Nyttan av Stage-specifika Mitten till slutet<em> Drosophila</em> Follikelstimulerande Isolering

Summary

Stage-specifik isolering av mitten till slutet av Drosophila folliklar är användbar för en rad olika ändamål. Sådana folliklar utvecklas i kultur, vilket gör det möjligt för genetiska och / eller farmakologiska manipulationer som ska tillsammans med in vitro utvecklingsanalyser och levande bilder. Dessutom kan folliklar användas för molekylära studier, till exempel isolering av mRNA och protein.

Abstract

Drosophila oogenes eller follikelutveckling har i stor utsträckning använts för att utveckla förståelsen av komplexa utvecklings-och cell biologiska processerna. Detta metoder papper beskriver hur man isolera mitten till sen utvecklingsfas folliklar (Stage 10B-14) och använda dem för att ge nya insikter i de molekylära och morfologiska händelser som inträffar under snäva fönster av utvecklingstiden. Isolerade folliklar kan användas för en mängd olika experimentella tekniker, inklusive in vitro utvecklingsanalyser, Bildproduktion, mRNA-expressionsanalys och western blot-analys av proteiner. Folliklar vid Stage 10B (S10B) eller senare kommer att slutföra utvecklingen av kultur, vilket gör att man kan kombinera genetiska eller farmakologiska störningar med in vitro-utveckling för att fastställa effekterna av sådana manipulationer på de processer som sker under vissa perioder av utveckling. Dessutom, eftersom dessa folliklar utvecklas i kultur, de är idealiska för live-imaging studier, Vilket ofta avslöjar nya mekanismer som medierar morfologiska händelser. Isolerade folliklar kan också användas för molekylära analyser. Exempelvis kan förändringar i genuttryck som resulterar från genetiska störningar definieras för särskilda utvecklings fönstren. Dessutom kan proteinnivå, stabilitet, och / eller posttranslationell modifiering tillstånd under ett visst skede av utvecklingen av folliklar undersökas genom Western blot analyser. Således scen specifik isolering av Drosophila folliklar ger en rik källa till information i stor utsträckning bevarade utvecklingsprocesser och morfogenes.

Introduction

Varje Drosophila äggstock består av ~ 16 ovarioles eller kedjor av sekventiellt mognar ägg kammare eller folliklar. Varje follikel består av en enda äggcell, 15 bakterielinje härrör sjuksköterska eller stödceller, och ~ 650 somatiska celler kallas follikelstimulerande celler (Figur 1A). Är Drosophila oogenes indelat i 14 morfologiskt definierade utvecklingsstadier ^1. Varje steg av follikelutveckling observeras många gånger inom en enda fluga, vilket gör det relativt lätt att isolera ett stort antal scenspecifika folliklar.

De mitten till slutet stadier av oogenes (Stages 10B-14) är särskilt väl lämpade för steg isolering (Figur 1). I steg 10B (S10B), den follikeln helt utsträckt (dvs dess längd är lika med den för en etapp 14 (S14) follikel, se figur 1 och figur 2H) och halva längden av follikel består av sjuksköterska cellermedan den andra hälften är äggcellen (Figur 1C). I detta skede sjuksköterskan cellerna genomgår dramatiska aktin ombyggnad, stärka den kortikala aktin och skapa parallella buntar av aktin filament ^2. På samma gång, en population av follikelceller, benämnd centripetala celler migrerar in mellan sjuksköterska celler och oocyten, och två dorsala grupper av follikelceller blivit valt att genomgå övergång till bildning av de dorsala bihang, rörformiga luftvägsanordningar för embryot ³ . Sköterskan cellerna sedan kontrakt (S11), pressa deras cytoplasma innehållet i äggcellen i en process som kallas sjuksköterska cell dumpning, vilket ger äggcellen med de faktorer som krävs för att slutföra embryogenes (Figur 1D). Sköterskan cellerna genomgår sedan celldöd (S12-S13) ^4, och follikeln cellerna utsöndrar och mönster äggskal ⁵ (figur 1E-G). Således är rik med viktiga utvecklings ett slut oogenesd morfogenetiska processer.

Isolerade mitten till sen utvecklingsfas folliklar (S10B-S14) kan användas för en mängd olika syften, inklusive molekylära analyser. Till exempel kan mRNA från staged folliklar isoleras för RT-PCR, microarray, eller RNA-seq analyser. Detta gör att man kan titta på genuttryck inom en kort utvecklings fönster, med endast några celltyper som finns och bestämma hur genuttrycket förändras genom antingen farmakologiska eller genetiska störningar. Stage isolering kan också användas för att titta på proteiner med western blotting. En sådan analys är viktigt eftersom det gör att man kan kvantifiera nivån av proteinuttryck i vildtyp kontra mutanter i vissa stadier. Medan man kan använda immunofluorescerande analyser för att uppnå liknande resultat, kvantifiering av fluorescens är mindre robust på grund av de stränga krav som alla de pixlar ligga inom det linjära intervallet för detektering ^6. Dessutom kan Western blot-analys ge annan information, till exempel ens om proteinet är posttranslationellt modifierade eller uttrycks från en specifik splits isoformen. Isolerat stadier kan också användas för ytterligare rening av proteiner, inklusive subcellulär fraktionering eller coimmunoprecipitation.

