Summary
Vi har utviklet en metode for å utføre kors i Setaria viridis (S. viridis). Fremgangsmåten omfatter beskjæring av panicle forut for varmtvannsbehandling for å drepe levedyktig pollen. Kors blir utført ved å følge en vel-kontrollert vekst regime og typisk resultere i utvinning av 1-7 kryssbestøvet frø / s per panicle.
Abstract
Setaria viridis er en ny modellsystem for C 4 gress. Det er nært knyttet til bioenergi råstoff switchgrass og kornavlinga revehale hirse. Nylig, den 510 Mb genomet av revehale hirse, S. italica, har blitt sekvensert 1,2 og 25x dekning genomsekvens av den slankere slektning S. viridis pågår. S. viridis har en rekke egenskaper som gjør det til et potensielt utmerket modell genetisk system inkludert en rask generasjonstid, liten av vekst, enkle vekst krav, produktive frøproduksjon tre og utviklet systemer for både forbigående og stabil transformasjon fire. Imidlertid genetikk av S. viridis er lite utforsket, delvis på grunn av mangel av detaljerte metoder for å utføre kors. Til dags dato har ingen standard protokoll er vedtatt som vil tillate rask produksjon av frø fra kontrollerte krysninger.
Protokollen presoppdelt i avdelinger her er optimalisert for å utføre genetiske krysninger i S. viridis, tiltredelse A10.1. Vi har ansatt en enkel varmebehandling med varmt vann for emasculation etter beskjæring panicle å beholde 20-30 buketter og merking av blomster for å fjerne frøene som følge av nyutviklede blomster etter emasculation. Etter testing av en serie med varmebehandlinger ved temperaturer ettergivende og variere varigheten av dypping, er det etablert en optimal temperatur og tidsområde på 48 ° C i 3-6 min. Ved å bruke denne metoden, kan et minimum av 15 kors utføres av en enkelt arbeidstaker per dag og et gjennomsnitt på 3-5 utkrysning avkom per panicle kan utvinnes. Derfor kan et gjennomsnitt på 45-75 outcross avkom blir produsert av en person på en enkelt dag. Bred implementering av denne teknikken vil lette utviklingen av rekombinante innavlede linjer bestander av S. viridis X S. viridis eller S. viridis X S. italica, kartlegging mutasjoner gjennom bulk segregant analyse og skape høyere ordens mutanter for genetisk analyse.
Introduction
S. viridis er en NADP-ME subtype C 4 gress nært knyttet til bioenergi råstoff switch (NAD-ME subtype), korn avling revehale hirse, og landbruket luke guinea gress fem. Den 510 Mb genomet av dyrket form av Setaria, S. italica, har nylig blitt sekvensert 1,2 og 25x dekning genomsekvens av den slankere slektning, S. viridis, pågår (upublisert). S. viridis har en rekke egenskaper som gjør det til et potensielt utmerket modell genetisk system inkludert en rask generasjonstid, liten av vekst, enkle vekst krav, og produktive frøproduksjon tre. Viktigere, har metoder nylig blitt utviklet for både forbigående og stabil transformasjon av S. viridis, som gir mulighet for å skape transgene planter 4.. Imidlertid er en stor flaskehalsen for utviklingen av genetiske verktøy for S. viridis er dens Recalcitrance til outcrossing. Til dags dato har ingen standard protokoll blitt publisert som vil tillate rask produksjon av frø fra kontrollerte krysninger.
