Summary
בפרסום זה, אנו מתארים הליך מהיר ונוח לבידוד ותאי לבלב acinar העיקריים culturing מהלבלב העכברי. שיטה זו מהווה גישה רבת ערך כדי ללמוד את הפיסיולוגיה של תאי לבלב אקסוקרינית רגילים / untransformed העיקריים טריים.
Abstract
פרוטוקול זה מאפשר בידוד מהיר (בשעה פחות מ 1) לacini לבלב העכברי, כך שניתן לשמור אותם בתרבות ליותר משבוע אחד. ניתן לקבל יותר מ -20 10 6 תאי acinar x מלבלב עכברי אחת. פרוטוקול זה מציע את האפשרות לעבד באופן עצמאי רבים כמו 10 לבלב במקביל. משום שהיא משמרת את ארכיטקטורת acinar, מודל זה מתאים גם ללימוד הפיסיולוגיה של הלבלב אקסוקרינית במבחנה בניגוד לשורות תאים הוקמו מגידולים בלבלב, המציגים שינויים גנטיים רבים וכתוצאה מכך האובדן חלקי או מוחלט של בידול acinar שלהם.
Introduction
בעיה נתקל לעתים קרובות למעבדות מחקר עובדים על רקמת לבלב אקסוקרינית היא הקושי בטיפוח תאים במבחנה acinar לתקופת הזמן ארוך מספיק כדי לאפשר ניסוי לטווח ארוך.
גורם אחד מונע פיתוח של מערכות תרבות כזו הוא הרגישות הפנימית של רקמת לבלב למניפולציה ניסויית בשל תכולה הגבוהה באנזימי glycolytic, פרוטאוליטי, וlipolytic, שפשוטו כמשמעו לעכל את רקמת הלבלב כאשר הם משתחררים בבידוד של תאי לבלב.
גורם שני הוא יוצא דופן בפלסטיות במבחנה של תאי acinar, אשר נוטים לאבד את התכונות שלהם והפרשת transdifferentiate לתאים בוגרים אחרים, כגון תאי לבלב או תאי ductal דמויי hepatocyte 1. במבחנה, פלסטיות תא זה משתנה עם תנאי הניסוי (כמו הרכב בינוני תרבות) 2 1.
כמה שיטות פותחו לבידוד ולתרבות של תאי acinar, ראשון מלבלב חזיר ים 3-5. בתחילה, פרוטוקולים אלה מעורבים עיכול של רקמת לבלב עם collagenase, chymotrypsin, וקוקטייל פרוטאז, עם בידוד אולטימטיבי על ידי ניתוק מכאני נמרץ. תאי הלבלב שבודדו בדרך זו מוצגים מאפיינים מבניים ותפקודיים תקינים, בעיקר אובדן של מבני apical ונזק משמעותי לקולטניים הקרום שלהם. תאים מבודדים נותרו מעשיים עבור רק 1 או 2 ימים.
הכנת התפזרה acini שומר על אדריכלות הפנים ואינטר שלהם, שמירה על ממברנות תאים, הגבלת נזק לקולטנים על פני, ובכך לשפר את ההפרשה אקסוקרינית בתגובה לsecretagogues 6-8. כresuLT, שיטה זו מציעה יתרון הגדול של הארכת כדאיות תא acinar ל7-10 ימים במבחנה. יתר על כן, בשיטה זו היא כיום העדיפה בידוד תא acinar 9-12 בגלל התחזוקה של קשר אינטר, כולל תא צימוד על ידי צמתים פער, היא הקובע חיוני של פנוטיפ תא acinar הלבלב אקסוקרינית 13.
כמו טשטוש ההבדלים של תאי acinar וtransdifferentiation לתאי ductal הוא אחד המנגנונים המוצעים לראשיתו של סרטן הלבלב אקסוקרינית אגרסיבי 14, התפזר acini המודל הוא גם מערכת נאותה ללמוד פלסטיות לבלב והמנגנונים המולקולריים הבאים שלה. יתר על כן, בשילוב עם שימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטי 15,16 והפיתוח של טכניקות העברת גנים (2 adenoviral או התמרה lentiviral, שימוש של חלקיקים, וכו '), זה במודל תא acinar העיקרי מבחנה יכוללהיות מאוד שימושי בקביעת אופן תפקוד גנטי שונים משפיע על הוויסות של התמיינות תאי acinar או טשטוש הבדלים, ואמור לספק הבנה טובה יותר של האירועים המולקולריים האחראים להתפרצות של דלקת בלבלב, נגעים טרום סרטניים, ושינויים בפלסטיות תא.
