Summary
Dans cette publication, nous décrivons une procédure rapide et pratique pour les cellules acineuses pancréatiques primaires culture du pancréas murin isoler et. Cette méthode constitue une approche intéressante à étudier la physiologie des cellules pancréatiques exocrines normales / non transformé primaires fraîches.
Abstract
Ce protocole permet d'isoler rapidement (en moins de 1 h) de acini du pancréas murin, ce qui permet de les maintenir en culture pendant plus d'une semaine. Plus de 20 x 10 6 cellules acineuses peuvent être obtenus à partir d'un seul pancréas murin. Ce protocole offre la possibilité de traiter indépendamment jusqu'à 10 pancréas en parallèle. Car elle préserve l'architecture acinaire, ce modèle est bien adapté à l'étude de la physiologie du pancréas exocrine in vitro contrairement aux lignées cellulaires de tumeurs pancréatiques, qui affichent de nombreuses modifications génétiques résultant de la perte partielle ou totale de leur différenciation des cellules acineuses.
Introduction
Un problème fréquemment rencontré dans les laboratoires de recherche travaillant sur le tissu pancréatique exocrine est la difficulté de cultiver des cellules acineuses in vitro pour une période de temps suffisamment longue pour permettre une expérience à long terme.
Un facteur entravant le développement de ces systèmes de culture est la sensibilité intrinsèque du tissu pancréatique à la manipulation expérimentale en raison de la forte teneur en enzymes de la glycolyse, protéolytique et lipolytique, qui digèrent littéralement le tissu pancréatique quand ils sont libérés au cours de l'isolement des cellules pancréatiques.
Un deuxième facteur est la remarquable plasticité in vitro des cellules acineuses, qui ont tendance à perdre leurs caractéristiques sécrétoires et transdifférencier à d'autres cellules matures, telles que les cellules canalaires pancréatiques ou de cellules hépatocytes comme 1. In vitro, cette plasticité cellulaire varie avec les conditions expérimentales (tels que la composition du milieu de culture) 2 1.
Plusieurs méthodes ont été développées pour l'isolement et la culture des cellules acineuses, premier du pancréas de porc Guinée 3-5. Initialement, ces protocoles impliqués digestion du tissu pancréatique avec de la collagénase, la chymotrypsine, et un cocktail de protéase, avec isolation ultime par dissociation mécanique vigoureuse. Les cellules pancréatiques isolés de cette manière affichées caractéristiques structurelles et fonctionnelles anormales, notamment une perte des structures apicales et des dommages importants à leurs récepteurs membranaires. Les cellules isolées sont restées viables pour seulement 1 ou 2 jours.
Préparation de la dispersion acini maintient leur architecture intra-et intercellulaires, en préservant les membranes cellulaires, ce qui limite les dommages aux récepteurs de surface, et d'améliorer ainsi la sécrétion exocrine en réponse aux sécrétagogues 6-8. Comme une result, cette méthode offre l'avantage majeur de l'extension de la viabilité des cellules acineuses à 7-10 jours in vitro. En outre, cette méthode est actuellement préférable à l'isolement des cellules acineuses 9-12 parce que l'entretien de contacts intercellulaires, y compris les assemblages de cellules par les jonctions communicantes, est un déterminant essentiel du pancréas phénotype des cellules acineuses exocrine 13.
Comme la dédifférenciation des cellules acineuses et leur transdifférenciation de cellules canalaires est l'un des mécanismes proposés pour la genèse des cancers du pancréas exocrine agressifs 14, les acini modèle dispersée est également un système adéquat pour étudier la plasticité du pancréas et de ses mécanismes moléculaires ultérieures. En outre, en combinaison avec l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés 15,16 et le développement des techniques de transfert de gènes (adénovirus 2 ou transduction lentiviraux, l'utilisation de nanoparticules, etc), ce modèle de cellule acineuse primaire in vitro peutêtre très utile pour déterminer comment divers dysfonctionnements génétiques affectent la régulation de la différenciation des cellules acineuses ou dédifférenciation et devraient permettre de mieux comprendre les événements moléculaires responsables de l'apparition d'une pancréatite, des lésions précancéreuses et des changements dans la plasticité cellulaire.
