One Minute, Sub-One-Watt Photothermal Tumor ablasjon med Porphysomes, Intrinsic Multifunksjonell Nanovesicles

Summary

Vi utviklet romanen iboende multifunksjonelle nanovesicles kalt porphysomes, som har struktur avhengig fluorescens selvlukkende og unike photothermal egenskaper, og dermed fungere som potente photothermal terapi agenter. Vi formulerte porphysomes bruker høytrykks ekstrudering og undersøkt deres photothermal terapi effekt i en xenograft tumor modell.

Abstract

Vi har nylig utviklet porphysomes som egenmultifunksjonelle nanovesicles. En fotosensibiliserende, pyropheophorbide α, ble konjugert til et fosfolipid, og deretter selv montert på liposom-lignende sfæriske vesikler. På grunn av den ekstremt høye tetthet av porfyrin i porfyrin-lipidbilag, porphysomes generert store ekstinksjonskoeffisienter, struktur avhengig fluorescens selvlukkende, og utmerket photothermal effekt. I vår formulering ble porphysomes syntetisert ved hjelp av høytrykks-ekstrudering, og viste en midlere partikkelstørrelse i området rundt 120 nm. Tjuefire timer etter intravenøs injeksjon av porphysomes, den lokale temperatur i tumoren øket fra 30 ° C til 62 ° C hurtig ved ett minutts eksponering på 750 mW (1.18 W / cm ^2), 671 nm laser-bestråling. Etter den fullstendige termisk ablasjon av svulsten, eschars dannes og leget i løpet av 2 uker, og i kontrollgruppene svulstene fortsatt å vokse og alle nådd definert nod punktet i løpet av 3 uker. Disse dataene viser hvordan porphysomes kan brukes som potent fototermiske behandling (TOS) midler.

Introduction

Porphysomes er nye multifunksjonelle nanovesicles at vi nylig utviklet som er i stand til multimodal bildebehandling og terapi ^en. De er dannet av selv-sammensatte porfyriner bilayers og inneholder en meget høy tetthet av porfyrin (over 83, 000/porphysome partikkel), som genererer store ekstinksjonskoeffisient og resulterer i enestående struktur avhengig fluorescens selv-slukke. Porphysomes har god in vivo farmakokinetiske og biofordelingsstudier egenskaper: de oppviser en blodhalveringstid på 12 timer etter systematisk administrering, og passivt akkumuleres i xenograft tumorer med 7,5% ID / g ved 24 timer etter injeksjon ^2.

Deres unike struktur og fysiokjemiske egenskaper gjør porphysome en god kandidat for multimodal bildebehandling og bildestyrt behandling. Først av alt, inneholder porfyrin, porphysomes er egentlig egnet for fluorescens avbildning av svulster på svulsten akkumulering ^en.I tillegg har hver porfyrin et stabilt område for chelaterende radioisotoper, derfor kan porphysomes lett merkes med radioisotoper som 64Cu for PET billeddiagnostikk ^tre. Videre er absorbert lysenergi utsvevende termisk henhold laser bestråling eksponering når porphysome strukturen er intakt, så porphysomes også oppvise unike fotoakustiske bildebehandling og TOS evner. Det har vist seg at 24 timer etter intravenøs injeksjon av porphysomes, laserbestråling av porphysome-akkumulert tumorindusert en hurtig temperaturstigning og sterk photothermal tumor ablasjon. Dette viste at porphysomes er effektive photothermal forsterkere med ekstinksjonskoeffisient så høyt som gull nanopartikler (AuNPs) ^en. På den annen side, sammenlignet med andre uorganiske, fototermiske midler, innbefattende AuNPs, porphysomes viser en enestående fordel i biosikkerhet grunn av deres biologisk natur. Porphysomes er enzymatisk nedbrytbare og indusere minimal akutt toxicity i mus med intravenøse doser så høye som 1000 mg / kg ^en. Videre, i likhet med liposomer, kan store vannholdig kjerne av porphysomes være aktivt eller passivt, lastet med terapeutisk eller avbildningsmidler. De optiske egenskapene og biokompatibilitet av porphysomes demonstrere multimodale potensialet av organiske nanopartikler for BioPhotonic avbildning og terapi.

