Une minute, Photothermal Tumor Ablation-un-Watt Sous Utilisation porphysomes, intrinsèque multifonctions nanovésicules

Summary

Nous avons développé de nouveaux nanovésicules multifonctionnels appelés porphysomes intrinsèques, qui ont une structure dépendante fluorescence à auto-extinction et de propriétés uniques photothermiques, fonctionnant ainsi comme de puissants agents de thérapie photothermique. Nous avons formulé porphysomes utilisant extrusion à haute pression et étudié leur efficacité de la thérapie photothermique dans un modèle de xénogreffe de tumeur.

Abstract

Nous avons récemment développé porphysomes comme nanovésicules intrinsèquement multifonctionnels. Un photosensibilisateur, pyropheophorbide α, a été conjugué à un phospholipide et l'auto-assemblage de vésicules sphériques liposomes comme. En raison de la très forte densité de porphyrine dans la bicouche lipidique de porphyrine, porphysomes générées grands coefficients d'extinction, de la structure dépendante de la fluorescence à auto-extinction, et une excellente efficacité photothermique. Dans notre formulation, porphysomes ont été synthétisés en utilisant l'extrusion à haute pression, et présentaient une taille moyenne de particules d'environ 120 nm. Injection de vingt-quatre heures après la intraveineuse de porphysomes, la température locale de la tumeur a augmenté de 30 ° C à 62 ° C rapidement lors d'une exposition d'une minute de 750 mW (1,18 W / cm ^2), 671 nm irradiation laser. Suite à l'ablation thermique complète de la tumeur, escarres formé et guéri en 2 semaines, alors que dans les groupes de contrôle les tumeurs ont continué à croître et à tous atteint le défini enpoint de d dans les 3 semaines. Ces données montrent comment porphysomes peuvent être utilisés comme thérapie photothermique puissant (PTT) des agents.

Introduction

Porphysomes sont de nouveaux nanovésicules multifonctions que nous avons récemment développées qui sont capables de l'imagerie et la thérapie ¹ multimodal. Ils sont formés à partir des bicouches de porphyrine auto-assemblées et contiennent une densité extrêmement élevée de la porphyrine (plus de 83, 000/porphysome particules), qui génère des résultats et le coefficient de fluorescence à auto-extinction de la structure dépendante unique de grande extinction. Porphysomes ont de bonnes vivo pharmacocinétiques et de biodistribution propriétés dans: ils présentent une demi-vie dans le sang de 12 h après l'administration systématique et passivement s'accumulent dans les tumeurs de xénogreffe de 7,5% ID / g à 24 h post-injection ^2.

Leur structure unique et propriétés physico-chimiques font porphysome un bon candidat pour l'imagerie multimodale et la thérapie guidée par l'image. Tout d'abord, contenant la porphyrine, porphysomes sont intrinsèquement apte à l'imagerie de fluorescence des tumeurs lors de l'accumulation ^d'une tumeur.En outre, chaque porphyrine comporte un site de radio-isotopes stables de chelation, par conséquent, peuvent être facilement porphysomes marquées avec des radio-isotopes tels que le 64Cu pour l'imagerie PET ^3. En outre, l'énergie de la lumière absorbée est dissipée thermiquement sous laser exposition d'irradiation lors porphysome structure est intacte, de sorte porphysomes présentent également l'imagerie photo-acoustique unique et capacités PTT. Il a été montré que 24 h après l'injection intraveineuse de porphysomes, l'irradiation laser de la tumeur au-porphysome accumulé induit une augmentation rapide de la température et de l'ablation de la tumeur photothermique forte. Cela démontre que porphysomes sont efficaces exhausteurs de photothermique avec coefficient d'extinction aussi élevé que les nanoparticules d'or (AuNPs) ^1. D'autre part, en comparaison avec d'autres agents photothermiques inorganiques, y compris AuNPs, porphysomes montrent un avantage exceptionnel en matière de biosécurité en raison de leur nature organique. Porphysomes sont enzymatique biodégradable et induisent toxicit aigu minimaly chez la souris avec des doses intraveineuses allant jusqu'à 1000 mg / kg ^1. En outre, même à des liposomes, la grande base aqueuse de porphysomes pourrait être passivement ou activement chargé avec des agents thérapeutiques ou d'imagerie. Les propriétés optiques et de la biocompatibilité des porphysomes démontrent le potentiel multimodal de nanoparticules organiques pour l'imagerie et la thérapie biophotonique.

