Summary
そこで我々は、強力な光熱療法剤機能、構造依存的な蛍光の自己消光及び光熱ユニークな特性を有するporphysomesと呼ばれる新規真性多官能ナノベシクルを開発した。我々は、高圧押し出しを使用してporphysomesを策定し、異種移植腫瘍モデルにおけるそれらの光熱治療の有効性を検討した。
Abstract
我々は最近、本質的に多機能ナノベシクルとしてporphysomesを開発しました。光増感剤は、αピロ、リン脂質に結合させた後、リポソーム様の球状の小胞への自己組織化。によりポルフィリン - 脂質二重層中のポルフィリンの非常に高い密度、porphysomes、大きな吸光係数、構造に依存する蛍光自己消光し、優れた光熱効果を生成した。我々の製剤において、porphysomes高圧押し出しを使用して合成し、120nmの周りの平均粒径を示した。 porphysomesの二十四時間後、静脈内注射、腫瘍の局所的な温度は急速に750 MW（1.18 W / cm 2）での1分間の曝露、671 nmのレーザー照射により62℃まで30℃から上昇した。腫瘍の完全な熱切除に続いて、形成され、癒さ2週間以内に、対照群の腫瘍は成長を続けている間、すべてが定義されている専用に達した焼痂3週間以内に、D点。これらのデータは、porphysomesが強力な光熱療法（PTT）剤として使用することができる方法を示す。
Introduction
Porphysomesはマルチモーダルイメージングおよび治療 の1が可能である我々は最近開発された新たな多機能ナノベシクルです。それらは、自己組織化ポルフィリン二重層から形成され、独特の構造に依存する蛍光の自己消光大きな吸光係数と結果を生成する（000/porphysome粒子、83を超える）ポルフィリンの極めて高い密度を含有する。 Porphysomesは、 インビボで良好な薬物動態および生体内分布特性を有する：それらは全身投与後12時間の血中半減期を示し、受動的に24時間後に注射2で7.5％ID / gの異種移植片腫瘍において蓄積する。
彼らのユニークな構造と物理化学的性質は、マルチモーダルイメージングと画像誘導療法のporphysome良い候補を作る。まず第一に、ポルフィリンを含む、porphysomesは、腫瘍蓄積の際に1腫瘍の蛍光イメージングのために本質的に適している。さらに、各ポルフィリンしたがって、porphysomesを容易PETイメージングのためのそのような3は64 Cu等の放射性同位体で標識することができるキレート化放射性同位体のための安定した部位を有している。 porphysome構造が損なわれていないときporphysomesにもユニークな音響イメージングと、PTT機能を発揮するので、さらに、吸収された光エネルギーは、レーザー照射の曝露下に熱放散される。それはporphysomesの静脈内注射後24時間、porphysome蓄積さ腫瘍のレーザ照射急速な温度上昇と強い光熱腫瘍切除を誘導したことが示された。これはporphysomesは金ナノ粒子（AuNPs）と高い吸光係数を有する効率的な光熱エンハンサーであることが実証さ1。一方、AuNPsを含む他の無機光熱剤と比較して、porphysomesは、その有機性に生物学的安全性で優れた利点を示す。 Porphysomesは、酵素的に生分解性であり、最小の急性toxicitを誘導千mg / kgの1という高い静脈内投与したマウスでは、Y。さらに、リポソームと同様に、porphysomesの大水性コアは、受動的または能動的に治療薬または造影剤を装填することができた。 porphysomesの光学的性質と生体適合性がバイオフォトニックイメージングおよび治療のための有機ナノ粒子の多峰性を示しています。
本論文では、ピロ-脂質複合体の合成方法、製造、高圧押し出しを使用してporphysomesの特性評価方法をご紹介します。マウスでのインビボのPTTは、腫瘍内porphysome対応のPTTの効率を実証するためにも実施される皮下異種移植腫瘍モデルを用いた治療。
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Protocol
1。ピロ - 脂質の合成
- 4、98.7 mgの16時00分lysophophatidylcholine（1 -パルミトイル-2 -ヒドロキシ-sn-グリセロ、（。Zhengら 、Bioconj頁、2002年、13 -392前述のように藻 類スピルリナパシフィカから調製した）200ミリモルピロコンバイン-3 - ホスホコリン、アバンティ極性脂質＃855675）、EDCの76.3ミリグラム、48.7ミリグラムのDMAP（4 - （ジメチルアミノ）ピリジン）5ミリリットルアミレン中1:1:2:2パイロの比率クロロホルム安定化：脂質：EDC ：DMPA。
- 24時間アルゴン下、室温で反応混合物を撹拌した。 40℃に加熱しながらロータリーエバポレーターを用いて減圧下でクロロホルムを蒸発させる（ピロのsn-1またはsn-2位で結合）ピロ - 脂質異性体の混合物が生成される。