Isolation des dispersé acini est l'approche que nous utilisons dans notre laboratoire pour la culture des cellules acineuses du pancréas. Nous décrivons ici et de discuter de la méthode utilisée. Elle implique la dissociation enzymatique du tissu pancréatique (avec une collagénase bactérienne) couplé à une rupture mécanique sans dissociation des cellules acineuses. Alors que la plupart des protocoles impliquent la culture de la acini, soit en suspension ou sur des substrats plastiques spécialement traités, nous les cultivons en suspension que brièvement (pendant 24 heures), les semis plus tard sur les échafaudages de la matrice si la culture cellulaire prolongé est nécessaire.
Ce protocole permet l'isolement rapide (en moins de 1 h) de dispersion pancréas acini, durable pendant plus d'une semaine de culture. Il permet d'isoler plus de 20 x 10 6 cellules acineuses par le pancréas de souris. Sa simplicité permet de traiter indépendamment jusqu'à 10 pancréas en parallèle. En conservant l'architecture intra-et intercellulaires des acini et donc le phénotype des cellules acineuses des cellules primaires isolées, ce modèle constitue un système de choix pour l'étude des mécanismes de la transdifférenciation, comme tous les autres modèles pancréatiques exocrines actuellement disponibles sont dérivées de tumeurs pancréatiques affichant de nombreuses génétique altérations conduisant à la transformation cellulaire.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par un comité d'éthique en vertu de la réglementation de l'autorité gouvernementale («Comité d'Evaluation Commun au Centre Léon Bérard, à l'Animalerie de transit de l'ENS, au PBES et au laboratoire P4" (CECCAPP)). Les souris ont été maintenus dans une animalerie sans pathogène spécifique à la "Plateforme AniCan, Centre Léon Bérard" (Lyon, France) et traités en conformité avec les directives institutionnelles.
Une représentation schématique de la procédure est illustrée à la figure 1.
1. Dissection du pancréas et Dilacération (jour 0)
Une dissection très rapide est essentiel pour un rendement optimal d'extraction et d'assurer une bonne viabilité des cellules en culture. Afin de réduire le temps nécessaire pour l'isolement du pancréas, tous les instruments et les équipements doivent être prêts avant l'euthanasie de la souris.
- Euthanasier souris par asphyxie au CO2 ou la dislocation cervicale.
A partir de cette étape, toutes les procédures doivent être effectuées sous atmosphère stérile (poste de sécurité microbiologique, niveau II) avec du matériel de dissection stérile.
- Fixer la souris et pulvériser l'abdomen de souris avec de l'éthanol à 70%. Avec des ciseaux et des pinces à disséquer, faire une incision en forme de V à la région génitale et le poursuivre jusqu'à la membrane d'ouvrir complètement la cavité abdominale.
- Positionner les lobes de foie contre le diaphragme, ils doivent y rester si la cavité du corps est ouverte assez loin. Tirez l'intestin et le colon en dehors de la cavité abdominale à votre gauche, et de trouver le rectum. Avec une paire de pinces et de ciseaux courbes dissection, appui et la section du rectum.
- Avec la même paire de forceps, déroulez soigneusement entièrement l'intestin par le rectum à l'estomac en tirant l'intestin sur votre gauche.
- Utilisation Noyes ciseaux et une paire de pinces, couper soigneusement le pancréas long de l'intestin et de la libérer de la rate du reste de l'appareil digestif.
- Prenez la rate et le pancréas section qui s'y rattachent (Figure 2).
À cette étape, assurez-vous qu'aucun tissu adipeux mésentérique et / ou d'autres tissus adjacents (rate, intestin, etc) pourraient être recueillies avec le pancréas, pour éviter toute contamination cellulaire.
Pour le reste de la procédure, tous les tampons doivent être préparés sans ion calcium Ca2 + chélateurs d'éviter la dissociation complète du tissu pancréatique exocrine dans les cellules acineuses simples.
- Rincer le pancréas deux fois dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) 1x.
À cette étape, comme les tissus adipeux flottera contrairement à pancréas qui va couler, il est facilement possible de visualiser et de supprimer rapidement le tissu adipeux blanc contaminant encore attaché au pancréas.