בידוד של פזורים acini הוא הגישה שאנו משתמשים במעבדה שלנו לתאי לבלב acinar תרבות. אנחנו כאן לתאר ולדון בשיטה. זה כרוך בניתוק האנזימטית של רקמת לבלב (עם collagenase חיידקים) מצמידים את השיבוש מכאני ללא ניתוק של תאי acinar. בעוד שרוב הפרוטוקולים כרוכים culturing acini, או בהשעיה או במצעי פלסטיק שטופלו במיוחד, אנו לגדל אותם בהשעיה לזמן קצר בלבד (במשך 24 שעות), זריעתם אחר כך על גבי פיגומי מטריצה אם נדרשת תרבית תאים ממושכת.
פרוטוקול זה מאפשר בידוד מהיר (בשעה פחות מ 1) התפזר לבלב ACINI, בר קיימא ליותר משבוע אחד בתרבות. זה מאפשר בידוד של יותר מ 20 x 10 6 תאים לכל acinar לבלב עכבר. הפשטות שלו מאפשרת לעבד באופן עצמאי רבים כמו 10 לבלב במקביל. על ידי שמירה על אדריכלות הפנים ואינטר של acini ולכן הפנוטיפ acinar של תאים ראשוניים מבודדים, מודל זה מהווה מערכת של בחירה עבור המחקר של מנגנוני transdifferentiation, כמו כל דגמי הלבלב אקסוקרינית האחרים הזמינים כיום נגזרים מגידולים בלבלב מוצגות רבים גנטיים שינויים שהובילו להפיכה סלולרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים אושרו על ידי ועדת אתיקה תחת רגולציה של רשות שלטונית ("ד 'Comité הערכת Commun au מרכז לאון ראר, à l'Animalerie דה מעבר de l'ENS, au PBES et au Laboratoire P4" (CECCAPP)). עכברים נשמרו במתקן בעלי חיים ללא הפתוגן ספציפי ב" Plateforme AniCan, מרכז לאון ראר "(ליון, צרפת) וטפלו בעמידה בהנחיות מוסדיות.
ייצוג סכמטי של ההליך מוצג באיור 1.
1. Dissection הלבלב וDilaceration (יום 0)
נתיחה מהירה מאוד היא קריטית לתשואה אופטימלית של חילוץ ולבטח את כדאיות טובה של תאים בתרבית. על מנת לצמצם את הזמן דרוש לבידוד לבלב, כל המכשירים וציוד חייבים להיות מוכנים לפני המתת חסד העכבר.
- להרדים את העכבר על ידי CO 2 מחנק או נקע בצוואר רחם.
מהשלב הזה, כל הנהלים צריכים להתבצע תחת אווירה סטרילית (ארון בטיחות מיקרוביולוגית, רמה השנייה) עם ציוד נתיחת סטרילי.
- תקן את העכבר ולרסס את בטן העכבר עם 70% אתנול. עם כל מספריים ומלקחיים לנתח, לעשות חתך בצורת V באזור איברי המין ולהמשיך אותו עד לסרעפת כדי לפתוח לחלוטין את חלל הבטן.
- מקם את האונה של הכבד נגד הסרעפת, הם צריכים להישאר שם אם חלל הגוף פתוח מספיק רחוק. משוך את הבטן והמעי גס מחוץ לחלל הבטן לשמאלך, ולמצוא את הטבעת. עם זוג מלקחיים המעוקלים ולנתח מספריים, גזל וסעיף פי הטבעת.
- עם אותו זוג מלקחיים, בזהירות לפרוש לחלוטין מהמעי פי הטבעת לקיבה על ידי משיכת המעי בצד שמאל.
- בעזרת מספריים נויס וזוג מלקחיים, לחתוך בזהירות את הלבלב לאורך המעי ולשחרר אותו עם טחול משאר מערכת העיכול.