I denne artikkelen introduserer vi syntesen metode for pyropheophorbide-lipid konjugater, produksjon og karakterisering metode for porphysomes bruker høytrykks ekstrudering. In vivo PTT på mus er gjennomført i tillegg til å demonstrere effektiviteten av porphysome-aktivert PTT i svulsten Etterbehandling med subkutan xenograft tumor modell.

Protocol

En. Syntese av Pyropheophorbide-lipid

1. Kombiner 200 mmol pyropheophorbide (fremstilt fra Spirulina Pacifica alger som tidligere beskrevet,... Zheng et al, Bioconj Chem, 2002, 13 -392) ^4, 98,7 mg 16:00 lysophophatidylcholine (1-palmitoyl-2-hydroksy-sn-glycero -3-fosfocholin, Avanti Polar Lipids # 855675), 76,3 mg EDC, 48,7 mg DMAP (4 - (dimetylamino) pyridin) i 5 ml amylene stabilisert kloroform for et forhold på 1:1:2:2 pyro: Lipid: EDC : DMPA.
2. Omrør reaksjonsblandingen ved romtemperatur under argon i 24 timer. Fordamp kloroformen under redusert trykk ved bruk av en rotasjonsfordamper under oppvarming til 40 ° C. Blandingen av pyro-lipid isomerer (pyro festet ved sn-1 sn-eller 2-posisjon) blir produsert.
3. Resuspender pyro-lipid isomer-blanding i 1 mM CaCl _2, 50 mM Tris (pH 8), 0,5% Triton X-100 og 10% metanol ved en konsentrasjon på 5 mg / ml. Legg fosfolipase A2 (PLA2) fra honningbie venom på0,1 mg / ml konsentrasjon og inkuber oppløsningen ved 37 ° C i 24 timer for å fordøye sn-1 pyro-lipid og for å produsere ren sn-2-pyro-lipid isomer.
4. Til ytterligere to volumer av kloroform og 1,25 volumdeler metanol, ekstraktet, og deretter fjerne oppløsningsmidlet ved hjelp av roterende fordampning ved redusert trykk ved 40 ° C. Resuspender spaltningsprodukt i 1% MeOH i DCM og renser over en liten diol silikakolonne for isomerically rent pyro-lipid.

2. Utarbeidelse av Porphysomes

1. Oppløs pyropheophorbide-lipid, distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-metoksy (polyetylenglykol) (PEG-2000-PE) og kolesterol i kloroform hver for seg, og registrere konsentrasjonene respektivt.
2. Forbered porphysome lipidfilm i et 12x75 mm borsilikat testrør med en total lipid vekt på 5 mg / rør ved å kombinere 65 molar% porfyrin-lipid, 5 molar% PEG-2000-PE og 30 mol% kolesterol.
3. Tørk lipid film under en strøm av nitrogen gass og la dem videre tørket under vakuum i 1 time. Oppbevar lipid-film ved -20 ° C under argon inntil den fremtidige hydrering og ekstrudering.
4. Tilsett 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS, 150 mM NaCl, 10 mM fosfat, pH 7,4) til hver lipidfilmen rør. Fryse reagensglasset i flytende nitrogen inntil det er fullstendig frosset, og deretter tines røret i 65 ° C vannbad inntil prøven har smeltet. Vortex røret for totalt 30 sek (3 ganger med 10 sek hver, med 5 sek gjenoppvarming i 65 ° C vann-bad mellom hver virvling).
5. Gjenta fryse-tine for 5 sykluser eller mer ved behov, til ingen store aggregater kan observeres i hydrert løsning. La porphysome suspensjon på isen når du er ferdig.
6. Monter høytrykks-ekstruder (10 ml) med to stablede 100 nm polykarbonatfiltere som er installert i. Koble thermobarrel ekstruder til en termostatstyrt sirkulator for 65 ° C sirkulerende vannbad, og koble ekstruderen systemet til en nitrogentank for høye trykksikker forsyning.
7. Overfør porphysome suspensjon til ekstruderens kammeret ved hjelp av en 9-tommers glass overføring pipette. Still inn trykket ved å dreie hjulet på nitrogen tank regulator til en lesning mellom 200 og 300 psig er observert som første presstrykket. Åpne ventilen for trykkregulatoren gradvis inntil tilstrekkelig porphysome strømningshastighet er oppnådd, eller maksimalt 800 psig (5440 kPa) av trykk er nådd.
8. Etter at det første presspasning er fullført, lukker trykkstyringsventilen, og avlaster trykket i ekstruderen ved å åpne trykkavlastningsventil på ekstruderen toppen. Påfyll ekstruderen med ferskt ekstrudert porphysome løsning, og gjenta ekstrudering i minst 10 ganger for å sikre den endelige ekstruderte løsningen er homogen.
9. Bestem konsentrasjonen av slutt porphysome løsning ved å måle absorpsjonen av en fortynnet prøve i metanol ved UV-Vis-spektrometer. Beregn konsentrasjonen ved hjelp av den følgende ligning with utsluknings'koeffisienten av 97000 M ^-1 cm ^-1 ved 410 nm for pyropheophorbide-lipid.

10. Mål den endelige størrelsesfordelingen for porphysomes ved hjelp av en Malvern Zetasizer ZS90 ved dynamisk lysspredning. Spe porphysome løsning i PBS og utføre tre målinger med 15 runs hver for veide resultater.
11. Bestem fluorescensslukking av porphysome ved å sammenligne fluorescensemisjonen fra bråkjølt porphysome (1 mM i PBS) og unquenched porphysome (1 mM i 1% Triton X-100) ved hjelp av spektrofluorometer. Ta spektra før og etter vaskemiddelet (Tirton X-100) ble tilsatt, og normalisere signalene lest til maksimal fluorescens. Sett magnetisering til å være 410 nm og emisjonsbølgelengdeområde for å være 600 til 800 nm.
12. Hold porphysomes løsning under argon ved 4 ° C til fremtidig bruk, og beskytte den mot lys av aluminium folje.

Tre. Utarbeidelse av Animal Xenograft Model

1. Kultur på KB-celler i RPMI-1640 (med 10% FBS), og opprettholde cellene i 5% _CO2 og fuktig atmosfære ved 37 ° C.
2. Innhøsting KB celler ved hjelp av standard cellekultur teknikk. Hold cellesuspensjonen (20 000 celler / ml) i fosfatbufret saltvann (PBS) på is for kortvarig lagring inntil tidspunktet for injeksjon.
3. Forbered en KB xenografts på nakne mus. Nakne mus er kjøpt fra Charles River Laboratories når de er 20 g (Kategori # CRL: NU (NCR)-Foxn1 ^nu, 6-7 uker gamle), gitt standard kosthold og sengetøy (Harlan Laboratories; Diet: Irradiated LM-485, # 7912; Bedding: Corncob sengetøy, ¼ ", # 7097). Steriliser alle dyr håndteringsverktøy (sprøyte, tang, og dyr pad) før eksperimenter. Anesthetize mus med 2% isofluran v / v i 100% oksygenbærergass. Alle dyre protokoller er godkjent av institusjonen (University Health Network i dette tilfellet) dyr omsorg og bruk komité.
4. Injiser tumor celler suspendert i PBS subkutant i høyre flanke av mus. Mus er klar til å bli brukt etter 10 dager når tumoren når diameter på 4-5 mm og tykkelse på 2-3 mm.