Si le pancréas doit être transporté à l'installation de culture de cellules, il doit être conservé sur la glace dans HBSS 1x.
- Transférer le pancréas dans une boîte de Pétri stérile contenant 5 ml de HBSS 1x. Utiliser Noyes ciseaux et un scalpel, découper le pancréas en petits morceaux de 1 à 3 mm 3 (figure 3A).
2. Dissociations enzymatiques et mécaniques du pancréas (jour 0)
- Les transférer dans un tube en polypropylène stérile de 50 ml.
- Centrifuger pendant 2 min à 450 xg et 4 ° C. Aspirer et jeter le surnageant pour éliminer les fragments des cellules et des cellules sanguines.
- Ajouter 10 ml de solution IA collagénase (HBSS 1x contenant 10 mM HEPES, 200 U / ml de CollagenaSE IA et 0,25 mg / ml d'inhibiteur de trypsine) à des sections de pancréas. Avec une pipette sérologique 25 ml, transférer à un flacon de 25 cm2. Incuber pendant 20-30 min à 37 ° C. Pendant ce temps (5 min), effectuer une dissociation mécanique par déplacement énergiquement va-et-vient des fragments de pancréas dizaine de fois, dans des pipettes stériles de taille décroissante (25, 10, et 5 pipettes sérologiques ml).
À cette étape, il est essentiel de surveiller fréquemment la mesure de la dissociation enzymatique des sections du pancréas.
- Lorsque le tissu pancréatique semble être bien dissocié (en fonction de la disparition de fragments du pancréas et de l'augmentation de la turbidité de la solution) (figure 3B), arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 10 ml de froid tamponnée solution de lavage (HBSS 1x contenant 5 % de sérum foetal bovin (FBS) et HEPES 10 mM).
- Transférer dans un tube en polypropylène stérile de 50 ml et centrifuge pendant 2 minutes à 450 x g et 4 ° C. Aspirer délicatement et jeter le surnageant pour éliminer la solution IA collagénase.
- Remettre en suspension et laver le culot avec 10 ml de solution de lavage tamponnée. Centrifuger 3 min à 450 xg et 4 ° C. Aspirer délicatement et jeter le surnageant. Répétez cette étape deux fois.
3. La filtration et l'ensemencement de Dispersés Acini (jour 0)
- Reprendre le culot cellulaire dans 7 ml de milieu de Waymouth contenant 2,5% de FBS, 1% de pénicilline-streptomycine mélange (PS), 0,25 mg / ml d'inhibiteur de trypsine, et 25 ng / ml de facteur de croissance épidermique humain recombinant (FEM).
- Filtrer le mélange de cellules en lui permettant de passer à travers un filtre pour retenir les fragments non digérés (canaux, les vaisseaux sanguins, et les îlots de Langerhans) 100 um. structures acineuses pancréatiques (acinus des cellules 10-15) passent à travers.
- Rincez le filtre avec 6 ml de milieu FBS contenant de Waymouth, PS, trypsine habibitor et EGF.
Après cette étape, les cellules doivent être traitées avec soin, afin d'éviter tout acini dissociation.
- Seed acini isolé dans une boîte de culture à 6 puits (2 ml par puits) (figure 3C). Culture eux à 37 ° C sous 5% de CO atmosphère (v / v) 2.
Après cette étape, les cellules acineuses sont cultivées en suspension.
4. Acinaire culture cellulaire (jour 1 à 10)
- Vingt-quatre heures après, transférer les acini (en suspension) dans une nouvelle boîte de culture à 6 puits, afin d'éliminer les cellules contaminantes et les débris cellulaires qui ont adhéré pendant la nuit (figure 4).
Si la culture cellulaire doit être prolongée pendant plusieurs jours ou si les conditions expérimentales exigent cellules cultivées en monocouche, il est recommandé de transfert et de semences acini sur des échafaudages matrice.
- La veille de voirDing sur la matrice de support (jour 0), manteau une boîte de culture à 6 puits avec collagène de type I (5 mg / cm 2). Ajouter 1 ml de solution de collagène de type I (50 ug / ml dans l'acide acétique 0,02 M, 0,2 um-filtrée) à chaque puits et permettre de manière passive s'adsorber sur du plastique, pendant 1 h à 37 ° C (ou pendant une nuit à 4 ° C ).