- תפוס את הטחול ולבלב הסעיף קשור אליו (איור 2).
בשלב זה, כדי להיות בטוח ששום רקמת mesenteric שומן ו / או רקמות סמוכות אחרות (טחול, מעי, וכו ') יכולים להיות שנאספו בלבלב, כדי למנוע זיהום סלולרי.
לשאר הליך, כל המאגרים חייבים להיות מוכנים ללא יון סידן Ca 2 + chelators כדי למנוע ניתוק של רקמת הלבלב אקסוקרינית בתאים בודדים acinar המלא.
- יש לשטוף את הלבלב פעמיים בתמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) 1x.
בשלב זה, כרקמת שומן תצוף בניגוד ללבלב שישקע, זה בקלות אפשר לדמיין ומהירות להסיר את רקמת השומן הלבנה המזהם עדיין מחוברת ללבלב.
אם הלבלב צריך להיות מועבר למתקן תרבית התאים, הוא חייב להיות כל הזמן על קרח בHBSS 1x.
- העבר את הלבלב בצלחת פטרי סטרילית המכילה 5 מ"ל של HBSS 1x. בעזרת מספריים ואזמל נויס, פורס את הלבלב בחתיכות קטנות של 1 עד 3 מ"מ 3 (איור 3 א).
2. התכחשויות אנזימטיות ומכאניות של לבלב (יום 0)
- להעביר אותם לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל פוליפרופילן.
- צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 450 XG ו 4 ° C. לשאוב וזורקים supernatant כדי להסיר שברי תאים ותאי דם.
- הוסף 10 מ"ל של תמיסת IA collagenase (HBSS 1x המכיל 10 HEPES מ"מ, 200 U / מ"ל של collagenase IA, ו0.25 מ"ג / מ"ל של מעכב טריפסין) לסעיפים לבלב. בעזרת פיפטה סרולוגיות 25 מ"ל, להעביר אותם לבקבוק 25 ס"מ 2. דגירה אותו במשך 20-30 דקות על 37 ° C. במהלך תקופה זו (כל 5 דקות), לבצע ניתוק מכאני על ידי אנרגטי נע קדימה ואחורה, שברי הלבלב כעשר פעמים, בpipettes סטריליים של גודל ירידה (25, 10, ו 5 pipettes סרולוגיות מ"ל).
בשלב זה, זה חיוני כדי לפקח על מידת הניתוק האנזימטית של סעיפי לבלב לעתים קרובות.
- כשנראה שרקמת הלבלב להיות מנותק היטב (בהתאם להיעלמותו של ברים ללבלב והעכירות המוגברת של הפתרון) (איור 3), לעצור את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 10 מ"ל של תמיסה קרה שנאגרו כביסה (HBSS 1x המכיל 5 % סרום שור עוברי (FBS) ו10 HEPES מ"מ).
- להעביר אותו לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל פוליפרופילן וcentrifuge למשך 2 דקות ב 450 XG ו 4 ° C. בזהירות לשאוב וזורקים supernatant כדי להסיר את פתרון IA collagenase.
- Resuspend ושטוף את הכדור עם 10 מ"ל של תמיסת שטיפה נאגרה. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 450 XG ו 4 ° C. בזהירות לשאוב וזורקים supernatant. חזור על פעולה זו עוד פעמיים.
3. סינון וזריעה של מפוזר acini (יום 0)
- Resuspend התא גלולה ב7 מ"ל של המדיום של Waymouth המכיל 2.5% FBS, 1% פניצילין, סטרפטומיצין תערובת (PS), 0.25 מ"ג / מ"ל של מעכב טריפסין, ו25 ng / ml של רקומביננטי עוריות Growth Factor האנושי (EGF).
- תסנין תערובת התא כך שהוא מאפשר לו לעבור ב100 מיקרומטר סינון כדי לשמר את שברים שאינם מתעכלים (צינורות, כלי דם, ואיים לנגרהנס). מבני acinar לבלב (acinus של 10-15 תאים) לעבור.
- יש לשטוף את המסנן עם 6 מ"ל של FBS של Waymouth מדיום המכילים, PS, טריפסין INHibitor, וEGF.
