakteriell patogenicitet och / eller värd immunitet som möjliggör utvecklingen av spridande sjukdom. Detta står i kontrast till modeller som avstår från att etablera en första koloniseringshändelse och väljer att studera invasiv sjukdom isolerat genom direkt leverans av bakteriell inokulat till lungorna via intratrachael instillation, till blodet via vaskulär injektion eller till peritoneum via peritoneal injektion.

Att genomföra en PBS nasal lavage efter en kolonisering händelse möjliggör isolering av icke- eller milt-vidhäftande celler rekryteras till nasopharynx, liksom eventuella mucosally-associerade bakterier. Det bör dock noteras att denna teknik är begränsad eftersom den inte kommer att frigöra celler eller bakterier som har rest mellan eller under epitelet, och det kommer inte heller att möjliggöra skörd av celler eller bakterier som har lokaliserats till den nasala associerade lymfoidvävnaden (NALT), ett lymfoidt organ som har rapporterats vara en potentiell infektionsplats efter en pneumokockkolonisering17,18. Om ytterligare studie av NALT önskas rekommenderar vi mikrodissekret och avlägsnande av denna vävnad grossist för studie efter PBS nasal lavage; Eftersom dessa två tekniker inte utesluter varandra får de utföras på samma djur. På grund av den lytiska och destruktiva karaktären hos RNA-skördesteget (den sekundära lavagen med RNA lysis-buffert) bör dock detta steg utelämnas om man avser att skörda NALT. Även om nässköljningen är ett mindre tekniskt utmanande förfarande, för grupper som vill få en mer omfattande bedömning av bakteriebelastning som inte bara innehåller mukosal-associerade bakterier, men också de som har invaderat nasofaryngealvävnaden, föreslår vi att man skördar nasofaryngealvävnaden efter avlägsnande av det övre skallbenet av koloniserade möss och dissekering av vävnaden inom näskoncha, som beskrivs avandra 19.

Arten av ett framkallat immunsvar är beroende av interaktionen mellan värd och patogen. Över 90 serotyper av S. pneumoniae har hittills karakteriserats, alla med olika nivåer av patogenicitet och virulens faktor uttryck, vilket resulterar i differentiell prevalens i den mänskligabefolkningen 20-23. På samma sätt, hos möss, har det rapporterats att omfattningen av och kinetik i samband med immunsvaret framkallas som svar på en nasopharyngeal kolonisering är beroende av koloniseringsstammensjälv 24. Således är valet av en lämplig stam att använda för upprättandet av en nasopharyngeal kolonisering inte en trivial fråga, inte heller är valet av mus genetisk bakgrund. Figur 8 ger provdata som visar kinetiken för clearance av en nasopharyngeal kolonisering från 3 olika S. pneumoniae stammar efter intranasal kolonisering av kvinnliga möss på en C57BL/6 bakgrund. Tabell 1 ger en översikt över graden av virulens och längden på den förväntade koloniseringstiden (när den används på C57BL/6-bakgrunden) med 4 S. pneumoniae kliniska isolatstammar som beskrivs i litteraturen och som är kända för att kunna etablera en nasopharyngeal kolonisering25:den avirulent P1121 (serotyp 23F)26,27 lågvisirens P1542 (serotyp 4)28, mellanvisirens P1547 (serotyp 6A)29-31, och den allmänt använda, väl karakteriserad, mycket virulent D39 (serotyp 2)32-36. Om det experimentella målet är att strikt studera en asymtomatisk nasal kolonisering händelse utan åtföljande bakteriell spridning till andra vävnader, rekommenderar vi användning av den avirulent P1121 stam, som kännetecknas som en potent kolonisatör, som längre kolonisering händelser (upp till 28 dagar före observerade clearance) är ett kännetecken för denna stam. Vanligtvis kommer möss koloniserade med P1121 inte att löpa någon risk för invasiv sjukdom och kommer inte att visa några kliniska indikatorer på sjukdom (med undantag för tillfällig viktminskning). Resten av stammarna bör användas beroende på önskad grad av virulens och tillhörande dödlighet, med virulens som inte är den grad av infektion som utvecklas inom en enskild mus, utan snarare andelen möss som uppvisar kliniska tecken på sjukdom. Det bör också noteras att graden av virulens vanligtvis korrelerar omvänt med koloniseringstiden, med mer virulenta stammar som koloniserar under en kortare tidsperiod. Alla 3 av de beskrivna virulenta stammarna leder till dödlighet hos möss på grund av, oftast, sepsis, med fulminant lunginflammation, eller samtidig lunginflammation och sepsis utvecklas i en delmängd av möss. Skillnaderna i lokalisering av invasiva bakterier kan vara stamspecifika, eftersom det tidigare har rapporterats att vissa stammar visar tropismer för vissa organ37. Hos en liten andel djur kan spontan hjärnhinneinflammation också utvecklas efter kolonisering. Bestämning av dödsorsak, liksom graden av invasivitet, kan åstadkommas genom insamling av tillhörande vävnader (lungor, mjälte och/eller hjärna) från djur vid slutpunkten. Homogenisering av dessa vävnader och efterföljande plätering kan indikera förekomst av invasiva bakterier och motsvarande titrar.