Genetiske kors i S. italica er vanligvis utføres av emasculation gjennom fjerning av pollenknapper fra blomster 6,7,8 eller gjennom varmebehandling av blomster av kvinnelige foreldre 9-11. Etter disse behandlingene, pollenknapper eller panicles fra ikke-behandlede blomster / er mannlige foreldre forsiktig slipes mot arr slippe pollen. I emasculation, er pollenknapper fjernes med fin pinsett umiddelbart etter floret åpner og anther begynner å exsert, men har ennå ikke felle pollen 6-8. Blant utfordringene ved denne sistnevnte metode er vanskeligheten med å utføre emasculation i et smalt tidsintervall mellom åpningen og pollen skur av blomsten. Varigheten av åpning og lukking av en enkelt blomster vil variere avhengig av den inntreden-og miljømessig tilstand, og kan variere fra 7 min <sup> 6 til 2,5 hr 12 i S. italica. Siden Shedding av pollen oppstår som pollenknapper exsert fra floret, pollenknapper må fjernes nøye og raskt, og derfor er det vanskelig å unngå forurensning som skyldes selv-pollinering. I tillegg, som polli utføres umiddelbart etter emasculation, er antall krysninger som kan utføres per person / per dag begrenset.
Som en alternativ metode, kan moden panicles dyppes i varmt vann for å varme-drepe utvikle pollenkorn 9,10,13,14 med fordelen av å utføre kors på et stort antall panicles. Imidlertid, temperaturen og varigheten av varmebehandlingen varierer mye fra forskjellige eksperimenter (f. eks 47 ° C i 10 min 14 og 42 ° C i 20 min 10). Videre har ingen systematisk analyse av effekten av varme-mediert emasculations blitt publisert. Således, en standard og enkel metode for utførelse av genetiske krysninger i S. viridis ville sterkt akselerere genetisk ressurs utvikling og etablering av S. viridis som modellsystem innen forskersamfunnet.
Vi rapporterer utvikling og optimalisering av en standard protokoll for å utføre genetiske kors i S. viridis. Planter dyrkes under kontrollerte forhold for å synkronisere blomsterutvikling og øker reproduserbarheten av prosedyren. Crosses er utført ved hjelp av en transgen S. viridis linje som den mannlige overordnede som inneholder GUS reporter genet 4 for å lette identifiseringen av vellykkede kontrollerte genetiske kors. Den GUS transgenet blir drevet av en ris Ubiquitin promoter som muliggjør scoring av F1 frø umiddelbart etter høsting og derved gir en lett kvalitativ analyse for å bestemme effektiviteten av emasculation og pollinering. Vi har ansatt en enkel varmebehandling med varmt vann for emasculation ledsaget av merking av blomster som har vært emasculated å fjerne frøene som følge av nyutviklede blomster etter emasculation. Etter å ha testet en rekke varmebehandling ved givende temperaturer og varierende varighet dyppe i varmt vann, har vi etablert en optimal temperatur og tid varigheten av 48 ° C 3-6 min. En pre-daggry kuldebehandling ble funnet å fremme synkron anthesis i begge foreldre for å lette krysspollinering. Vi har også diskutert de viktigste trinnene i protokollen og den fremtidige anvendelsen av denne metoden til andre Setaria tiltredelser.
Protocol
En. Vekst av S. viridis
- Sett vekstkammerforhold til 31 ° C/22 ° C (dag / natt), 12 timers light/12 hr mørk, 50% relativ luftfuktighet med en pre-daggry behandling av 15 ° C 08:30-09:00 AM. (Figur 1). Under disse forholdene, S. viridis A10.1 tar ca 21-22 dager fra frø sådd til anthesis.
- Fyll leiligheter (4 x 9 celler) med Metro Mix 360 og fjerne en celle for vanning.
- Lett tåke vann på jordoverflaten.
- Så frø på overflaten av jord, et frø pr celle.
- Dekk frøene med et lag av jord (ca 0,5 cm)
- Tåke overflaten av jord-og vann flater fra bunnen. Hold vanning fra bunnen etter frø såing.
- For hver tverr som vil bli utført på minst tre anlegg vil bli brukt som hunnforeldre og ni planter vil bli brukt som hannforeldre. Seed såing bør forskjøvet som alle planter vil ikke blomstre på samme dag. Seed sowing er anbefalt hver dag over en periode på tre dager.
- Vanne plantene 1-2 ganger om dagen, noe som er avhengig av størrelsen av plantene og jord tilstand. Overskudd av vann i jord er ikke gunstig for optimal vekst av planter, og kan føre til soppvekst i jord og skade på bladvevet.