לאחר שלב זה, התאים צריכים להיות מטופלים בזהירות רבה, כדי למנוע כל acini דיסוציאציה.
- זרעי acini המבודד בצלחת תרבות 6 היטב (2 מ"ל לכל טוב) (איור 3 ג). תרבותם על 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% (V / V) אווירת CO 2.
לאחר שלב זה, התאים בתרבית acinar בהשעיה.
4. תרבית תאי acinar (יום 1 עד 10)
- עשרים וארבע שעות אחרי, להעביר את acini (בהשעיה) לתוך צלחת תרבות 6 גם חדשה, כדי לחסל את התאים מזהמים ושאריות תאיות שיש דבק בין לילה (איור 4).
אם תרבית התאים צריכה להיות הוארכה במשך כמה ימים, או אם תנאי הניסוי דורשים תאים גדלו בmonolayer, מומלץ להעברה ולזרע acini על פיגומי מטריקס.
- היום לפני לראותדינג על תמיכת מטריצה (יום 0), מעיל צלחת תרבות 6 היטב עם סוג אני קולגן (5 מיקרוגרם / 2 ס"מ). הוסף 1 מ"ל שלי פתרון קולגן סוג (50 מיקרוגרם / מ"ל ב0.02 חומצה אצטית M, 0.2 מיקרומטר סונן) היטב כל אחד ולאפשר לו לספוג באופן פסיבי פלסטיק, בשעה 1 ב 37 ° C (או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס ).
- לשאוב את סוג פתרון קולגן אני ולשטוף היטב מצופה פעמיים עם פוספט שנאגר מלוח 1x.
- לאפשר מצופה היטב לייבוש (מתחת לארון בטיחות מיקרוביולוגית) לפחות 12 שעות לפני השימוש.
- העבר acini העיקרי המבודד (המתקבל בשלב 4.1) לסוגי צלחת קולגן מצופה 6 גם תרבות והתרבות באותם תנאים כפי שתואר קודם לכן (ב 37 מעלות מתחת ל -5% (V / V) אווירת C-CO 2) . התאים לדבוק במצע קולגן אני הסוג למשך 2 ימים.
- ביום 3, לשנות את התרבות בינונית לחסל תאים שאינם בנות קיימא שאינו דבקים. עם זמן בתרבות, התאים בהדרגה SPלקרוא על התמיכה המכילה קולגן. לשנות את התרבות בינונית כל 3 ימים (איור 5).
את התאים המתקבלים acinar המבודדים ניתן לספור, לאחר ניתוק מכאני מוחלט באמצעות תא ספירת תאי תומה. שימו לב שלא ניתן לשמור על תאי acinar מבודדים בתרבות אחר כך.
איכות תרבות acinar הושגה יכולה להיות נשלטה על ידי בדיקת הביטוי של סמני acinar ספציפיים כגון Trypsinogen, אלפא 1 גורם שעתוק לבלב המקטע, או A1 Carboxypeptidase (על ידי immunocytochemistry או ניסויי immunofluorescence).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 schematizes שיטת acini "התפזרה" לבידוד תאי acinar העיקרי. את השלבים הקריטיים, שבו יש לכבד בקפדנות במהלך הפרוטוקול, מתוארים בחלקו הדיון.
כדי להקל על הסרתו, יש לו את הלבלב שייגבה מהבטן יחד עם הטחול המצורף (איור 2). שני האיברים צריכים להיות מנותקים זה מזה, ורקמת שומן שיורי שאפשר היה עדיין מחוברת ללבלב יש להסיר (שלב 1.6).
מקרו ותמונות מיקרוסקופיות, המוצגות באיור 3, מייצגים את התוצאה אחרי כל צעד של התנתקויות אנזימטיות ומכאניות של הלבלב. לאחר החיתוך, הלבלב מחולק לחלקים קטנים (איור 3 א; שלב 1.8). 3B איור מראה היבט של הלבלב בעקבות ניתוק האנזימטית מוצלח להסתמך על tempor זהירהניטור של אל העיכול המתמשך (שלב 2.4). צעד זה הוא צעד חיוני כדי לקבוע את הזמן המדויק שצריך. איור 3 ג מציג את החומר המתקבל לאחר הסינון של תערובת הלבלב (שלב 3.4). רק את acini המופרדים היטב נשמרים לאחר שלב זה.