- 1mMのCaCl 2、50 mMのトリス（pH 8）、0.5％トリトンX-100および5 mg / mlの濃度で10％メタノールに再懸濁パイロ脂質異性体混合物。ミツバチ毒ATからホスホリパーゼA2（PLA2）を追加0.1 mg / mlの濃度およびsn-1ピロ脂質を消化すると、純粋なsn-2位ピロ脂質異性体を生成するために24時間、37℃で溶液をインキュベートする。
- 追加のクロロホルムの2ボリュームおよびメタノール抽出物1.25ボリュームを追加し、40℃で減圧下で回転蒸発を用いて溶媒を除去DCM中の1％MeOH中の切断生成物を再懸濁し、異性体的に純粋なピロ - 脂質のための小さなジオールシリカカラム上の精製。
2。 Porphysomesの調製
- 別途クロロホルム中のピロフェオホルビド - 脂質、ジステアロイル-sn-グリセロ-3 - ホスホエタノールアミン-N-メトキシ（ポリエチレングリコール）（PEG-2000-PE）、およびコレステロールを溶解し、それぞれの濃度を記録する。
- 65モル％のポルフィリン脂質、5モル％のPEG-2000-PEおよび30モル％コレステロールを組み合わせることにより、5ミリグラム/チューブの総脂質重量が12×75mmのホウケイ酸試験管内porphysome脂質フィルムを準備します。
- ニトロの流れの下で脂質フィルムを乾燥させる世代ガス及びそれらをさらに1時間真空下で乾燥させてみましょう。将来の水和および押出しまでアルゴン下で-20℃で脂質フィルムを保管してください。
- 各脂質膜チューブに1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（PBS、150mMのNaCl、10mMリン酸塩、pH7.4）に入れる。完全に凍結するまで液体窒素中で試験管を凍結し、その後、試料は全て溶融するまで65℃の水浴中で解凍管。 30秒（各ボルテックスの間に65℃の水浴中で5秒再加熱して10秒ごとに3回）の計ボルテックスチューブ。
- 大きな凝集体は、水和溶液中で観察することができないまで、必要に応じ5サイクル以上、凍結融解を繰り返します。完了したら、氷の上porphysomeサスペンションのままにしておきます。
- 二つの循環水浴65℃ためのサーモスタットサーキュレーターにサーモ押出機の接続ピンを設置100nmのポリカーボネートフィルターを積層し、高圧力窒素タンクに押出機システムを接続して、高圧押出機（10ml）にアセンブル必ず電源。
- 9インチのガラス移送ピペットを用いて押出機室にporphysome懸濁液を移す。 200と300 psigの間の読み取りは、最初の押出圧力として観察されるまで、窒素タンクレギュレーターのダイヤルを回して圧力を設定します。十分porphysome流量が達成されるか、圧力800psigの（5440キロパスカル）の最大値に達するまで徐々に圧力調整器の弁を開く。
- 最初の押出パスが完了した後、圧力制御弁を閉じて、押出機の上部に圧力逃がし弁を開くことにより、押出機の圧力を解放する。新鮮に押し出されporphysome溶液で押出機を補充し、最終的な押し出された溶液が均一であることを確認するために、少なくとも10回押し出しを繰り返します。
- 紫外可視分光計により、メタノールで希釈した試料の吸収を測定することにより、最終的なporphysome溶液の濃度を決定する。次式のウィットを使用して濃度を計算するH 97,000 Mの吸光係数-1 cm -1の410 nmにおけるピロ-脂質のため。
- 動的光散乱によってマルバーンサイザーZS90を使用してporphysomesの最終的なサイズ分布を測定する。 PBSにporphysome溶液を希釈し、平均の結果を得るために15の実行ごとに3回の測定を行う。
- 分光蛍光光度計を使用して（1％トリトンX-100で1 mM）を蛍光急冷porphysomeの排出量（PBS中1 mM）および非消光porphysomeを比較することにより、porphysomeの蛍光消光を決定します。洗剤の前後のスペクトルを取る（Tirton X-100）を添加し、最大蛍光に読ん信号を正規化されている。 600〜800 nmと410 nmであり、発光波長範囲であることが励振を設定する。
- 将来使用するまで4℃でアルゴン下でporphysomesソリューションを保ち、アルミfで光から保護するオイル。
3。動物異種移植モデルの作製
- 培養KBのRPMI-1640中の細胞（10％FBSを有する）、および37℃、5％CO 2および加湿雰囲気中で細胞を維持する
- 標準的な細胞培養技術を用いて収穫KB細胞。注射時まで、短期保存のために氷上でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の細胞懸濁液（20,000細胞/ ml）で保つ。