- Aspirer le type solution de collagène de type I et rincez-le bien couché deux fois avec un tampon phosphate salin 1x.
- Autoriser l'enduit bien sécher (sous un poste de sécurité microbiologique) au moins 12 heures avant utilisation.
- Transférer le primaire acini isolé (obtenu à l'étape 4.1) dans le plat je enduite de collagène 6 puits culture et la culture dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment (à 37 ° C sous 5% de CO atmosphère (v / v) 2) Type . Les cellules adhèrent au substrat de collagène de type I pendant 2 jours.
- Au jour 3, changer le milieu de culture pour éliminer les cellules non viables qui n'ont pas adhéré. Avec le temps, la culture, les cellules vont progressivement splu sur le support contenant du collagène. Changer le milieu de culture tous les 3 jours (Figure 5).
Les cellules acineuses isolées obtenues peuvent être comptés, après une dissociation mécanique complète en utilisant une chambre de comptage de cellule de Thoma. Notez que les cellules acineuses isolées ne peuvent pas être maintenues en culture par la suite.
La qualité de la culture acinaire obtenue peut être contrôlée en contrôlant l'expression de marqueurs spécifiques acinaires comme Trypsinogen, Pancréas Transcription Factor 1 sous-unité alpha, ou Carboxypeptidase A1 (par immunohistochimie ou immunofluorescence expériences).
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Representative Results
La figure 1 schématise le "dispersé" méthode acini des cellules d'isolement acinaire primaire. Les étapes critiques, qui doivent être strictement respectées pendant le protocole, sont décrites dans la partie de la discussion.
Pour faciliter son retrait, le pancréas doit être recueillie à partir de l'abdomen avec la rate jointe (figure 2). Les deux organes doivent être coupées à part, et le tissu adipeux résiduel qui pourrait être encore attaché au pancréas doivent être retirés (étape 1.6).
La macro et microscopiques des photos, qui sont présentés dans la figure 3, représentent le résultat après chaque étape des dissociations enzymatiques et mécaniques du pancréas. Après le tranchage, le pancréas est divisé en petites parties (figure 3A; étape 1.8). La figure 3B montre l'aspect du pancréas suite à une dissociation enzymatique succès en s'appuyant sur un tempor prudentsurveillance al de la digestion en cours (étape 2.4). Cette étape est une étape cruciale pour déterminer l'heure exacte qui est nécessaire. La figure 3C montre le matériau obtenu après la filtration du mélange du pancréas (étape 3.4). Seuls les acini bien séparés sont maintenus après cette étape.
La figure 4 est une journée typique 1 illustration des acini pancréatiques isolés en utilisant notre protocole. Le transfert de cellules acineuses en une nouvelle boîte de culture permet d'éliminer les débris cellulaires et les cellules contaminantes adhérentes (étape 4.1).
Comme le montre la figure 5, lorsqu'elle est cultivée sur collagène de type I, les cellules acineuses répartis et perdent leur différenciation des cellules acineuses (morphologie et l'organisation 3D), donnant lieu à une monocouche de cellules en forme de broche (étape 4.6).
Figure 1. Représentation schématique du protocole permettant l'isolement de souris primaire dispersé acini.
Figure 2. Anatomie du pancréas après dissection. Des flèches rouges et jaunes indiquent respectivement les connexions anatomiques restants avec la rate et le tissu adipeux mésentérique qui ont besoin d'être coupé pour la collecte du pancréas.
Figure 3. Dispersés acini isolement (jour 0) visualisé par une observation macroscopique (à gauche) et la microscopie à contraste de phase (panneau de droite, grossissement 40X). A) Après dilacération (montré dans un flacon de 25 cm2). B) Après la collagénase IA digestion et vigoureux mécanique dissociatisur. C) Après filtration et transfert dans une boîte de culture à 6 puits.
Figure 4. Dispersés acini culture, 24 h après l'ensemencement (jour 1), visualisé par microscopie à contraste de phase (grossissement 40X).
Figure 5. Dispersés culture acini sur un type I plat enduit de collagène les jours 2, 4 et 7 visualisées par microscopie à contraste de phase (40X, 120X, 240X et agrandissements).