איור 4 הוא יום איור 1 אופייני ללבלב acini מבודד באמצעות הפרוטוקול שלנו. העברת תאי acinar לתוך צלחת התרבות חדשה מאפשרת לחסל את שברים סלולריים והתאים המזהמים חסיד (שלב 4.1).
כפי שניתן לראות באיור 5, כאשר בתרבית על הסוג אני קולגן, תאי acinar להתפשט ולאבד את בידול acinar (מורפולוגיה וארגון 3D), והוליד monolayer של כישור בצורת תאים (שלב 4.6).
איור 1. ייצוג סכמטי של הפרוטוקול המאפשר בידוד של עכבר עיקרי התפזר acini.
איור 2. האנטומיה גולמית של הלבלב לאחר נתיחה. חיצים אדומים וצהובים בהתאמה לציין את קשרים אנטומיים שנותרו עם הטחול ורקמת שומן mesenteric שצריך לחתוך לאוסף לבלב.
איור 3. התפזר acini בידוד (יום 0) דמיין ידי תצפית מקרוסקופית (פנל משמאל) ושלב בניגוד מיקרוסקופיה (פנל מימין, הגדלה 40X).) לאחר dilaceration (שמוצג בבקבוקון 25 ס"מ 2). ב) לאחר עיכול collagenase IA ונמרץ מכאני dissociatiב. ג) לאחר סינון והעברה בצלחת תרבות 6 באר.
איור 4. התפזר acini תרבות, 24 שעות לאחר זריעה (יום 1), דמיין ידי מיקרוסקופיה שלב בניגוד (בהגדלה 40X).
איור 5. התפזר תרבות acini על סוג אני קולגן מצופה צלחת בימים 2, 4, ו -7 דמיינו ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד (40X, 120x, והגדלת 240x).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליך לבידוד תאי acinar לבלב. שיטה זו מאפשרת לבודד יותר מ 20 x 10 6 תאים לכל חיה acinar בשעה פחות מ 1. הודות ליישום המהיר ופשוט שלו (כמה שרק 10 לבלב יכול להיות מעובד באופן עצמאי לניסוי במקביל), פרוטוקול זה מופיע כפשרה טובה בין שיטות בידוד 3-5,9-12,17 קיימות.
שלבים קריטיים / בעיות ירי
היעילות של שיטה זו מסתמכת על אמצעי זהירות שננקטה בכמה נקודות קריטיות. הצעד הראשון של dilaceration הלבלב (שלב 1.8) הוא חיוני לעיכול אנזימטי לבלב שלאחר מכן. חיתוך למעלה מספיק יקטין את התשואה של דיסוציאציה האנזימטית ואת מספר תאי acinar מתקבלים. זה עושה את זה הכרחי כדי להאריך דגירה עם collagenase IA, באופן בלתי נמנע גורם לניתוק מוגזם של תאי acinar וconsecutively הגדלת מוות של תאים.
כהזהיר לעיל, השלב הקריטי השני הוא מערכת העיכול על ידי collagenase IA (שלב 2.3). יותר מדי דיסוציאציה האנזימטית מובילה לשיעור גבוה של מוות של תאים. היקף עיכול לבלב חייב להיות במעקב בתדירות גבוהה במהלך שלב קריטי זה (איור 3). לאחר התנתקויות מכאניות והאנזימטית, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולמת על מנת להתמודד עם acini התפזר בעדינות רבה על מנת לשמר את המבנים אינטר שלהם.
מגבלות
גם אם התוספת של גורם גדילה באפידרמיס (EGF) לתרבות של Waymouth עשויה לזרז transdifferentiation acinar לductal המתקדם, זה הכרחי כדי לשמור על תאי חיים.