Dans cet article, nous présentons la méthode de synthèse de conjugués pyropheophorbide-lipidique, la fabrication et la méthode de caractérisation de porphysomes utilisant extrusion à haute pression. In vivo PTT sur des souris est effectuée ainsi à démontrer l'efficacité de porphysome activé PTT dans la tumeur traitement à l'aide d'un modèle de tumeur de xénogreffe sous-cutanée.

Protocol

Une. Synthèse du lipide-Pyropheophorbide

1. Moissonneuse 200 mmol pyropheophorbide (préparé à partir d'algues Spirulina Pacifica, comme décrit précédemment,... Zheng et al, Bioconj Chem, 2002, 13 -392) ^4, 98,7 mg 16:00 lysophophatidylcholine (1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycéro -3-phosphocholine, Avanti Polar Lipids # 855675), 76,3 mg d'EDC, 48,7 mg de DMAP (4 - (diméthylamino) pyridine) dans 5 ml amylène stabilisé chloroforme pour un ratio de 1:1:2:2 Pyro: lipides: EDC : DMPA.
2. On agite le mélange réactionnel à la température ambiante sous argon pendant 24 heures. On évapore le chloroforme sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif avec un chauffage à 40 ° C. Le mélange d'isomères de pyro-lipide (pyro attachés à la position sn-1 ou sn-2) est produite.
3. mélange d'isomères de pyro-lipide Remettre en suspension dans du _CaCl2 1 mM, Tris 50 mM (pH 8), 0,5% de Triton X-100 et 10% de méthanol à la concentration de 5 mg / ml. Ajouter phospholipase A2 (PLA2) de venin d'abeille à0,1 mg / ml et la concentration de la solution incuber à 37 ° C pendant 24 heures pour digérer sn-1 et pyro-lipides pour produire le sn-2 pyro-lipide isomère pur.
4. Ajouter 2 volumes supplémentaires de chloroforme et 1,25 volumes de méthanol, de l'extrait, puis éliminer le solvant en utilisant un évaporateur rotatif sous pression réduite à 40 ° C. Remettre en suspension le produit de clivage dans 1% de MeOH dans du DCM et on purifie sur une colonne de silice de faible diol pour la pyro-lipide isomère pur.

2. Préparation de porphysomes

1. Dissoudre pyropheophorbide-lipide, distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-méthoxy (polyéthylène glycol) (PEG-2000-PE) et le taux de cholestérol dans du chloroforme séparément, et l'enregistrement des concentrations respectivement.
2. Préparer porphysome film lipidique dans un tube à essai de borosilicate de 12x75 mm avec un poids total en lipides de 5 mg / tuyau en combinant 65% molaire lipide-porphyrine, 5% en moles de PEG-2000-PE et 30% molaire de cholestérol.
3. Sécher les films lipidiques sous un courant d'nitrogaz gen et laissez-les encore séchés sous vide pendant 1 heure. Stocker les films lipidiques à -20 ° C sous atmosphère d'argon jusqu'à ce que l'hydratation et l'extrusion ultérieure.
4. Ajouter 1 ml de solution saline de phosphate tamponnée (PBS, NaCl 150 mM, phosphate 10 mM, pH 7,4) à chaque tube de film lipidique. Congeler le tube à essai dans l'azote liquide jusqu'à ce que complètement gelé, dégeler le tube 65 ° C bain d'eau jusqu'à ce que l'échantillon a tous fondu. Vortexer le tube pendant un total de 30 sec (3 x 10 sec à chacune, avec 5 secondes de réchauffage à 65 ° C bain d'eau entre chaque vortex).
5. Répétez le gel-dégel pendant 5 cycles ou plus sur nécessaire jusqu'à ce qu'il n'y grands agrégats peuvent être observées dans la solution hydratée. Laisser la suspension de porphysome sur la glace lorsque vous avez terminé.
6. Assembler l'extrudeuse à haute pression (10 ml) avec deux empilés 100 filtres nm en polycarbonate installés po Connect l'extrudeuse de thermobarrel à un circulateur thermostaté 65 ° C bain à circulation d'eau, et connecter le système de l'extrudeuse à un réservoir d'azote pour haute pressionque l'alimentation.
7. Transférer la suspension de porphysome à la chambre de l'extrudeuse en utilisant une pipette de transfert en verre de 9 pouces. Régler la pression en tournant la molette du régulateur de réservoir d'azote jusqu'à obtenir une lecture entre 200 et 300 psig on observe que la pression d'extrusion initiale. Ouvrir la vanne du régulateur de pression graduellement jusqu'à ce que le débit d'porphysome suffisant est atteint, soit un maximum de 800 psig (5440 kPa) de pression est atteinte.
8. Après le premier passage d'extrusion est terminée, fermer la soupape de commande de pression et de libérer la pression de l'extrudeuse par l'ouverture de la soupape de décharge de pression sur la partie supérieure de l'extrudeuse. Remplir l'extrudeuse avec la solution de porphysome fraîchement extrudée, et répéter l'extrusion d'au moins 10 fois pour s'assurer que la solution finale est extrudé homogène.
9. Déterminer la concentration de la solution finale de porphysome en mesurant l'absorption d'un échantillon dilué dans du méthanol par spectromètre UV-Vis. Calculer la concentration en utilisant l'esprit de l'équation suivanteh le coefficient d'extinction de 97000 M ^-1 cm ^-1 à 410 nm pour pyropheophorbide-lipide.

10. Mesurer la distribution de la taille finale du porphysomes utilisant un Malvern Zetasizer ZS90 par diffusion de lumière dynamique. Diluer la solution de porphysome dans du PBS et effectuer trois mesures avec 15 points chacun pour les moyennes des résultats.
11. Déterminer l'extinction de fluorescence de porphysome en comparant l'émission de fluorescence de porphysome trempé (1 mM dans du PBS) et porphysome non éteint (1 mM dans 1% de Triton X-100) en utilisant Spectrofluorometer. Prendre les spectres avant et après le détergent (Tirton X-100) est ajouté, et à normaliser le signal de lecture de la fluorescence maximale. Régler l'excitation à 410 nm, et l'émission de longueur d'onde de 600-800 nm être.
12. Conserver la solution de porphysomes sous argon à 4 ° C jusqu'à leur utilisation future, et protéger de la lumière par l'aluminium fhuile.

3. Préparation des animaux modèle de xénogreffe

1. Culture des cellules KB en RPMI-1640 (avec 10% de FBS), et maintenir les cellules dans 5% de CO ₂ et de l'atmosphère hydratée à 37 ° C.
2. Cellules récolte KB utilisant la technique de culture cellulaire standard. Gardez la suspension cellulaire (20 000 cellules / ml) dans un tampon phosphate salin (PBS) sur la glace pour le stockage à court terme jusqu'à ce moment de l'injection.
3. Préparer un KB xénogreffes sur souris nude. Souris nude sont achetés auprès de Charles River Laboratories quand ils sont 20 g (Catégorie # Crl: NU (RCN)-Foxn1 ^nu, 6-7 semaines-vieux), compte tenu de régime standard et la literie (Harlan Laboratories; Régime alimentaire: irradiés LM-485, # 7912; Literie: literie Corn ¼ ", # 7097). Stériliser tous les outils de manipulation des animaux (seringues, des pinces, et pad animale) avant les expériences. Anesthésier les souris avec 2% d'isoflurane v / v dans 100% gaz porteur d'oxygène. Tous les protocoles d'animaux sont approuvés par l'institution (University Health Network dans ce cas) le soin des animaux et l'utilisation comité.
4. Injecter les cellules tumorales en suspension dans du PBS par voie sous cutanée à la flanc droit de souris. Les souris sont prêtes à être utilisées après 10 jours lorsque la tumeur atteint un diamètre de 4-5 mm et une épaisseur de 3.2 mm.