Ett exempel på en bakteriell odlingstäthets kvantifiering visas i figur 3. Om kulturen är för koncentrerad växer kolonierna för tätt för att räknas individuellt, men kolonier som härrör från enstaka celler kan särskiljas om en log-wise utspädningsserie pläteras. Plätering av tre tekniska replikat per utspädning minimerar variabiliteten. Observera att när man kvantifierar bakterier som hämtats från en nasal koloniseringshändelse kan man stöta på kokulerade föroreningar, som representerar andra bakteriearter som samtidigt isoleras från murin nasopharynx. Om bakteriestammen av intresse har någon känd antibiotikaresistens (till exempel är många stammar av S. pneumoniae resistenta mot gentamycin eller neomycin upp till 5 μg/ml), kan man minimera förekomsten av föroreningar genom att komplettera tillväxtmediet med antibiotikumet vid en lämplig koncentration, vilket begränsar föroreningstillväxten.

Flödescytometri kan användas för att analysera cellytans markörer på nässköljningsprover. För analys av celltyper som rekryterats i samband med en infektion kan till exempel en blandning av antikroppar som är specifika för bruttodibrerkning av leukocyter, inklusive makrofager (F4/80+), neutrofiler (CD11b+ och Ly6G+) och T-celler (CD3+ och CD4+ eller CD8+) användas som tidigare publicerats . Dessutom kan dessa analyser kombineras med flödescytometrisk analys utförd på olika vävnader eller blod, för att bättre förstå immuncellshandel under infektionen. På grund av det begränsande antalet celler (vanligtvis numrering i de låga tusentals) som kan isoleras från nasopharynx, är det vanligtvis utmanande att identifiera sällsynta delmängder, även om forskare som vill uppnå detta bör överväga att slå samman prover från flera möss för att uppnå önskade cellantal. Eftersom ett begränsat antal celler kan extraheras från den här regionen rekommenderar vi dessutom att du analyserar dessa data med avseende på totala cellnummer.

Även om proteinuttrycksnivåerna vanligtvis är låga i nasofarynx som begränsar möjligheten att analysera proteinproduktion, är det möjligt att analysera produktionen av värdmolekyler som svar på koloniserande bakterier på RNA-nivå. För att uppnå detta kan nasala lavar utföras med hjälp av RNA lysis buffert i stället för PBS, vilket möjliggör analys av genuttryck. För qPCR-förstärkningsdetektering är det viktigt att köra en motsvarande dissociationskurva (figur 11) för att säkerställa att rätt och önskad produkt upptäcktes. Detta beror på det faktum att analysen kommer att upptäcka dubbelt strandat DNA inklusive primer dimers, förorenande DNA och PCR-produkt från missriktad primer.

Vi hoppas att de metoder som beskrivs här kommer att uppmuntra dig att tillämpa en intranasal koloniseringsmodell för att studera värdsvar på patogener som är viktiga i samband med denna understudie region. För vissa humana patogener, såsom S. pneumoniae, fungerar en tidigare nasopharyngeal koloniseringshändelse som en viktig föregångare till efterföljande bakteriell spridning och den dödliga följden som kan följa, inklusive förökning i lungorna, vilket kan leda till lunginflammation, eller annars till blodet, och resulterande bakteriemi och septisk chock. Således, genom att studera bakteriell kolonisering i denna region, kan vi förstå bättre hur man kontrollerar det och förhindra allvarligare patologi från att uppstå helt och hållet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr. Jeffery Weiser vid University of Pennsylvania för hans gåva av de kliniska stammarna av Streptococcus pneumoniae. Detta arbete finansierades av Canadian Institutes for Health Research. CV finansierades av ett M. G. DeGroote-stipendium och ett stipendium från Canadian Thoracic Society. Detta arbete finansierades av Ontario Lung Association och Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Arbetet i Bowdish-laboratoriet stöds delvis av michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research och McMaster Immunology Research Centre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing - PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1 ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26 G 3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  2. Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
  3. McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
  4. Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
  5. van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
  6. Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
  7. Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
  8. McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
  9. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
  10. Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
  11. Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  12. Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
  13. Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
  14. Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
  15. Wu, H. -Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  16. Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
  17. Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
  18. Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
  19. Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
  20. Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
  21. Bryant, W. P., J,, et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  22. Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
  23. Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
  24. Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
  25. Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  26. Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
  27. Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
  28. Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
  29. Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
  30. Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
  31. Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
  32. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  33. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  34. Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
  35. Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
  36. Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
  37. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  38. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
  39. Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).

Tags

Immunologi Utgåva 83 Streptokocker pneumoniae Nasal lavage nasopharynx murin flöde cytometri RNA Kvantitativ PCR rekryterade makrofager neutrofiler T-celler effectorceller intranasal kolonisering
Karakterisering av inflammatoriska svar under intranasal kolonisering <em>med Streptococcus pneumoniae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, … More

Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter