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방법 논문

한 분, Porphysomes를 사용하여 하위 한 와트 광열 종양 절제, 내장 다기능 Nanovesicles

10.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50536

⸱

2013년 9월 17일

 ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2The Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Ontario Cancer Institute, Campbell Family Institute For Cancer Research and Techna Institute, 4Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo, The State University of New York

이 논문에서

요약

우리는 이와 같은 강력한 광열 치료 에이전트 기능, 구조에 의존 형광 자기 담금질 독특한 광열 속성이 porphysomes라는 새로운 내장 다기능 nanovesicles을 개발. 우리는 고압 압출을 사용하여 porphysomes을 공식화하고 이종 이식 종양 모델에서 자신의 광열 치료 효과를 조사 하였다.

초록

우리는 최근에 본질적으로 다기능 nanovesicles로 porphysomes을 개발했다. 감광제는, α pyropheophorbide, 인지질에 접합 한 후 리포좀과 같은 구형 소포에 자기 조립. 때문에 포르피린 지질 이중층에 포르피린의 매우 높은 밀도, porphysomes 큰 멸종 계수, 구조에 의존 형광 자기 담금질, 우수한 광열 효과를 생성합니다. 우리의 제형, porphysomes 고압 압출을 사용하여 합성하고, 120 nm의 주위에, 평균 입자 크기를 표시. porphysomes의 스물 네 시간 포스트 정맥 주사, 종양의 국소 온도가 빠르게 750 mW의 (1.18 W / cm 2), 671 nm의 레이저 조사 1 분 노출에 따라 62 ° C, 30 ° C에서 증가했다. 종양의 완전한 열 절제에 이​​어, 형성 및 치유 2 주 안에, 대조군에서 종양 성장을 계속하면서 모두 정의 EN 도달 가피일반적으로 3 주 내에 차원 점. 이러한 데이터는 porphysomes가 유력한 광열 요법 (PTT) 에이전트로 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

서론

Porphysomes는 복합 이미징 및 치료 1 할 수있다 우리는 최근에 개발 된 새로운 다기능 nanovesicles 있습니다. 이들은 자기 조립 포르피린 이중층 형성되고 큰 흡광 계수 독특한 구조 종속 형광 자기 소광 결과를 생성한다 (83, 이상 000/porphysome 입자) 포르피린의 극히 높은 밀도를 포함한다. Porphysomes 좋은 생체 내 약물 동력학 및 생체 분포 특성을 가지고 : 그들은 체계적으로 투여 후 12 시간의 혈중 반감기를 전시하고, 수동적으로 24 시간 주입 후 2에서 7.5 %의 ID / g의 이종 이식 종양에 축적.

자신의 고유 한 구조와 물리 화학적 특성이 복합 영상과 영상 유도 치료를위한 porphysome 좋은 후보를합니다. 우선, 포르피린을 함유 porphysomes 종양 축적 한시 종양의 형광 이미징을위한 본질적으로 적합하다.또한, 각 포르피린 따라서, porphysomes 쉽게 PET 영상 3 등 64Cu과 같은 방사성 동위 원소로 표지 할 수있는 킬레이트 방사성 동위 원소의 안정적 사이트가 있습니다. porphysomes 또한 고유의 광 음향 이미징 및 PTT 기능을 나타낼 수 있도록 porphysome 구조가 그대로있는 경우 또한, 흡수 된 빛 에너지는 레이저 조사의 노출, 열 소모된다. 그것은 porphysomes의 정맥 주사 후 24 시간, porphysome 축적 된 종양의 레이저 조사가 급격한 온도 증가와 강한 광열 종양 절제를 유도 것으로 나타났습니다. 이 porphysomes은 금 나노 입자 (금 나노 입자)의 높은 흡광 계수 효율적인 광열 강화 것을 보여 주었다 1. 한편, 금 나노 입자 등 다른 무기 광열 에이전트와 비교, porphysomes는 그들의 유기적 인 특성으로 바이오 안전성에서 뛰어난 장점을 보여줍니다. Porphysomes는 효소 분해하고 최소한의 급성 toxicit을 유도1,000 ㎎ / ㎏ 1의 높은 정맥 투여와 마우스의 Y. 또한, 리포좀과 유사한, porphysomes의 큰 수성 코어는 수동적으로 될 수 또는 적극적으로 치료 또는 영상 에이전트와로드. 광학 특성 및 porphysomes의 생체 적합성 바이오 포토 닉 이미징 및 치료를위한 유기 나노 입자의 복합 가능성을 보여줍니다.

본 논문에서는 pyropheophorbide-지질 복합체의 합성 방법, 제조 및 고압 압출을 사용 porphysomes의 특성화 방법을 소개한다. 생쥐의 생체 PTT는 종양 porphysome 활성화 PTT의 효율성을 입증뿐만 아니라 실시 피하 이종 이식 종양 모델을 사용하여 치료.

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프로토콜

1. Pyropheophorbide 지질의 합성

  1. 04 98.7 mg의 16시 lysophophatidylcholine (1 - 팔미 토일 -2 - 히드 록시 SN-글리세; (... 청 등, Bioconj 화학, 2002, 13 -392 앞서 설명한 바와 같이 퍼시 스피루리나 해조류로부터 제조) 200 밀리몰의 pyropheophorbide 겸용 지질 : EDC - -3 - 포스 포 콜린, 벤티 극지 지질 번호 855675), EDC의 76.3 mg을, 48.7 밀리그램의 DMAP (4 (디메틸 아미노) 5 ㎖ 아 밀렌 피리딘)은 1:1 : 2 : 2 파이의 비율로 클로로포름을 안정화 : DMPA.
  2. 24 시간 동안 아르곤하에 실온에서 반응 혼합물을 교반 하였다. 40 ℃로 가열하면서 회전 증발기를 사용하여 감압 하에서 클로로포름을 증발 (파이로 SN-1 또는 SN-2 위치에 부착 됨) 파이 지질 이성질체의 혼합물을 생성한다.
  3. 1mM의 염화칼슘, 50 mM 트리스 (pH가 13), 0.5 % 트리톤 X-100 및 5 ㎎ / ㎖의 농도에서 10 %의 메탄올을 Resuspend 파이 지질 이성질체 혼합물. 꿀벌의 독에서에서 포스 포 리파제 A2 (PLA2)를 추가0.1 ㎎ / ㎖의 농도와 SN-1 파이로 지질을 소화하고 순수한 SN-2 파이 지질 이성질체를 생산하기 위해 24 시간 동안 37 ° C에서 솔루션을 품어.
  4. 추가 클로로포름 2 볼륨과 메탄올 추출물의 1.25 볼륨을 추가 한 다음 40 ℃에서 감압하에 회전 증발을 사용하여 용매를 제거 DCM 중의 1 % 메탄올로 분열 생성물을 재현 탁하고 순수한 이성질체 파이 지질위한 작은 디올 실리카 컬럼상에서 정제.

2. Porphysomes의 준비

  1. pyropheophorbide 지질, 디스 테아-SN-글리세로 -3 - phosphoethanolamine-N-메 톡시 (폴리에틸렌 글리콜) (PEG-2000-PE) 및 클로로포름 콜레스테롤 별도로 녹여 각각 농도를 기록한다.
  2. 65 몰 % 포르피린 지질, 5 몰 %의 PEG-2000-PE 및 30 몰 % 콜레스테롤을 결합하여 5 ㎎ / 튜브의 전체 지질 중량 12x75 mm 보로 실리케이트 시험관 porphysome 지질 필름을 준비한다.
  3. 니트로 스트림하에 지질 필름 건조겐 가스 및이를 추가 1 시간 동안 진공하에 건조시킨. 미래의 수화 및 압출까지 아르곤하에 -20 ° C에서 지질 필름을 보관합니다.
  4. 각 지질 필름 튜브에 1 ㎖의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS, 150 mM의 NaCl을, 10 mM의 인산, 산도 7.4)를 추가합니다. 완전히 고정 될 때까지 액체 질소에 테스트 튜브를 동결하고, 샘플이 모두 녹을 때까지 65 ° C의 물을 욕조에 튜브를 해동. 소용돌이 30 초 총 (각 소용돌이로 교반 사이에 65 ° C의 물을 욕조에 5 초 다시 가열 10 초 각의 3 배)를위한 관.
  5. 더 큰 집계 수화 용액에서 관찰 할 수있을 때까지 필요한시 5 사이클 이상 동결 융해를 반복합니다. 완료되면 얼음에 porphysome 서스펜션을 남겨주세요.
  6. 수욕 순환 65 ° C에 대한 항온 큐레이터로 thermobarrel 압출기 연결 인치 설치이 누적 100 nm의 폴리 카보네이트 필터를 고압 압출기 (10 ml)에 조립 고압 동안 질소 탱크로 압출기 시스템을 연결확인 공급.
  7. 9 인치 유리 전송 피펫을 사용하여 압출기 챔버에 porphysome 현탁액을 전송합니다. 200, 300 PSIG 사이에 독서가 초기 압출 압력이 관찰 될 때까지 질소 탱크 레귤레이터 다이얼을 돌려 압력을 설정합니다. 충분한 porphysome 유량이 달성되고, 압력 800 PSIG (5,440 kPa의)의 최대에 도달 할 때까지 서서히 압력 조정기의 밸브를 연다.
  8. 제 압출 통과가 완료되면, 압력 조절 밸브를 닫고 압출기 상부에 압력 릴리프 밸브를 개방함으로써 압출기의 압력을 해제. 갓 압출 porphysome 용액 압출기 리필 및 최종 압출 된 용액은 균질 보장하기 위해 적어도 10 회 압출을 반복한다.
  9. UV-VIS 분광계 메탄올 중 희석 된 샘플의 흡수를 측정하여 최종 porphysome 용액의 농도를 결정. 다음 식의 재치를 사용하여 농도를 계산H 97,000 M의 흡광 계수 -1 cm -1 pyropheophorbide 지질 410 nm에서.

figure-protocol-1

  1. 동적 광산란에 의해 맬버른 제타 ZS90을 사용 porphysomes의 최종 크기 분포를 측정한다. PBS에 porphysome 솔루션을 희석하고 평균 결과 15 실행 각각 세 가지 측정을 수행합니다.
  2. 분광을 이용하여 (1 % 트리톤 X-100의 1 ㎜) 형광 담금질 porphysome의 방출 (PBS에 1 ㎜)과 unquenched porphysome을 비교하여 porphysome의 형광 담금질을 결정합니다. (Tirton X-100) 추가되기 전에 세제 후 스펙트럼을 가지고, 최대 형광을 읽고 신호를 정상화. 410 nm의 및 600 ~ 800 nm의 수에 발광 파장 범위로 여기를 설정합니다.
  3. 나중에 사용할 때까지 4 ° C에서 아르곤 하에서 por​​physomes 솔루션을 유지하고, 알루미늄 F에 의해 빛으로부터 보호오일.

3. 동물 이종 이식 모델의 제조

  1. 문화 KB의 RPMI-1640 세포 (10 % FBS)와, 37 ℃에서 5 % CO 2와 습기를 대기에있는 세포를 유지
  2. 표준 세포 배양 기술을 이용하여 수확 KB 세포. 주입 시간이 될 때까지 단기 저장을위한 얼음에 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 세포 현탁액 (20,000 세포 / ㎖)를 유지한다.
  3. 누드 마우스에 KB 이종 이식을 준비합니다. 표준식이 요법과 침구 (할렌 연구소 주어진; 다이어트 : 그들은 (NU (NCR) Foxn1의 뉴 6-7 주령 종류 번호의 CRL) : 20g 때 누드 마우스는 찰스 리버 연구소에서 구입 한 조사 (照射) LM-485, # 7912; 침구 : 옥수수 침구, ¼ ", # 7097). 모든 동물 처리 도구 (주사기, 포셉, 동물 패드) 이전의 실험에 소독. 100 % 산소 캐리어 가스의 2 % 이소 플루 란의 V / V를 가진 마우스를 마취. 모든 동물 프로토콜은 기관 (대학 보건 느에 의해 승인twork이 경우) 동물 관리 및 사용위원회.
  4. 마우스의 오른쪽 측면에 PBS의 피하에 현탁 종양 세포를 주입한다. 마우스는 종양이 4~5mm 2 ~ 3 ㎜의 두께의 직경에 도달하면 10 일 이후 사용할 준비가 된 것입니다.

4. 생체 광열 치료

  1. 정맥 꼬리 정맥을 통해 (200 μL 볼륨에서 750 nmol의의 파이를 포함) porphysomes를 주입. porphysomes의 레이저 조사 24 시간 후 분사를 실시한다.
  2. 이 섹션에서는 밀폐 된 레이저 안전 방에 모든 절차를 실시하고 있습니다. 레이저 조사시 레이저 안전 고글을 착용 할 것.
  3. 레이저 조사 장치를 설정합니다. 스탠드에 클램프에 의한 레이저 섬유와 확산을 잡아. 낮은 수준의 레이저 파워를 설정하고 레이저의 전원을 켭니다. (DPSS 레이저, LaserGlow 테크놀로지스, 캐나다 토론토)는, AP를 사용하여 750 mW의 (1.18 W / cm 2)에 레이저 파워를 교정 직경 9mm의 조사 영역을 달성하기 위해, 레이저 섬유의 높이를 조정된 ower 다음 미터와는 동물을 준비하기 위해 레이저를 끄십시오.
  4. 코 콘을 통해 100 % 산소 캐리어 가스의 2 % 이소 플루 란의 v / V를 사용하여 동물을 마취 없음) 이소 플루 란 인간의 건강에 위험 위험 분명 청소. 없습니다 동물이 동물의 뒷발에 포셉 또는 손가락으로 발가락 핀치를 수행하여 깊은 충분히 마취되어 있는지 확인합니다. 그들이이 절차에 응답하지 않는 경우 동물은 레이저 조사에 대한 준비가되어 있습니다.
  5. 적외선 열 화상 카메라 (Mikroshot, LUMASENSE 기술)에 의해 종양의 온도를 모니터링합니다. 잘 집중하고 사전 PTT 이미지뿐만 아니라 PTT 조사가 시작되기 전에 일반 백색광 이미지를 가지고, 가까운 종양에 카메라를 놓습니다.
  6. 다시 레이저를 켜고, 750 mW의에 가벼운 힘을 증가시킨다. 종양이 완전히 덮여 얻을 수있는 레이저 빔의 중앙에있는 종양을 놓고 조사를 시작 타이밍. 1 분의 레이저 치료에 대한 종양의 온도 이미지마다 5 초를 가져 가라. 1 분에 레이저를 끄십시오. 세인트영업 이익은 2 % 이소 플루 란 (isoflurane)의 가스 공급은 마취에서 동물이 회복 될 때까지 기다렸다가 다시 케이지에 넣어.
  7. 대학 건강 네트워크의 승인을 동물의 프로토콜에 따라 12:12 시간 명암주기에 따라 normothermia 동물 룸에서 마우스를 유지합니다. 프레 놀핀 (0.05 ㎎ / kg, 상처로 인한 통증을 감소시키는, 레이저 조사는 다음의 주간 피하 하루에 두 번 주입한다. 이틀마다, 캘리퍼를 사용하여 종양 직경을 측정하고 사진을 가지고. 이용하여 종양 부피를 계산 다음 식 : V = π / 6 · · 긴 직경이고, B는 짧은 하나입니다 B 2.
  8. 우리의 실험실에서 정의 된 엔드 포인트로 종양의 긴 직경이 10mm에 도달하면 CO 2 챔버를 넣어 동물을 제물로 바친다. CO2 처리 다음과 같은 자궁 경부 전위를 수행합니다. 생존 곡선을 그린다.