Stage specifika follikelstimulerande isolering kan också användas för in vitro utvecklingsanalyser ⁷ och levande avbildning ^8. Isolerade S10B-S13 folliklar kommer att fortsätta utvecklas till S14 i enkla odlingsmedia (se nedan). Det är viktigt att notera att S10A folliklar inte kommer att fortskrida genom sjuksköterska cell dumpning användning av betingelserna kultur som diskuteras i detta manuskript. Vi har använt S10B in vitro utvecklingsanalyser för att definiera rollen av prostaglandiner, både farmakologiskt och genetiskt, i regleringen av aktin ombyggnad med sjuksköterskan cell dumpning och utveckling avläsning ^7,9. På samma sätt kan de senare stadierna av utveckling också isoleras för att avgöra effekterna av farmakologiska behandlingar eller genetisk manipulations på särskilda processer som centripetal cell migration, rygg bihang migration / formation ^10, och sjuksköterska celldöd. Sådana analyser kan användas för att utföra dominanta interaktions skärmar eller analyser, till exempel, medan heterozygositet för mutationer i PXT eller Fascin enbart har ingen effekt på S10B in vitro-utveckling, folliklar från dubbel heterozygoter uppvisar sjuksköterska cell dumpnings fel och ett block i utveckling ^9.

Dessutom, eftersom S10B-13 kan utvecklas i kultur, alla de processer som sker under denna tid kan observeras i levande bilder. En sådan avbildning kan utföras helt enkelt genomfallande ljus (om man är bara intresserad av stora förändringar i morfologi) eller med konfokalmikroskopi med hjälp av transgena flugor som uttrycker fluorescerande prober eller folliklar färgade med levande avbildning färgämnen. Live avbildning används för att avsevärt förbättra vår förståelse av utvecklingsprocesser. Indeed, levande imaging sent skede folliklar har utökat kunskapen om rygg bihang migration, ett exempel på tubulogenesis ^10. Vi räknar med att live-avbildning av ytterligare sena scenprocesser, inklusive aktin dynamik under sjuksköterska cell dumpning, kommer att ge nya insikter i dessa utvecklings händelser. Det är viktigt att notera att medan S10A och tidiga stadier av follikelutveckling inte kommer att fortsätta att utvecklas till en S14 i kultur, kan levande avbildning av händelser som inträffar under dessa stadier av utveckling med hjälp av alternativa odlingsbetingelser ^11-14 (se Diskussion mer information).

Här ger vi detaljerade protokoll för att isolera sent skede folliklar för antingen in vitro utveckling och live-avbildning, eller molekylära analyser (mRNA och protein isolering).

Protocol

1. Förbereda Drosophila Före Stage Isolering Gör våt jäst pasta genom att kombinera 50 g av aktiv torrjäst med 90 ml destillerat vatten. Blanda med en spatel för att kombinera. Låt blandningen stå i ~ 30 minuter innan en bedömning konsistens. Konsistensen ska vara precis tillräckligt tjock för att hålla sig till sidan av en fluga flaska men inte kör ner sidan. För att uppnå den önskade konsistensen kan det vara nödvändigt att lägga till upp till 10 ml av ytterligare vatten eller e…

Representative Results

När isolera specifika stadier av Drosophila follikelutveckling är det viktigt att kunna exakt urskilja de olika morfologiska stadier. Detta är något utmanande för S10A och S10B, som sjuksköterskan celler och oocyten vardera tar upp halva längden av follikel på dessa stadier (figur 1B jämfört med 1C). Emellertid S10A folliklar är kortare i längd än S10B folliklar, eftersom S10B folliklar är fullt utsträckt och således samma längd som en S14 follikel (Fig…

Discussion

The Drosophila follikeln är sammansatt av endast ett fåtal celltyper, vilket gör det idealiskt för både morfologiska och molekylära analyser. Vidare, på grund av strukturen i äggstockarna, är det relativt enkelt att erhålla ett stort antal specifika stadier av follikelutveckling med en gemensam dissektionsmikroskop och minimal utbildning. Som varje steg representerar ett kort tidsfönster, kan steget isolering ge betydande molekylära insikter i de utvecklingsprocesser som sker under det stadiet. Till…

Materials

Active Dry Yeast	Genesee Scientific	62-103	Any source of Active Dry Yeast is fine
Grace’s Insect Media	Lonza	04-457F
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11050H	Any Heat Inactivated FBS should work
10x Pen/Strep	Gibco/Invitrogen	15140-122
Pin Vises and Needles	Ted Pella, Inc.	13561-10
Spot Plate, Nine Well	Corning	7220-85
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
24 multi-well plates	Becton Dickinson	35 3226	Any 24-well tissue culture dish should work
Coverslip Bottom Dishes (35mm)	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used
Glass pipettes	Corning	7095B-5x (for transferring follicles)
Glass pipettes – long	Corning	7095B-9 (for producing pulled pipettes)
Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free)	Research Products International	199228	Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used
Trizol	Invitrogen	15596-018