- Gjødsler planter to ganger i uken ved hjelp av Jack 15-16-17 ved en konsentrasjon på 100 ppm.
2. Trimming og merking av panicle Før emasculation - Dag 1
- På ettermiddagen eller kvelden før pollinering, flytte planter fra vekstkammeret til laboratoriet (Temperatur (T): 24.06 ° C ± 0,13 ° C, relativ luftfuktighet (RH) 21.79% ± 1,15%).
- Velg de primære panicles å ha en blomst til 1/3 av blomster på panicle som allerede har blomstret.
- I denne studien de fire domener innenfor panicle er definert som følger (Figur 2A, tips, distal midten, proksimale midten og base).
- Ideelt sett choosea panicle med 1-5 blomster som har blomstret, avskåret tuppen av panicle (distal ende), og fjerne alle blomstene i proksimale midten og fotenden ved hjelp av våren saks eller fin pinsett.
- Hvis en panicle har ca 1/10 til 1/5 av blomster som har blomstret, klippe av tuppen og trim blomster fra bunnen av panicle, bare beholde den nedre delen av distal midtre og øvre delen av proksimale midten for videre trimming.
- Hvis en panicle har ca 1/4 til 1/2 av blomster som har blomstret, avskåret distal midtre delen og bare beholde den proksimale midtre delen for ytterligere trimming.
- Bruk kirurgisk saks til lett trim bust.
- Fjern alle blomster som har blomstret og alle umodne blomster forlater ca 20-30 blomster / panicle som er jevnt fordelt i regionen (figur 3). Øv omsorg å beholde de bust i regionen som vil bli bestøves for å beskytte buketter fra mulig varmeskader.For hver spikelet, beholde den øverste mest modne floret. De øvre de fleste floret vil ha en høyere sannsynlighet for anthesis ved bestøvning (figur 2B).
- Markere den ene siden av hver blomst med en rød sprittusj og registrere antall buketter på panicle (figur 2B).
- Flagg på panicle med følgende informasjon: dato for emasculation, varigheten og temperaturen der emasculation utføres.
- Når panicle er trimmet, fjerne alle ror til hver plante for å sikre omfordeling av mer ressurser til utvikling av de viktigste panicle.
Tre. Emasculation med varmt vann-dipping - Dag 1
- Sett vannbad til 48 ° C ± 0,1 ° C for varmebehandling.
- Forsiktig bøye trimmet panicles og dyppe dem i varmt vann ved 48 ° C i 3-6 min. Vær forsiktig så du ikke ødelegger stammen av panicle.
- Ca 3-4 panicles kan dyppes together på en gang, og samtidig opprettholde tilstrekkelig plass mellom panicles for jevn fordeling av varmen. Det er vesentlig å senke hele panicle i varmt vann under varmebehandling. Flagg blad (blad strakte den panicle som gir næring til panicle) bør ikke komme i kontakt med varmt vann for å hindre varmeskade på bladvevet.
- Når emasculation er utført for ønsket varighet, fjerne panicles fra vannbadet og rist av vannet fra panicle.
- Plasser en tilpasset mikro-perforert brødpose for å fullt ut dekke emasculated panicle og fest den med en vri-tie. Micro-perforerte brødposer kan tilpasses i henhold til størrelsen på panicle (inkluderer i video).
- Plasser plantene tilbake i vekstkammeret før neste dag.
4. Crossing / pollinering etter emasculation - Dag 2 og dag 3
- Ved 09:00 på dag 2 og dag 3, flytte kvinnelige (emasculated) og male foreldre fra vekstkammeret til laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%) til å utføre kors.
- Observere og legge til en annen rød prikk til blomster som har blomstret eller blomstrer ved hjelp av en rød sprittusj. Spill det totale antall blomstret blomster per panicle.
- Noter dato for pollinering og navnet på den mannlige overordnede på brikken for å holde oversikt over hva kors er utført.
- Observer den beste årstiden for anthesis i mannlige foreldre. Under våre kammerforhold (figur 1) blomster på panicles av den mannlige overordnede begynne synkron åpning rundt 10:10. Fra tidspunktet for åpning av blomster, vil den fullstendige exsertion av pollenknapper og frigjøring av pollen oppstå etter 20 min.