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une procédure pour isoler des cellules acineuses du pancréas. Cette méthode permet d'isoler plus de 20 x 10 6 cellules acineuses par animal en moins d'une heure. Merci à sa mise en œuvre simple et rapide (moins de 10 pancréas peuvent être traitées indépendamment par expérience en parallèle), ce protocole apparaît comme un bon compromis entre les méthodes d'isolation existants 3-5,9-12,17.
Les étapes critiques / recherche de pannes
L'efficacité de cette méthode repose sur les précautions prises sur quelques points essentiels. La première étape de dilacération du pancréas (étape 1.8) est essentielle à la digestion enzymatique du pancréas ultérieure. Insuffisant dépeçage diminuera le rendement de dissociation enzymatique et le nombre de cellules acineuses obtenus. Il est donc nécessaire de prolonger l'incubation avec de la collagénase IA, ce qui provoque inévitablement une dissociation excessive des cellules acineuses et consécuaugmenter relativement la mort cellulaire.
Comme mis en garde ci-dessus, la deuxième étape critique est la digestion par la collagénase IA (étape 2.3). Trop de dissociation enzymatique conduit à un taux élevé de mort cellulaire. L'étendue de la digestion du pancréas doit être fréquemment contrôlée pendant cette étape critique (figure 3B). Après dissociations mécaniques et enzymatiques, une attention particulière doit être accordée afin de gérer très doucement le acini dispersés afin de préserver leurs structures intercellulaires.
Limitations
Même si l'ajout du facteur de croissance épidermique (EGF) à la culture de l'Waymouth peut précipiter la transdifférenciation acinaire-à-canalaire progressive, il est essentiel de maintenir les cellules en vie.
Comme décrit dans le protocole et, si nécessaire, la période de culture in vitro des cellules acineuses peut être prolongée jusqu'à 10 jours par ensemencement des cellules sur la matrice scaffolds comme collagène de type I. Pourtant important, et comme indiqué par d'autres 1, les cellules en culture sur collagène de type I va induire la transdifférenciation progressive des cellules acineuses de cellules canalaires. Ce processus commence après 4 jours de culture sur le collagène et peut être complète au bout de 7 jours. Il peut donc être nécessaire de vérifier la présence d'un marqueur spécifique canalaire comme le transmembranaire de la fibrose kystique régulateur de la conductance ou cytokératine-19 (par immunohistochimie ou immunofluorescence expériences) si la culture des cellules acineuses doit être étendu à 1 semaine. L'utilisation alternative de Matrigel comme une matrice échafaud, en réduisant l'adhésion des acini dispersés, il est possible de prolonger le maintien de leur phénotype acinaire pendant 2 jours.
Modifications possibles
Sectionnement du rectum lors de l'étape de dissection augmente le risque de contamination bactérienne. Nous n'avons jamais connu une telle situation. Toutefois, en cas de besoin, il ya une autre procédure pour contourner ce problème possible. Il consiste à trouver l'estomac, la rate et la première partie du duodénum, pancréas et coupe-joint. Notez que cette procédure alternative doit être parfaitement maîtrisé. Sinon, la durée de la dissection obtiendra plus, compromettant alors la qualité du matériel biologique prélevé.
La culture monocouche à long terme des cellules acineuses peut être optimisé, en particulier en modifiant la matrice de support. Si requis par les conditions expérimentales, collagène de type I peut être remplacé par un autre échafaud, comme Matrigel. Dans ce cas, Matrigel doit être fraîchement préparé à 400 pg / ml de concentration dans le froid tampon phosphate salin 1x. Par la suite, les puits sont incubés avec Matrigel (40 mg / cm 2) pendant une nuit à 4 ° C. Ce point doit être strictement respectée. La procédure de la culture reste la même que celle décrite à l'étape 4.
Procédé can être encore optimisé empiriquement. Par exemple, la quantité d'acides aminés dans le milieu de culture des cellules pancréatiques exocrines peut réguler la synthèse des protéines par les cellules 18. 2 Sphyris et al. Et Bläuer et al. 19 ont élaboré un milieu de culture complet contenant une quantité élevée d'acides aminés (essentiels et non essentiels), la promotion de la maintenance des cellules acineuses dans l'état différencié. Un tel milieu peut être très utile si l'on souhaite cultiver des cellules acineuses isolés par cette méthode depuis plus de 10 jours.