4. In vivo thérapie photothermique

1. Injecter porphysomes (contenant 750 nmol pyro à 200 volume de pi) par voie intraveineuse via la veine caudale. Effectuer irradiation laser 24 h post-injection de porphysomes.
2. Dans cette section, mener toutes les procédures dans une salle de sécurité laser clos. Porter des lunettes de sécurité laser lors de l'irradiation laser.
3. Mettre en place l'équipement d'irradiation laser. Maintenir la fibre de laser et d'un diffuseur par une pince sur un support. Réglez la puissance du laser à faible niveau et activer le laser. Réglez la hauteur de la fibre laser pour atteindre une zone d'irradiation de 9 mm de diamètre (DPSS Laser, LaserGlow Technologies, Toronto, Canada), de calibrer la puissance du laser à 750 mW (1,18 W / cm ²⁾ à l'aide apeur mètres puis éteindre le laser à préparer les animaux.
4. Anesthésier les animaux avec 2% d'isoflurane v / v dans 100% gaz porteur d'oxygène par le nez cône pas évident de balayage de l'isoflurane, un danger de risque pour la santé humaine). Assurez-vous que l'animal est anesthésié assez profond en effectuant une pincée de pied avec des pinces ou des doigts à pattes arrière de l'animal. Les animaux sont prêts pour l'irradiation laser quand ils ne répondent pas à cette procédure.
5. Surveiller la température de la tumeur par une caméra infrarouge thermique (Mikroshot, LumaSense Technologies). Placez l'appareil à proximité de la tumeur, se concentrer bien et prendre une image pré PTT ainsi que d'une image en lumière blanche régulière avant PTT irradiation commence.
6. Allumez le laser de nouveau, et d'augmenter la puissance lumineuse de 750 mW. Placez la tumeur dans le centre d'un faisceau laser pour obtenir la tumeur entièrement couvert, et commencer à chronométrer l'irradiation. Prendre l'image de la température de la tumeur toutes les 5 s pour un traitement au laser d'une minute. Éteignez le laser à 1 min. Stop l'alimentation en gaz de 2% d'isoflurane, attendez jusqu'à ce que l'animal se de l'anesthésie et le remettre à la cage.
7. Gardez la souris à l'animalerie de la normothermie sous 12h12 h cycle d'obscurité et de la lumière selon des protocoles animales approuvées par l'University Health Network. Injecter buprénorphine (0,05 mg / kg, voie sous-cutanée deux fois par jour pendant une semaine après l'irradiation laser pour réduire la douleur causée par la cicatrice. Tous les deux jours, mesurer le diamètre de la tumeur à l'aide d'un pied et prendre une photo. Calculer le volume de la tumeur à l'aide du l'équation suivante: V = π / 6 · une · b ^2, où a est le grand diamètre, et b le court.
8. Sacrifier les animaux en les mettant en CO ₂ quand la chambre de grand diamètre de la tumeur atteint 10 mm, car il est le point final défini dans notre laboratoire. Effectuer dislocation cervicale après le traitement du CO2. Tracer la courbe de survie.

Representative Results

Pyropheophorbide est conjugué au phospholipide en tant que monomère de lipide stable (figure 1a) et la conjugués s'auto-assembler pour former porphysomes par la méthode d'extrusion de la membrane en utilisant une extrudeuse haute pression. Il est généralement difficile à extruder suspension porphysome-lipides pendant les trois premiers cycles de l'extrusion à débit relativement lent. Comme de plus les extrusions sont répétées, le taux de solution extrudée d'écoulement augmente progressivement, et la pression peut être légèrement réduite si nécessaire. Taille Porphysome, la concentration et l'efficacité de trempe sont trois propriétés importantes pour caractériser les nanoparticules juste après extrusion. Porphysomes avec une grande homogénéité de la distribution de taille (pic vers 120 nm) est généré (figures 1 b et 1c) avec deux principaux pics d'absorbance (410 nm et 677 nm, figure 1D) et peut rester stable pendant plus de 12 mois lorsqu'il est conservé à 4 ° C. La fluorescence de la porphyrine est trempé aussi élevé que 99,8% wpoule la nanostructure est intact (figure 1e).