4. In vivo Photothermal Therapy

1. Injisere porphysomes (som inneholder 750 nmol pyro på 200 mL volum) intravenøst ​​via halevenen. Gjennomføre laser bestråling 24 timers post-injeksjon av porphysomes.
2. I denne delen, gjennomføre alle prosedyrer i et lukket laser sikkerhetsrommet. Bruk laser vernebriller under laser bestråling.
3. Sett opp laseren bestråling utstyr. Hold laser fiber og en diffuser av en klemme på et stativ. Sett laser effekt på lavt nivå og slå på laseren. Juster høyden på laser fiber for å oppnå en bestråling areal på 9 mm i diameter (DPSS Laser, LaserGlow Technologies, Toronto, Canada), kalibrere lasereffekten til 750 mW (1,18 W / cm ²⁾ med apower meter og deretter slå av laseren for å forberede dyrene.
4. Anesthetize dyrene med 2% isofluran v / v i 100% oksygen bæregass gjennom nesen membran ingen scavenging tydelig av isofluran en menneskelig helserisiko fare). Bekreft at dyret er bedøvet dypt nok ved å utføre en tå klype med pinsett eller fingrene til dyrets hind poter. Dyrene er klar for laserstråling når de responderer ikke på denne prosedyren.
5. Overvåke svulsten temperaturen med en infrarød varmekamera (Mikroshot, LUMASENSE Technologies). Sett kameraet i nærheten av svulsten, fokuserer den godt og ta en forhånds PTT bildet så vel som et vanlig hvitt lys bilde før PTT bestrålings starter.
6. Slå på laser på nytt, og øke lyseffekten til 750 mW. Plasser tumor i sentrum av laserstrålen for å komme i svulsten fullstendig dekket, og begynner tids bestråling. Ta svulsten temperaturbildet hver 5 sek for en ett minutt laserbehandling. Slå av laser på 1 min. Stop gasstilførselen av 2% isofluran, vente til dyret gjenoppretter fra anestesi og sette den tilbake til buret.
7. Hold mus ved normothermia dyrerom henhold 12:12 hr mørk og lys syklus i henhold til dyre protokoller godkjent av University Health Network. Injisere Buprenorfin (0,05 mg / kg, subkutant to ganger om dagen i en uke etter laser bestråling for å redusere smerte forårsaket av arret. Hver dag, måle diameter svulst ved hjelp av en skyvelære og ta et bilde. Beregn svulsten volumet ved hjelp av følgende ligning: V = π / 6 • A • B ^2, hvor en er den lange diameter, og b er den korte.
8. Ofre dyrene ved å sette dem i CO ₂ kammer når den lange diameter på svulsten når 10 mm, så det er det definerte sluttpunktet i vårt laboratorium. Utfør cervical forvridning etter CO2-håndtering. Plott overlevelseskurve.

Representative Results

Pyropheophorbide er konjugert til fosfolipid som en stabil lipid monomer (figur 1a) og konjugater selv montere å danne porphysomes ved membranpressmetoden ved hjelp av en høytrykks-ekstruder. Det er vanligvis vanskelig å ekstrudere porphysome-lipid suspensjonen i løpet av de første tre sykluser av ekstrudering med relativt langsom strømningshastighet. Ettersom flere profiler blir gjentatt, blir strømningshastigheten for ekstruderte løsning gradvis øker, og trykket kan bli litt redusert, om nødvendig. Porphysome størrelse, konsentrasjon, og leskende effektivitet er tre viktige egenskaper for å karakterisere nanopartikler rett etter ekstrudering. Porphysomes med høy homogenitet av størrelsesfordeling (topp rundt 120 nm) er generert (Tall en b og 1c) med to hoved absorbans toppene (410 nm og 677 nm, Figur 1d) og kan holde seg stabilt i over 12 måneder når det blir lagret på fire ° C. Fluorescensen av porfyrin bråkjøles så høyt som 99,8% whøne nanostrukturen er intakt (figur 1e).

For in vivo PTT, kan varme bli generert hurtig ved laserbestråling ved 24-timers post-porphysome administrering (figur 2). Porphysomes med laser-bestråling føre til at temperaturen økes med over 35 ° C etter 1 min for bestråling, mens laseren alene induserer en temperaturøkning på mindre enn 10 ° C. Det er viktig at den endelige tumor temperaturen når 55 ° C for å sikre fullstendig tumor ablasjon. Etter PTT bestråling, blir tumorer vanligvis hvitaktig på grunn av den potente termisk effekt. Musen etappe blir litt hoven på svulsten området for rundt to dager etter PTT. Termisk ablasjon resultater i mørk brun sårskorpe på svulster og 100% reduksjon av tumor volum. Eschars kan observeres åpenbart på 24 timer etter behandling, og de ​​gradvis opp i løpet av de følgende 2 uker (figur 3a). Bruke porphysomes, subkutan tumors kan være fullstendig eliminert uten tilbakefall (figur 3b), mens tumorer i porphysome alene og laser alene kontroll fortsetter å vokse (figur 3b), og alle nå endepunktet i 2 uker.