Un autre paramètre qui peut être modifié si la culture à long terme est nécessaire, est le pH du milieu de culture. Physiologiquement, le pôle apical des cellules acineuses est en contact permanent avec un bicarbonate liquide riche, légèrement alcalin donnant lieu à la suc pancréatique. Il est tentant de spéculer que le pH de l'environnement des cellules acineuses pourrait être important dans le maintien de la acinaire differentiatioétat n. Certains protocoles précédemment rapporté l'utilisation d'un milieu de culture dont le pH est ajusté à 7,8 à imiter la physiologie "initiale" des cellules acineuses 19.
Importance de la technique
Il est important de mentionner qu'il existe d'autres protocoles pour les cellules acineuses de culture, en utilisant des explants de pancréas et de cultures organotypiques 19. Leur application, sur la base de la migration des cellules du pancréas de l'explant de la membrane sur lequel ils sont cultivés, est plus difficile. L'isolement de ces cellules pancréatiques nécessite notamment une première semaine de culture d'explants de pancréas. Le principal avantage de cette méthode est qu'elle ne dissociation enzymatique est nécessaire, de sorte que la fois l'intégrité de la membrane cellulaire et les interactions cellule-cellule sont préservés. Dans ces conditions, les cellules acineuses peuvent être maintenues in vitro pendant 14 jours. Pourtant, la culture des cellules acineuses obtenu n'est pas pur, et les fibroblastes contaminants, le Ductal caunes, et les cellules endothéliales sont inévitablement présents, ce qui pourrait être incompatible avec certains types d'expériences. En revanche, notre méthode donne rapidement une population pure de cellules acineuses, de conserver leur architecture initiale des acini.
Dorrell et al. Décrit une autre méthode pour isoler les différents types de cellules pancréatiques de souris (y compris acinaire, conduit, et les cellules endocrines), par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 17. Cette méthode est très efficace pour obtenir une population pure (ou spécifique) des cellules acineuses. Cependant, elle nécessite un marquage fluorescent avec des anticorps spécifiques, le tri préalable. En outre, cette procédure nécessite également une expertise en FACS et un cytomètre de flux. Par ailleurs, cette technique ne permet pas une culture prolongée des cellules acineuses, en raison de la perte de leur architecture initiale de acini. Notre méthode rapide permet une extension dans la culture in vitro de cellules acineuses dispersées avec une qualité et une pureté qui are compatible avec la plupart des autres applications courantes.
Les applications futures
Une fois maîtrisée, cette technique permettant d'isoler les cellules acineuses / de culture devrait se révéler très utile pour aborder une série de questions et notamment pour étudier les mécanismes impliqués dans la plasticité du pancréas et transdifférenciation, qui sont bien connus, mais mal compris. En préservant certaines communications inter-et intra-cellulaire, ce modèle reste dispersé acini plus physiologiquement pertinente de lignées cellulaires immortalisées.
Dans le domaine de la tumorigenèse du pancréas, ce modèle cellulaire primaire fournit un système adéquat pour l'étude de la transdifférenciation des cellules acineuses, l'un des mécanismes proposés pour générer des cancers pancréatiques agressives. Bien que les lignées de cellules humaines ou murines immortalisées (comme Colo357, Panc-1, ou BxPC3) pourraient être plus souple à utiliser que les cellules acineuses primaires, à la fois leur origine et leur maquettestatut génétique lex (lignées cellulaires transformées initialement isolées de tumeurs pancréatiques ou même des métastases pancréatiques) constituent des inconvénients majeurs dans l'étude de ces mécanismes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions le personnel de AniCan (CRCL, Lyon) pour leur assistance technique aux soins des animaux. Ce travail a été financé par l'Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Program), la Ligue Nationale Contre le Cancer, l'Association pour la Recherche sur le Cancer, par l'Institut National du Cancer, et par des bourses de la Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), de l'Institut National du Cancer (JG), du Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche de la France (RMP et DFV) et de l'Association pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
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