- ヌードマウス上のKBの異種移植片を準備します。照射LM-485、：食事;標準食や寝具（ハーランラボラトリーズ与え、：彼らは20グラム（NU（NCR） - FOXN1 NU、6〜7週齢のカテゴリ＃CRL）のときのヌードマウスはチャールズ·リバー·ラボラトリーズから購入＃7912;寝具：トウモロコシの穂軸寝具、¼ "、＃7097）。実験する前に、すべての動物取扱ツール（注射器、ピンセット、および動物パッド）を殺菌する。 100％酸素キャリアガス中の2％イソフルランv / vのでマウスを麻酔。全ての動物プロトコルは機関（大学健康NEによって承認されているtworkこの場合）動物管理使用委員会。
- マウスの右脇腹に、PBSを皮下に懸濁した腫瘍細胞を注入する。マウスは、腫瘍4-5 mmで2ないし3mmの厚さの直径に達したときに、10日後に使用する準備ができている。
4。 インビボ光熱療法
- 尾静脈を介して静脈内porphysomes（200μL容量で750ナノモルのパイロを含む）を注入。 porphysomesのレーザー照射24時間後の注入を行っています。
- このセクションでは、囲まれたレーザー安全室ですべての手順を実施しています。レーザー照射時にレーザーの安全ゴーグルを着用する。
- レーザー照射装置を設定します。スタンドにクランプによってレーザーファイバーとディフューザーを開催しています。低レベルのレーザーパワーを設定し、レーザをオンにします。直径9mm（DPSSレーザー、LaserGlow Technologies社、トロント、カナダ）の照射領域を達成するために、レーザーファイバーの高さを調整すると、pを用いて、750ミリワット（1.18 W / cm 2）と 、レーザパワーを較正その後、文章理解メートルや動物を準備するために、レーザーをオフにしてください。
- NO）捕捉明らかイソフルランのノーズコーンを通じて100％の酸素キャリアガス中の2％のイソフルランV / Vヒトの健康リスクの危険で動物を麻酔。動物は、動物の後肢に鉗子や指で足指のピンチを行うことで十分に深く麻酔をかけていることを確認します。彼らは、この手順に応答しないときの動物は、レーザー照射のための準備が整いました。
- 赤外線熱カメラ（Mikroshot、LUMASENSE技術）によって腫瘍の温度を監視します。 、近い腫瘍にカメラを置きだけでなく、それを集中して、PTT照射が始まる前に、事前のPTT画像だけでなく、通常の白色光画像を取る。
- 再びレーザーの電源を入れ、750ミリワットに光パワーを増加させる。完全にカバーされた腫瘍を得るために、レーザビームの中心部に腫瘍を配置し、照射開始タイミング。 1分間のレーザー治療のための腫瘍の温度画像ごとに5秒を取る。 1分でレーザーをオフにします。 STOP 2％のイソフルランのガス供給、動物が麻酔から回復し、ケージに戻すまで待ってください。
- 大学健康ネットワークによって承認された動物のプロトコールに従って12時12時間の明暗サイクルの下で正常体温の動物室でマウスを保管してください。ブプレノルフィン（0.05 mg / kgで、瘢痕によって引き起こされる疼痛を軽減するレーザー照射後の週の皮下に1日2回注射する。2日毎に、カリパスを用いて腫瘍径を測定し、写真を撮る。用いて腫瘍体積を計算する以下の式：V =π/ 6···B 2、aは長径であり、bが短いものである。
- それが私たちの研究室で定義されたエンドポイントであるように、腫瘍の長径は、10ミリメートルに達したときに、CO 2室でそれらを置くことによって、動物を生け贄に捧げる。 CO2の治療後に頸椎脱臼を実行します。生存曲線をプロットします。
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Representative Results
ピロは、安定な脂質モノマー（ 図1a）などのリン脂質とコンジュゲートの自己集合高圧押出機を用いて膜押し出し法によってporphysomesを形成するために結合される。これは、比較的遅い流速で押し出しの第3サイクルの間porphysome - 脂質懸濁液を押し出すことは通常困難である。より押し出しが繰り返されるように、押し出された液の流量が徐々に増加し、必要に応じて圧力がわずかに減少することができる。 Porphysomeサイズ、濃度、および消光効率が右押出後、ナノ粒子を特徴づける3重要な特性である。サイズ分布の高い均一性（120付近にピーク）とPorphysomesが生成されます（ 図1bおよび1c）の二つの主要な吸収ピーク（410 nmおよび677 nmの、 図1d）と4で保存されている12ヶ月以上安定した状態を保つことができると℃、ポルフィリンの蛍光は99.8％Wという高い消光する編ナノ構造（ 図1E）は無傷である。
インビボ PTTについては、熱が24時間後に投与porphysome（ 図2）でのレーザ照射により迅速に生成することができる。レーザー照射によるPorphysomesだけでは、レーザが10℃未満の温度上昇を誘導しながら、温度は、照射の1分後に35℃の温度範囲の増加を引き起こすこれは、最終腫瘍温度は完全な腫瘍切除を確保するために55°Cに達することが重要である。 PTT照射後、腫瘍は通常ので、強力な熱効果により白っぽくなります。マウスの脚は、PTT以下約2日間、腫瘍領域で少し腫れになる。暗褐色がかった腫瘍に対する痂皮および腫瘍体積が100％減少の熱アブレーションをもたらす。痂皮が24時間後に治療を明らかに観察することができ、それらは徐々に、次の2週間（図3a）の間に回復する。 porphysomesを使用して、皮下TU一人でporphysomeとレーザーだけではコントロールの腫瘍が（ 図3b）成長を続けながら、モルスは完全に、（ 図3b）再発することなく除去することができ、すべてが2週間で終了点に達する。
図1。 porphysomeのナノベシクルと特徴付けの構造。 A。ピロ-脂質porphysome。Bの概略図。 TEM像を対応するc。高圧押出後porphysomesのサイズ分布するd。 410 nmでピークに正規化し、メタノール中のピロ-脂質の吸収、。E。クエンチ（赤い点線）の蛍光発光（全角）および非消光（青色の実線）porphysomes、正規化された最大蛍光に。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
PTT中の図2。熱応答。レーザーは、経皮光照射用に設定。 b及びc。 - porphysomesまたはPBS Dの24時間後に注射でキロバイト担癌マウスでは、レーザー照射により腫瘍の温度は、60秒のレーザー照射時の最大腫瘍温度が（各群5匹のマウスのためのSD + /平均）。 するには、ここをクリックしてください大きな画像を表示する 。
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図3。 A。 3グループを含む、PTT 1に対する治療応答を示す写真は：レーザー照射、レーザー照射したPBS注射で注入をporphysomes、単独で注入をporphysomes。 B。各治療後の平均腫瘍体積（*のn = 5は、P <0.0005を表す）。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
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Discussion
高い薬物ペイロードを維持しながら、薬物送達技術の開発においては、多官能性ナノ粒子は、薬物送達ビヒクルの正確な追跡調査のための広い下現在。 5,6リポソームから血漿タンパク質へのポルフィリン導入されたリポソームは、より良好な薬物動態特性及びポルフィリンの直接投与よりも効率的な送達のために開発されてきたが、障害物が存在し、制限されたポルフィリンの装填量及びポルフィリンの急速な再分布を含む。コアまたはリポソームの脂質二重層のいずれかに挿入される遊離ポルフィリン、従来のリポソーム送達系とは対照的に、ピロ（ピロ）について、直接にかつ安定してリン脂質にコンジュゲートされporphysomesを形成するために、リポソーム状のナノ構造に自己組織化する。その結果、porphysome二重層は、ピロfluoreの構造に依存する自己消光につながる非常に高いポルフィリン充填密度を実現scenceおよび高い吸光係数。
これらのピロ-脂質複合体は、一般に、明確に定義されたサイズ7-9の単層小胞を生成するために使用されるような膜押出法としてのリポソームの同様の調製方法を介して水性緩衝液中porphysomesに自己集合。押出は、水溶液中で水和し、広い粒径分布10と多層小胞を形成するために、数回の凍結-融解サイクルに供される乾燥脂質フィルムから始まる。水和porphysome脂質膜を超える1ミリグラムに達すると/ mlで、手動押し出しが物理的に困難になり、非常に高い圧力押出porphysomeの少なくとも5 mg / mlの8要求される場合、このような動物試験のために、porphysomesのスケールアップ生産のために選択される、9。さらに高い最終ピロ濃度を達成するように、porphysome脂質膜は、より高い初期量を用いて調製することができる。しかし、10 mg / mlの濃度よりも高い濃度のが困難なのに、推奨されていません10ミリリットル高圧押出機で押出成形。出てくる押出された溶液の流速があっても（安全性の問題のために800psigで≤）、非常に高い圧力で（ 例えば 、30分/ ml）極端に遅い場合は押出の間に、フィルタが新しいセットに変更することができ、水循環の温度は65℃〜75℃から増加させることができるリポソームナノ小胞の大きさの均一性は、 インビボ 11 に肝臓および脾臓への取り込みを減少させるに役立つことが示されている。したがって、均一かつ狭いサイズ分布を得るために、フィルタ膜（100nm）を介してporphysome脂質懸濁液の押出は、少なくとも10回繰り返されるまたはそれ以上。
我々は、無視できる大きさの変化、または（データは示していない）我々の研究において、少なくとも1年間のプロパティを急冷して、4℃で保存した場合porphysomesは押出後に非常に安定であるがわかった。それはまだ、それぞれの動物の注射の前にporphysomeサイズと消光効率を試験することをお勧めしますporphysome無傷を確保する。
Porphysomesは、従来のリポソームの薬物送達能力及び生体適合性を維持しながら効率的な光熱エンハンサーとして機能する第一の有機ナノ粒子である。彼らはセラノスティックなアプリケーションのための優れた記録を持ってポルフィリンをベースとしています。12彼らは高い吸光係数の急速な発熱のための金ナノ粒子（のGNP）に比較して、効率的な熱切除1を持っている。 インビボ研究は、従来の癌治療の代替法としてporphysome対応PTTの利点を示している。 PTTは、比較的選択された照射領域（直径9mm）に局在レーザー処理、及び効果的な熱切除、55℃より高い腫瘍の温度を達成するために必要な非常に短い治療期間（1分）で、非常に単純である。簡潔かつ高選択性の両方が回復時間を改善し、foの合併症のリスクを減らすのを助けることができる翻訳の治療への応用をrを。 KB腫瘍（7.5％ID / g）がより少ない腫瘍蓄積を有し、他の異種移植片のタイプが使用される場合、より高いporphysome用量は、IVは、レーザー照射により効率的な熱の発生のために注入することができる。照射プロセス中に、レーザスポットが全腫瘍領域をカバーし、そして腫瘍温度は腫瘍で迅速かつ完全な熱切除を55℃以上に上昇させることが重要である。
研究では、現在、未来の翻訳研究のためのより多くの臨床的に関連する動物モデルにおいて強力なPTT剤としてマルチモーダルイメージングおよびporphysomesの治療への応用を探索する進行中である。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、プリンセスマーガレット病院財団、カナダの国立科学と工学研究評議会、健康研究のためのカナダの研究所、イノベーションカナダ財団、ジョーイとトビータネンバウム/前立腺癌研究におけるブラジルのボールチェア、によってサポートされていましたニューヨーク州立大学研究財団からの助成金やバッファロー大学からのサポートを起動します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary evaporator | Thermo-Savant | SPD131DDA | |
| Votex | Scientific Industries | SI-0236 | Model number: G560 |
| High pressure extruder | LIPEX, Northern Lipids Inc. | T.001 | 10 ml Thermobarrel Extruder |
| Heated bath circulators (Thermostatted circulator) | Thermo SCIENTIFIC | SC100-S5P | |
| Polycarbonate filters | Avanti Polar Lipids | 610005 | Pore size 100 nm, and membrane diameter 19 mm |
| Zetasizer | Malvern Instruments | ZS90 | |
| UV/Visible Spectrophototmeter | Varian Australia | Cary 50 Bio UV/ Visible Spectrophotometer | |
| Spectrofluorometer | HORIBA Scientific | FluoroMax-4 | |
| Transmission Electron Microscopy (TEM) | Hitachi | H-7000 | |
| Cell culture incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Powermeter | Thorlabs | PM100D | with sensor S142C |
| 671nm Laser | LaserGlow Technologies | LRS-0671_PFN-02000-05 | S/N:10097270 |
| Infrared Thermometer | Mikroshot, LUMASENSE Technologies | 9102409 | |
| Laser protective eye goggles | LaserGlow Technologies | AGF6602XX | Optical Density: 1.5+ at 630-700 nm |
References
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