- Den ideelle stadiet for pollinering er scenen der pollen fra den mannlige overordnede er utgitt. Blomstene vil stenge etter 20 min fra pollen utgivelsen. Derfor er varigheten for anthesis ca 40 minutter fra tidspunktet for åpning av strømningsers. Fargen endres fra pollen gulaktig hvit til brun i løpet av en periode på ca 30 min etter at blomsten blir lukket.
- Begynn pollinering umiddelbart når gulhvite pollenknapper er synlige på blomster av den mannlige overordnede. Polli utføres på dag 2 og dag 3 ved hjelp av én av de tre teknikker:
- Panicle-til-panicle pollinering: ved hjelp av en frittliggende panicle som den mannlige, forsiktig gni panicle sammen med emasculated panicle å lette pollinering og kast den mannlige panicle å unngå forurensning. Gjenta pollinering prosessen til hver emasculated panicle har blitt bestøvet av 2-3 panicles.
- Anther-til-stigma pollinering: ved hjelp av tang plukke en blomst som blomstrer med gulhvite pollenknapper eller plukke pollenknapper og fysisk berøre stigma av blomsten på kvinnelig forelder. Bruk en blomst fra den mannlige overordnede til å pollinere en blomst på emasculated panicle. Gjenta pollinering process til hver stigma på emasculated panicle har blitt bestøvet av noen få (ca 2-3) blomster / pollenknapper. Iført et forstørrelses visir vil gjengi bedre synlighet for å utføre pollinering.
- Mellom polli av forskjellige hannforeldre, dyppe tang i 95% etanol, etterfulgt av å tørke med Kimwipes å unngå forurensning på grunn av overhenget av pollen mellom forskjellige kors.
- Panicle binding: Etter emasculation, velg 3-4 panicles på den mannlige overordnede som vil blomstre neste dag. Bind dem sammen med emasculated panicle av kvinnelig forelder ved hjelp av en vri-tie. Plasser emasculated panicle litt under panicle av den mannlige overordnede. Plasser en glassine pose over panicles og feste vesken på basen med en binders. Dette kan gjennomføres på dag 2 når panicles av den mannlige overordnede starte anthesis.
- I blomstrings tid i morgen på dagen 2 og dag 3, flick eller riste glassine bag til facilitate pollinering. Fortsett å flick eller riste panicles hvert 15 min gjennom hele varigheten av anthesis i morgen (mellom 09:00-11: 00 AM). Fjern panicles av den mannlige overordnede etter pollinering, og merker den motsatte siden av de blomstret blomster på emasculated panicle. Registrere antall blomstret blomster på panicle av hver kvinnelig forelder.
- Når pollinering er utført, plasserer en tilpasset mikro-perforert brødpose for å dekke panicle av kvinnelig forelder og sikre på sokkelen med en vri-tie etter pollinering til frø høsting.
5. Seed Høsting
- Høst frø etter to uker (14-16 dager) fra den dagen av pollinering. Plasser koden i samme pose med frø. Frø som har røde markeringene på begge sider representerer frøene som resulterte fra den kontrollerte genetisk korset. Dette er forventet å være outcross avkom.
- Kast alle frø uten røde markeringer som de representererfrøene som følge av nyutviklede blomster etter emasculation. Frø med røde markeringer bare på den ene siden vil trolig representere frøene som følge av selv-pollinering som de ikke var blomstringen på den tiden da de kontrollerte korsene ble utført.
- Tørre frø ved 30 ° C for to dager i et frø tørketrommel. Oppbevar tørkede frø i laboratoriet (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, relativ luftfuktighet: 21,79% ± 1,15%), eller på et frø kammer (T: 4,0 ° C ± 1,0 ° C, relativ fuktighet 20% ± 1%).
Representative Results
I denne studien har vi brukt sekvensert S. viridis tiltredelse A10.1 som kvinnelig forelder, og en transgen S. viridis linjen (også A10.1) som inneholder GUS reporter gen 4 som den mannlige overordnede for alle polli. En optimalisert vekst regime ble brukt til å synkronisere blomstring, som vist i figur 1. Vi har testet flere kombinasjoner av temperatur og tid for varmebehandling for emasculation og observert at ca 40-80% av blomstene tilbakeholdt på emasculated panicle blomstret på 2. dag, mens resten blomstret på den 3. dag (figur 2). Men hvis varmebehandlingen var for alvorlige, for eksempel 49 ° C i 4 min, svært få eller ingen blomster blomstret på 2. dag. Kryss-pollinering ble utført på den 2. og 3. dag etter emasculation, som var avhengig av årstiden for anthesis av hannforeldre.
Det var observed at unge blomster fortsatte å utvikle etter emasculation, modnet og selvbestøves 3-6 dager etter kontrollerte polli. Etter 7-10 dager etter pollinering, blomster som er hvite i fargen er synlig på panicle. Disse hvite blomstene er ubefruktet grunn av enten varme skade eller dårlig pollinering. På samme tid, blomstene som har blitt bestøves begynne å bære mørke frø og begynne knuste etter 14 dager. De mørke frø med røde markeringer høstes på 14. dagen etter pollinering kunne klart skilles fra frøene uten røde markeringer som fortsatt var grønn og ikke knuse. Dersom høsting er forsinket, det anthecium av frøene med og uten røde markeringer både bli mørkt, noe som gjør det vanskelig å raskt skille frøene med røde markeringer i høstet bassenger.
For å optimalisere de krysset protokoll flere varmebehandlingsforsøk ble utført som sammenfattet i tabell 1.. Et gjennomsnitt av0-10 frø / panicle er hentet opp fra ulike varmebehandlingsforsøk. Etter høsting ble frø tørket ved 30 ° C i 2 dager i et frø dryer, etterfulgt av fjerning av anthecium ved hjelp av en anthecium fjerner. Etter anthecium ble fjernet, ble det antatte F1 frø farget med GUS flekker løsning, og utkrysning avkom farget blå farge i 1-2 timer (Figur 2F). Basert på disse resultatene, anbefaler vi en varmebehandling av 48 ° C i 3-6 min. Videre anbefaler vi at korsene utføres på både dag 2 og dag 3 etter emasculation.
For å undersøke effekten av denne teknikken i å utføre krysninger med andre Setaria tiltredelser eller arter, krysser mellom S. viridis A10.1 og åtte mangfoldig S. viridis tiltredelser og en S. pumila tiltredelse ble utført. Selv dager til blomstring variert blant tiltre vi funnet at blomster av alle åtte S. viridis tiltredelser og en S.pumila tiltredelse begynne åpning mellom 10:00-11:00 med en topp åpning tid på 10:20 til 11:00 etter predawn kuldebehandling. Dette indikerer at predawn kuldebehandling kan brukes på ulike Setaria tiltredelser. En varmebehandling av 48 ° C i 5-6 min ble brukt til å kastrere S. viridis A10.1 som ble benyttet som den kvinnelige moder for alle krysninger utført. Vi utvinnes fra en til 12 frø fra krysser mellom A10.1 og tre av de mangfoldige S. viridis tiltredelser og seks frø fra en enkelt krysning mellom S. viridis A10.1 og en enkelt S. pumila tiltredelse. Men på dette tidspunktet har vi ikke bestemt om disse frø resulterte fra en vellykket testcross eller var et resultat av selv-forurensning. Uansett disse foreløpige resultatene tyder på at de vekstbetingelser som brukes for S. viridis A10.1 kan brukes til å generere kors med diverse S. viridis tiltredelser og muligens andre arter av Setaria.
| Temp varmebehandling (° C) | Tidsvarmebehandling (min) | # kors | Avg. # Av blomster etter trim | Day of pollinering (dagen etter emasc) | Avg. # frø (rød) / panicle (gjennomsnitt) | Avg. % Gus (+) / frø (rød) | Avg. # Hyb frø (Gus +) | Min # hyb frø | Max # Hyb frø |
| 47 | 10 | 2 | 27 | Andre dag | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 48 | 3 | 3 | 36 | Andre dag | 5 | 60 | 3 | 1 | 5 |
| 4 | 3 | 25 | Tredje dag | 10 | 50 | 5 | 3 | 7 | |
| 5 | 8 | 25 | Andre dag | 5 | 60 | 3 | 1 | 6 | |
| 6 | 3 | 25 | Andre dag | 4 | 75 | 3 | 0 | 4 | |
| 7 | 4 | 24 | Andre dag | 3 | 33 | 1 | 0 | 4 | |
| 7 | 1 | 25 | Tredje dag | 4 | 75 | 3 | N / A | N /A | |
| 49 | 1 | 3 | 23 | Andre dag | 5 | 25 | 1 | 0 | 2 |
| 2 | 7 | 26 | Andre dag | 8 | 25 | 2 | 0 | 4 | |
| 3 | 5 | 22 | Andre dag | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | |
| 4 | 4 | 25 | Andre dag | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Tabell 1. Optimalisering av varmebehandling for emasculation. Resultater av å endre både temperatur og tid for varmebehandling. Polli ble utført ett (2 nd dag) eller to dager (3. dag) etter emasculation og vellykkede utkrysninger srørtråd med GUS flekker
Figur 1. Optimaliserte vekstkammerforhold med en pre-daggry kuldebehandling. Temperatur-og tidsperioder for optimal vekst og synkronisering av blomst produksjon er vist. Grønne og røde piler viser optimal vindu for å utføre kors og emasculation, henholdsvis.
Figur 2. Panicle forberedelse til krysset og GUS farging av utkrysning avkom. (A) En panicle av Setaria viridis A10.1 før trimming, viser ca 1/10 av blomster åpnet. De fire seksjoner og retningen i utviklingen av anthesis langs panicle vises.
Figur 3. Flytskjema av protokollen En skjematisk representasjon av major trinnene involvert i å utføre S. viridis krysser.
Discussion
Viktigheten av pre-daggry behandling
For å få en høy frekvens av utkrysning avkom er det viktig å ha høyt synkron anthesis av mannlige og kvinnelige foreldre. I første omgang, vi syklet temperatur og lys regimer (31 ° C/22 ° C, dag / natt) og brukte S. viridis tiltredelse A10.1 for alle polli. Under disse forholdene, de fleste blomstene åpner tidlig på morgenen før temperaturen stiger til 31 ° C, men noen blomster åpen tilfeldig mellom 08:00-8: 24:00. Tidligere studier i S. italica tyder på at tidspunktet på dagen, beliggenhet og sesong bidra til variasjon i anthesis 7,15,16. Siles et al. 6. bemerkes at anthesis var forbundet med hurtige endringer i temperatur og fuktighet, men ikke med lav temperatur og høy fuktighet, per se, som avsluttes i tidligere studier 7,15. Derfor har vi benyttet et forhånds dawn kuldebehandling på 15 ° C i 30 min (fra 08:30-9: 00 AM) for å etterligneden naturlige pre-daggry tilstand. Denne pre-daggry kaldt behandling hjulpet i synkronisering anthesis i foreldrene. Vi har observert at til tross for innstilling av kammeret for relativ luftfuktighet på 50%, den relative fuktighet inne i kammeret økes til et nivå over 70% som temperaturen falt fra 22 ° C til 15 ° C og fortsatte å holde seg over 70% til temperaturen gradvis steg til 31 ° C etter 09:30. Ved 09:00, emasculated kvinnelige foreldre og planter av mannlige overordnede er brakt til laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%). Blomster av de mannlige foreldre begynne å åpne rundt 10:10, og pollinering kan utføres ved 10:30-11: 00 AM. En detaljert liste over alle reagenser og utstyr er gitt i tabell 2.
Viktigheten av panicle forberedelse for emasculation
Under kammerforhold i denne studien (figur 1), varigheten av primær panicle blomstringen varierte fra2-3 dager. Vanligvis blomster som ligger på den distale midten av blomsterstanden (figur 2A) åpne første og åpning forut proksimalt og distalt. Det ideelle antall blomster som skal beholdes på panicle er 20-30. Forsiktighet bør utvises ved fjerning av umodne blomster slik at bare velutviklede blomster (den øverste blomst eller største på spikelet 17) beholdes. Merking med rød markør på begge sider av blomstene hjelper å effektivt skille utlagde utkrysning avkom fra frø fra nyutviklede blomster etter emasculation. I tillegg er det viktig å la bustene på de panicles før emasculation å beskytte florets fra utstrakt varmeskader, men som et alternativ, kan de fjernes etter emasculation ved hjelp av fjær saks for å lette pollinering, spesielt når en panicle bindende Teknikken er ansatt (Tall 2C og 2D).
Optimalisert temperatur envarighet d behandling for varmt vann behandling
Grunnlaget for emasculation gjennom varmt vann dypping er at pollen er mer følsom for varme enn den stigmatic overflate. Imidlertid kan varigheten og temperaturen på varmebehandling varierer blant Setaria arter og tiltredelser. Generelt vil en høyere temperatur til å redusere behandlingstiden eller en lavere temperaturer med lengre behandlingstiden har den samme effekt på emasculation. Det har blitt rapportert at en varmebehandling på 42 ° C i 20 min 10 eller 47 ° C i 10 min 14 gjengitt S. italica pollen ikke-levedyktige, men effektiviteten av disse behandlingene ble ikke bestemt. Vi har utviklet protokollen etter hypotesen at under en optimal temperatur og varighet av behandlingen, pollen av alle blomstene beholdt på hunn foreldre vil være ikke-levedyktig, mens stigmas vil forbli mottakelig. Imidlertid, etter å sammenligne og å analysere virkningene av flere temperaturer ogbehandlingsperioder (Tabell 1), fant vi at følsomheten til varmebehandling varierer blant blomstene beholdt på hver panicle, og dermed er det vanskelig å helt eliminere frø som følge av selv-pollinering. Vi konkluderer med at effektiviteten av fremstilling outcross avkom er størst når behandling utføres ved 48 ° C i 3-6 min i S. viridis tiltredelse A10.1.
Peak tiden av anthesis og krysspollinering
Når blomstene modnes og er i ferd med å åpne, pollenknapper er gulaktig hvit i fargen og pollen er utgytt så snart pollenknapper exsert fra blomster åtte. Pollenknapper gradvis bli brun etter pollen er utgytt som blomstene begynner å lukke. Når frigjort, er levedyktigheten til pollen ukjent. Derfor er det viktig å bruke pollen fra å åpne eller ferskt åpnede blomster på hannmoder så snart som mulig. Under våre kammerforhold (figur 1), flertallet av blomstrs av de mannlige foreldrene begynner å åpne på 10:10 og de åpnede blomster skur pollen på 10:30. Dermed er det ønskelig vinduet for å utføre pollinering 10:30-11:00. De arr forbli utenfor glumes etter blomster nære og kan være mottakelige for pollen. Dette har tidligere blitt observert og bekreftet i S. italica at stigmas er mottakelig for omtrent 48-timers post-blomst åpning av Siles et al. 6., så er det viktig å pose panicles etter varmebehandling, og etter å utføre kontrollerte kors. Som omtalt ovenfor, anbefaler vi utfører polli på både Dag 2 og dag 3 post-emasculation.
Metoder for pollinering
Vi sammenlignet effektiviteten av tre pollinering teknikker. Hvis blomster ikke er begrensende, er panicle-til-panicle pollinering den mest effektive teknikken og vil gi et høyere antall outcross avkom. Hvis blomstrende panicles er begrensende, en høyere frekvens av outcross avkom vil bli produsert når anther-til-stigma metoden brukes. Vi har fått utkrysning avkom fra begge metodene hell. Den "bindende panicles" Metoden har vært brukt i krysset S. italica seks, men vi fant denne metoden for å være den minst effektive metoden som tidsvinduet for pollen Shedding av den mannlige overordnede er kort. Videre er det mindre kontroll over pollinering og busten på S. viridis panicles kan også hindre bevegelsen av pollen på stigmatic overflaten.