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결과

Pyropheophorbide은 안정한 지질 단량체 (도 1A)으로 인지질에 접합 및 접합체의 고압 압출기를 사용하여 막 압출 법에 의해 porphysomes를 형성하는 자기 - 조립된다. 그것은 상대적으로 느린 유속 압출 제 3 사이클 동안 porphysome 지질 현탁액을 압출하는 것이 곤란하다. 더 돌출이 반복되는 바와 같이, 압출 된 용액의 유속은 점차 증가하고, 필요할 경우 압력은 다소 감소 될 수있다. Porphysome 크기, 농도, 담금질 효율성 바로 압출 후 나노 입자의 특징을 세 가지 중요한 속성입니다. 크기 분포의 높은 동질성 (120 nm의 주위에 피크)와 Porphysomes가 생성됩니다 (그림 1 B와 1 C)의 두 가지 주요 흡수 피크 (410 nm의 677 nm의, 그림 1D) 및 4에 저장되는 12 개월 이상 안정적으로 유지 할 수있는 ° C. 포르피린의 형광 w 99.8 %의 높은으로 급랭암탉 나노 구조 ...

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토론

높은 약물 탑재량을 유지하면서도 약물 전달 기술의 발전으로, 다 기능성 나노 입자는 약물 전달체의 정확한 트래킹 넓은 조사 중이다. 포르피린로드 리포솜 나은 약동학 성질 및 포르피린 직접 투여보다 효율적인 전달을 위해 개발되었지만, 장애물 포르피린 제한 담지량 및 혈장 단백질 5,6 행 리포좀에서 포르피린 급속한 재분배 포함하여 존재한다. 자유 포르피린은 리포솜의 코어 또는 지질 이중층 하나에 삽입되는 종래의 리포좀 전달 시스템과 대조적으로, pyropheophorbide는 (파이로) 이제 직접 안정적 인지질과 자기 조립 porphysomes을 형성하도록 리포좀 같은 나노 구조로에 접합 . 결과적으로, porphysome 이중층은 파이 fluore의 구조 의존성자가 소광 리드 매우 높은 포르피린 패킹 밀도를 달성scence 높은 흡광 계수.

이 파이 지질 복합체는 일반적으로 잘 정의 된 크기 7-9의 단일 층 소포를 생성하는 데 사용되는...

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공개 사항

우리는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

이 작품은 전립선 암 연구의 마가렛 공주 병원 재단, 국립 과학 및 캐나다 건강 연구, 혁신의 캐나다 재단에 대한 캐나다 연구소의 공학 연구 협의회, 그리고 조이와 토비 타넨 바움 / 브라질 공 의자,에 의해 지원되었다 SUNY 연구 재단과 버팔로 대학에서 시작 지원을 부여합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
회전 증발기Thermo-SavantSPD131DDA
VotexScientific IndustriesSI-0236모델 번호: G560
고압 압출기LIPEX, Northern Lipids Inc.T.00110 ml Thermobarrel Extruder
가열식 수조 순환기(온도 조절 순환기)Thermo SCIENTIFICSC100-S5P
폴리카보네이트 필터 Avanti 극성 지질610005공극 크기 100nm, 멤브레인 직경 19mm
ZetasizerMalvern InstrumentsZS90
UV/가시광 분광광도계Varian Korea캐리 50 바이오 UV / 가시 광선 분광 광도계
HORIBA 과학FluoroMax-4
투과 전자 현미경 (TEM)히타치H-7000
세포 배양 인큐베이터SANYOMCO-18AIC
파워 미터ThorlabsPM100D센서 S142C
671nm 레이저레이저 글로우 기술LRS-0671_PFN-02000-05S/N:10097270
적외선 온도계Mikroshot, LUMASENSE Technologies9102409
레이저 보호 눈 고글LaserGlow TechnologiesAGF6602XX광학 밀도: 630-700nm에서 1.5+

참고문헌

  1. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10, 324-332 (2011).
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  3. Liu, T. W., MacDonald, T. D., Shi, J., Wilson, B. C., Zheng, G. Intrinsically Copper-64-Labeled Organic Nanoparticles as Radiotracers. Angewandte Chemie. , (2012).
  4. Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjug Chem. 13, 392-396 (2002).
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  6. Jin, C. S., Zheng, G. Liposomal nanostructures for photosensitizer delivery. Lasers Surg Med. 43, 734-748 (2011).
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