כפי שתואר בפרוטוקול ואם יש צורך, תקופת התרבות במבחנה של תאי acinar ניתן להרחיב עד 10 ימים על ידי זריעת התאים במטריצה scaffבני כגון סוג אני קולגן כ. עם זאת, חשוב, וכפי שמוצג על ידי אחרים 1, תאי culturing על סוג אני קולגן יניעו transdifferentiation ההדרגתי של תאי acinar לתאי ductal. תהליך זה מתחיל לאחר 4 ימים של התרבות בקולגן ויכול להיות שלם לאחר 7 ימים. זה עשוי להיות נחוץ כדי לבדוק את קיומו של סמן ספציפי ductal כגון רגולטור סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליך או cytokeratin-19 (על ידי immunocytochemistry או ניסויי immunofluorescence) אם תרבית תאי acinar צריכה להיות מורחבת לשבוע 1 לכן. השימוש האלטרנטיבי של Matrigel כפיגום מטריקס, על ידי הפחתת ההיצמדות של acini התפזר, מאפשר להאריך את התחזוקה של הפנוטיפ acinar למשך 2 ימים.
שינויים אפשריים
חתך פי הטבעת במהלך שלב הנתיחה מגביר את הסיכון לזיהום חיידקים. אנחנו מעולם לא חווינו כזה אתרation. עם זאת, במידת צורך, יש הליך אחר כדי לעקוף את הבעיה אפשרית הזאת. זה מורכב של מציאת קיבה, טחול והחלק הראשון של התריסריון, וחתך לבלב מצורף. שים לב שההליך החלופי הזה צריך להיות שולט בצורה מושלמת. אחרת, את משך הזמן של הנתיחה יקבל יותר, אז לסכן את האיכות של החומר הביולוגי הוסר.
יכולה להיות מותאמת תרבות monolayer ארוכת הטווח של תאי acinar, בעיקר על ידי שינוי מטריצת התמיכה. אם נדרש על ידי תנאי הניסוי, הקלד יכול להיות מוחלף עם אחר אני קולגן פיגום, כגון Matrigel. במקרה זה, Matrigel חייב להיות מוכן טרי ב400 מיקרוגרם / מ"ל בריכוז קר פוספט שנאגר מלוח 1x. לאחר מכן, בארות מודגרת עם Matrigel (40 מיקרוגרם / 2 ס"מ) הלילה ב 4 ° C. נקודה זו יש לכבד בהחלט. הליך התרבות נשאר אותו הדבר כפי שמתואר בשלב 4.
שיטת can להיות מותאם יותר באופן אמפירי. לדוגמה, הסכום של חומצות אמינו במדיום התרבות של תאי לבלב אקסוקרינית יכול לווסת את סינתזת חלבון בתאים אלה 18. Sphyris et al. 2 וBlauer et al. יש 19 פירט מדיום תרבות שלם המכיל כמות גבוהה של חומצות אמינו (חיוני ושאינם חיוני), קידום תחזוקה של תאי acinar במדינה המובחנת. כגון בינונית יכול להיות מאוד שימושי אם אדם רוצה תאי acinar תרבות מבודדים בשיטה זו במשך יותר מ -10 ימים.
פרמטר נוסף שיכול להיות שונה אם נדרשת תרבות לטווח ארוך, הוא ה-pH של המדיום לתרבות. מבחינה פיזיולוגית, מוט הפסגה של תאי acinar נמצא בקשר קבוע עם נוזל עשיר ביקרבונט, מעט בסיסי והוליד את מיץ הלבלב. זה מפתה משער כי ה-pH של סביבת תא acinar יכול להיות חשובה בשמירה על differentiatio acinarמדינת n. פרוטוקולים מסוימים שדווחו בעבר את השימוש במדיום תרבות עם חומציות מותאמת ל7.8 לחקות את הפיסיולוגיה "הראשונית" של תאי acinar 19.
משמעות של הטכניקה
חשוב להזכיר כי קיימים פרוטוקולים אחרים לתאי acinar culturing, באמצעות explants לבלב ותרבויות organotypic 19. היישום שלהם, המבוסס על נדידת תאי לבלב מexplant אל הקרום שעליו הם מתורבתים, הוא קשה יותר. בידוד של תאי לבלב בעיקר אלה מחייב שבוע ראשון של תרבות explant לבלב. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שאין צורך בניתוק האנזימטית, כך שגם את שלמות קרום תא ואינטראקציות תא אל תא נשמרות. בתנאים אלה, יכולים להישמר תאי acinar במבחנה לתקופה של עד 14 ימים. עדיין תרבית תאי acinar הושגה אינה טהורה, וfibroblasts מזהם, ductal גאמות, ותאי האנדותל הם באופן בלתי נמנע בהווה, שיכול להיות בקנה אחד עם כמה סוגים של ניסויים. לעומת זאת, ההליך שלנו במהירות מניב אוכלוסייה טהורה של תאי acinar, הארכיטקטורה הראשונית שלהם שימור של acini.
Dorrell et al. תאר שיטה אחרת, כדי לבודד את סוגי תאי לבלב העכבר השונים (כולל acinar, צינור, ותאים האנדוקרינית), באמצעות מיון תא הקרינה המופעל (FACS) 17. שיטה זו היא יעילה מאוד להשיג אוכלוסייה (או ספציפי) טהורה של תאי acinar. עם זאת, זה דורש ניאון תיוג עם נוגדנים ספציפיים, לפני מיון. יתר על כן, הליך זה דורש גם מומחיות בFACS וcytometer זרימה. חוץ מזה, טכניקה זו אינה מאפשרת תרבות של תאים מורחבת acinar, עקב האובדן של האדריכלות הראשונית שלהם acini. השיטה המהירה שלנו מאפשרת מורחבת בתרבות במבחנה של תאי acinar מפוזרים עם איכות וטוהר המחדש בקנה אחד עם מרבית היישומים שגרתי נוספים.
יישומים עתידיים
ברגע ששולט, בטכניקה זו לבידוד תאי acinar / culturing צריכה להיות שימושית מאוד בטיפול במגוון רחב של שאלות ובעיקר לחקירת המנגנונים המעורבים בפלסטיות לבלב וtransdifferentiation, אשר ידוע גם, אבל הבינו היטב. על ידי שמירה על כמה תקשורת הבין תאית ו, זה התפזר acini המודל נשאר יותר רלוונטית מבחינה פיזיולוגית משורות תאים הונצחו.
בתחום tumorigenesis הלבלב, מודל תא ראשוני זה מספק מערכת נאותה ללימוד transdifferentiation תא acinar, אחד המנגנונים שהוצעו ליצירת סרטן הלבלב אגרסיבי. למרות ששורות תאים אנושיות או עכבריות הנציחו (כגון Colo357, PANC-1, או BxPC3) עשויות להיות גמישות יותר לשימוש מאשר תאי acinar עיקריים, גם מוצאם וcompמצב גנטי לקס (שורות תאים כהפכו מבודדות בתחילה מגידולים בלבלב או אפילו גרורות בלבלב) מהווה חסרונות עיקריים בחקר מנגנונים כאלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לצוות של AniCan (CrCl, ליון) לקבלת הסיוע הטכני שלהם עם טיפול בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי דה לה סנטה et de la Recherche Médicale (תכנית Avenir INSERM), Ligue Nationale Contre le הסרטן, על ידי אגודת pour la משוכלל ונדיר sur le הסרטן, על ידי המכון הלאומי לסרטן du, ועל ידי מלגות מ Ligue Nationale Contre le הסרטן (JG), מהמכון הלאומי לסרטן du (JG), ממיניסטר de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche של צרפת (RMP וDFV) ומאיגוד pour la משוכלל ונדיר sur le הסרטן ( DFV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
References
- Lardon, J., Bouwens, L. Metaplasia in the pancreas. Differentiation. 73, 278-286 (2005).
- Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro. Pancreas. 30, 148-157 (2005).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells. J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).
- Schultz, G. S., et al. Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase. Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini. Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).
- Han, B., Logsdon, C. D. Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation. Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).
- Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180. J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).
- Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase. Glia. 48, 102-111 (2004).
- Gaiser, S., et al. Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis. Gut. 60, 1379-1388 (2011).
- Logsdon, C. D., Williams, J. A. Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro. Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).
- Stanger, B. Z., Dor, Y. Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer. Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).
- Vincent, D. F., et al. Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway. Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).
- Vincent, D. F., et al. Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas. PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).
- Dorrell, C., et al. Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers. Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).
- Case, R. M. Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).