Pour in vivo PTT, la chaleur peut être généré rapidement sur ​​l'irradiation laser à 24 h après l'administration du porphysome (Figure 2). Porphysomes avec irradiation laser provoquent la température pour augmenter de plus de 35 ° C après 1 minute d'irradiation, tandis que le laser seul induit une augmentation de la température inférieure à 10 ° C. Il est important que la température finale de la tumeur atteigne 55 ° C pour assurer une ablation complète de la tumeur. À la suite de l'irradiation PTT, la tumeur s'avère généralement blanchâtre en raison de l'effet thermique puissant. La jambe de la souris devient un peu gonflé dans la zone de la tumeur pendant environ 2 jours après PTT. Résultats d'ablation thermique dans escarre brun foncé sur les tumeurs et la réduction du volume tumoral de 100%. Escarres peuvent être observés toute évidence à 24 h post-traitement et ils récupèrent progressivement au cours des deux semaines suivantes (figure 3a). Utilisation porphysomes, tu sous-cutanéemors peuvent être complètement éliminés sans récidive (Figure 3b), tandis que les tumeurs dans porphysome seul et contrôle laser seul continuent de croître (Figure 3b), et tous atteignent le point de fin dans deux semaines.

Figure 1. Structure de nanovésicules de porphysome et caractérisations. une. Représentation schématique d'un porphysome. B pyropheophorbide-lipidique. Image MET correspondant. c. distribution de la taille des porphysomes après extrusion à haute pression. d. L'absorbance de la pyropheophorbide-lipide dans du methanol, normalisée pour le pic à 410 nm. E. l'émission de fluorescence (em) de trempe (ligne pointillée rouge) et inassouvie (trait plein bleu) porphysomes, normalisée à fluorescence maximale. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. Réponse thermique pendant PTT. Une. laser mis en place pour l'irradiation de lumière transdermique. b et c. . Température de la tumeur lors d'une irradiation au laser dans les souris portant une tumeur KB à 24 h post-injection de porphysomes ou PBS d, la température de la tumeur maximum pendant 60 sec irradiation laser (moyenne + / - écart-type de cinq souris dans chaque groupe). Cliquer ici pour agrandir la figure .

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Figure 3. une. Des photographies montrant la réponse thérapeutique à ^une PTT, comprenant trois groupes: porphysomes injection avec un rayonnement laser, l'injection de PBS avec une irradiation laser, et porphysomes injection seul. b. Le volume moyen de la tumeur après chaque traitement (n = 5, * représente p <0,0005). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

Dans le développement des technologies de délivrance de médicaments, des nanoparticules multifonctionnelles sont actuellement en cours de larges investigations pour un suivi précis du véhicule de délivrance de médicament, tout en maintenant une charge de médicament élevée. liposomes de porphyrines chargé ont été développés pour de meilleures propriétés pharmacocinétiques et une prestation plus efficace que l'administration directe de la porphyrine, mais des obstacles existent, y compris le montant de chargement restreinte de porphyrine et la redistribution rapide de la porphyrine de liposomes aux protéines plasmatiques ^5,6. Contrairement aux systèmes de délivrance de liposomes conventionnels, où la porphyrine libre sont insérés soit dans le noyau ou un lipide bicouche du liposome, pyropheophorbide (pyro) est maintenant directement et de façon stable conjugué au phospholipide et de s'auto-assembler en nanostructures de liposomes-like pour former porphysomes . En conséquence, la bicouche porphysome réalise densité de tassement de la porphyrine extrêmement élevée, ce qui conduit à une structure dépendante auto-extinction de pyro fluorescence et le coefficient d'extinction élevé.