Seed høsting, tørking og lagring
Etter høsting, bør frøene tørkes ved 30-33 ° C i 2 dager. Anthecium bør fjernes for GUS farging, hvis det er nødvendig. Frø bør lagres på et tørt, kjølig sted (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%) for kort tid (mindre enn to år) eller i et frø kammer (T: 4,0- 10 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%) for langtidslagring.Dårlig lagringsforhold kan resultere i lave levedyktighet priser åtte. Vi har observert at spiring rate på S. viridis A10.1 er ca 5% når sådd fire dager etter høsting, men kan økes til 90-96% etter lagring i laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%) for 110 dager etter høsting, etterfulgt av en tre-dagers stratifisering ved -80 ° C for å bryte frø dvalen. For lagdelingen ved -80 ° C, kan tørre frø plasseres i en lufttett beholder (for eksempel mikro-sentrifugerør eller mynt konvolutt i en forseglet plastpose) og holdt ved -80 ° C i 3 dager før planting. Etter 16 måneders lagring i laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21.79% ± 1,15%), kan spiring prosenter av 90-95% fortsatt oppnås. I tillegg til å bryte den uvirksom, frø kan tørkes ved 30-33 ° C i 2 dager etter høsting, og deretter gitt tre-dagers stratifisering ved -80 ° C, etterfulgt av fjerning avanthecium før planting. Etter disse behandlinger kan frøspiring hastigheter på opp til 33% kan oppnås.
Fordeler, begrensninger og mulige endringer
Her gir vi den første standardprotokoll for å utføre kors i S. viridis A10.1 ved hjelp av en varmebehandling for emasculation. I motsetning til fysisk emasculation, er denne protokollen mindre invasiv og relativt lett å etablere seg i et laboratorium. Det tar vanligvis ca 15 min å trimme en panicle og ca 15 panicles kan trimmes og krysset / person / dag. Forutsatt et gjennomsnitt på 3-5 utkrysning avkom / panicle kan gjenopprettes under optimaliserte forhold, kan totalt 45-75 utkrysning avkom bli produsert av en person på en enkelt dag. Videre kan denne teknikken bli anvendt for å passet i andre Setaria arter, skjønt andre optimaliseringer vil være sannsynlig. Dersom veksten kammer plassen er begrenset, kan plantene dyrkes i drivhus eller vekstkamrene uten en pre-daggry treatment inntil panicle framgår før de flyttes til de optimaliserte kammerforhold.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Sankalpi Warnasooriya og Amy Humboldt for kritisk lesing og redigering av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Department of Energy (DE-SC0008769) og National Science Foundation (IOS-1127017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
| Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
| Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
| Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28" | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
| Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
| metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
| Jack's 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
| Kimwipes | VWR International | 34120 | |
| Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
| Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
| 12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
| water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
| BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |
References
- Bennetzen, J. L., et al. Reference genome sequence of the model plant Setaria. Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).
- Zhang, G., et al. Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential. Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).
- Li, P., Brutnell, T. P. Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses. J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis. Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. Foxtail millet: a sequence-driven grass model system. Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).
- Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.]. Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).
- Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.). Agron. J. 27, 963-970 (1935).
- Willweber-Kishimoto, E. Interspecific relationships in the genus setaria. Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).
- Chang, L. P. Studies on flowering and hybridization technique in Setaria. Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).
- Darmency, H., Pernes, J. Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization. Weed Research. 25, 175-179 (1985).
- Sakai, S., Shin, C. Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 28-37 (1955).
- Malm, N. R., Rachie, K. O. Setaria millets: A review of the world literature S.B. , University of Nebraska, Lincoln. 513-529 (1971).
- Miyaji, Y., Samura, T. The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 1-6 (1954).
- Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.). P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).
- RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I. Indian J. Agr. Sci. , 561-571 (1933).
- Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv. Agron. J. 29, 845-853 (1937).
- Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae). Genetics. 169, 1659-1672 (2005).