Ces conjugués pyro-lipide s'auto-assembler en porphysomes dans un tampon aqueux par l'intermédiaire de la méthode de préparation similaire de liposomes, tels que la méthode d'extrusion de la membrane qui est couramment utilisés pour générer des vésicules unilamellaires de taille bien définie ^7-9. L'extrusion commence à partir d'un film lipidique sec qui est hydraté dans la solution aqueuse et soumis à plusieurs cycles de congélation-décongélation pour former des vésicules multilamellaires avec une large distribution de la taille ^10. Lorsque le film lipidique de porphysome hydratée atteint plus de 1 mg / ml, d'extrusion manuelle devient difficile physiquement, de sorte que l'extrusion à haute pression est choisi pour la production à l'échelle vers le haut de porphysomes, comme pour les études animales lorsque au moins 5 mg / ml de porphysome est requis ^{8 , 9.} Pour atteindre une concentration encore plus élevée de pyro finale, porphysome de film lipidique peut être préparé avec une quantité initiale plus élevée. Mais concentration supérieure à 10 mg / ml n'est pas recommandé, en raison de la difficulté d'extrusion avec le 10 ml haute pression extrudeuse. Au cours de l'extrusion, si le taux de la solution extrudée sortant de débit est extrêmement lente (par exemple 30 min / ml), même à très haute pression (≤ 800 kPa pour les question de sécurité), le filtre peut être changé pour un nouveau jeu, et le température de l'eau de recirculation peut être augmentée de 65 ° C-75 ° C. Homogénéité de taille des liposomes nanovésicules a été montré pour aider à diminuer le foie et la rate l'absorption in vivo ^11. Par conséquent, pour obtenir une distribution de taille homogène et étroite, l'extrusion de porphysome suspension de lipides à travers la membrane de filtre (100 nm) est répétée au moins dix fois ou même plus.

Nous avons trouvé porphysomes sont très stables après extrusion quand stockés à 4 ° C, avec changement de taille négligeable ou trempe propriétés à au moins un an dans nos études (données non présentées). Il est toujours recommandé de tester la taille de porphysome et l'efficacité de trempe avant chaque injection animalepour assurer porphysome intact.

Porphysomes sont les premières nanoparticules organiques pour servir en tant que renforçateurs de photothermiques efficaces, tout en maintenant la capacité de libération de médicament et la biocompatibilité des liposomes classiques. Ils sont basés sur les porphyrines, qui ont un excellent dossier pour les applications de théranostic ^12. Ils ont une grande extinction coefficient comparatif de nanoparticules d'or (PNB) pour la production de chaleur rapide et efficace ablation thermique ^1. Les études in vivo ont montré les avantages de porphysome activé PTT comme une méthode alternative au traitement conventionnel du cancer. PTT est très simple, avec un traitement au laser relativement localisée à la zone d'irradiation choisie (diamètre 9 mm), et la période de traitement très court (1 min) nécessaire pour atteindre une température supérieure à 55 ° C de la tumeur pour l'ablation thermique efficace. La simplicité et une grande sélectivité peuvent aider à améliorer le temps de récupération et de réduire le risque de complications for traductionnelles des applications thérapeutiques. Si d'autres types de xénogreffe ayant accumulation de tumeur de moins de tumeur KB (7.5% ID / g) est utilisé, la dose de porphysome plus élevée peut être injecté IV efficace pour la génération de chaleur lors d'une irradiation par laser. Pendant le processus d'irradiation, il est important que spot laser couvre la zone de la tumeur entière, et la température de la tumeur est augmentée à 55 ° C ou plus pour l'ablation thermique rapide et complet à des tumeurs.

Des études sont actuellement en cours pour explorer la imagerie multimodale et les applications thérapeutiques de porphysomes comme de puissants agents des PTT dans les modèles plus cliniquement pertinente des animaux pour la future étude translationnelle.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotary evaporator	Thermo-Savant	SPD131DDA
Votex	Scientific Industries	SI-0236	Model number: G560
High pressure extruder	LIPEX, Northern Lipids Inc.	T.001	10 ml Thermobarrel Extruder
Heated bath circulators (Thermostatted circulator)	Thermo SCIENTIFIC	SC100-S5P
Polycarbonate filters	Avanti Polar Lipids	610005	Pore size 100 nm, and membrane diameter 19 mm
Zetasizer	Malvern Instruments	ZS90
UV/Visible Spectrophototmeter	Varian Australia	Cary 50 Bio UV/ Visible Spectrophotometer
Spectrofluorometer	HORIBA Scientific	FluoroMax-4
Transmission Electron Microscopy (TEM)	Hitachi	H-7000
Cell culture incubator	SANYO	MCO-18AIC
Powermeter	Thorlabs	PM100D	with sensor S142C
671nm Laser	LaserGlow Technologies	LRS-0671_PFN-02000-05	S/N:10097270
Infrared Thermometer	Mikroshot, LUMASENSE Technologies	9102409
Laser protective eye goggles	LaserGlow Technologies	AGF6602XX	Optical Density: 1.5+ at 630-700 nm