Figur 1. Oppbygging av porphysome nanovesicles og karakterisering. en. Skjematisk fremstilling av et pyropheophorbide-lipid porphysome. B.. tilsvar TEM bilde. c.. Størrelsesfordelingen av porphysomes etter høytrykks-ekstrudering. d.. Absorbans av pyropheophorbide-lipid i metanol, normalisert til toppen ved 410 nm. E. fluorescensemisjon (em) av slokket (rød strek linje) og unquenched (blå heltrukket linje) porphysomes, normalisert til maksimal fluorescens. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Termisk respons i løpet av TOS. En. laser satt opp for transdermal lysbestråling. b og c.. . Temperatur av svulst på laser bestråling i KB tumor-bærende mus ved 24 timers post-injeksjon av porphysomes eller PBS d, Maksimal svulst temperaturen under 60 sek laser bestråling (gjennomsnitt + / - SD for 5 mus i hver gruppe). Klikk her for å se større figur .

iles/ftp_upload/50536/50536fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50536/50536fig3.jpg "/>
Figur 3. en. Fotografier som viser terapeutisk respons på TOS ^en, inkludert tre grupper: porphysomes injeksjon med laser bestråling, PBS injeksjon med laser bestråling, og porphysomes injeksjon alene. b. Gjennomsnittlig tumorvolum etter hver behandling (n = 5, med * representerer p <0,0005). Klikk her for å se større figur .

Discussion

I utviklingen av narkotika levering teknologier, multifunksjonelle nanopartikler er under brede undersøkelser for nøyaktig sporing av stoffet levering kjøretøy og samtidig opprettholde en høy narkotika nyttelast. Porfyrin-lastet liposomer har blitt utviklet for bedre farmakokinetiske egenskaper og mer effektiv levering enn direkte administrering av porfyrin, men hindringer eksisterer, inkludert den begrensede laste mengden av porfyrin og hurtig fordeling av porfyrin fra liposomer til plasmaproteiner ^5,6. I motsetning til konvensjonelle liposomal levering systemer hvor frie porfyrin settes inn i enten kjernen eller lipid-dobbeltlag av liposomet, pyropheophorbide (pyro) er nå rett og stabilt konjugert til fosfolipidet og selv montere inn liposom-lignende nanostrukturer for å danne porphysomes . Som et resultat, oppnår porphysome bilayer ekstremt høy porfyrin pakketetthet, noe som fører til struktur avhengig selvlukkende av pyro fluorescerende Whitescence og høy ekstinksjonskoeffisient.

Disse pyro-lipid konjugater selv montere inn porphysomes i vandig buffer via lignende forberedelse metode for liposomer, for eksempel membran ekstrudering metode som vanligvis brukes til å generere unilamellære vesikler av veldefinert størrelse ^7-9. Ekstruderingen starter fra en tørr lipidfilm som er hydratisert i den vandige løsning, og utsettes for flere fryse-tine-sykluser for å danne multilamellære vesikler med bred størrelsesfordeling ^10. Når det hydratiserte porphysome lipidfilmen når mer enn 1 mg / ml, blir fysisk krevende, slik at høyt trykk ekstrudering er valgt for oppskalert produksjon av porphysomes, slik som for dyrestudier når minst 5 mg / ml porphysome kreves ⁸ manuell ekstrudering ^{, 9.} For å oppnå enda høyere endelige pyro konsentrasjon, kan porphysome lipid-film være forberedt med høyere opprinnelige beløpet. Men konsentrasjonen er høyere enn 10 mg / ml er ikke anbefalt på grunn av vanskeligheten medekstrudering med 10 ml høytrykks ekstruder. Under ekstrudering, dersom strømningshastigheten av den ekstruderte oppløsning som kommer ut er meget langsom (for eksempel 30 min / ml), selv med meget høyt trykk (800 psig ≤ for sikkerhetsproblem), idet filteret kan endres til et nytt sett, og Temperaturen på vann-sirkulasjon kan økes fra 65 ° C-75 ° C. Måle homogenitet for liposomale nanovesicles har vist seg å bidra til å redusere lever og milt uptake in vivo ^11.. Derfor, for å oppnå en homogen og snever størrelsesfordeling, ekstrudering av porphysome lipid suspensjonen gjennom filtermembranen (100 nm) blir gjentatt i det minste ti ganger eller enda mer.

Vi har funnet porphysomes er meget stabil etter ekstrudering når de lagres ved 4 ° C, med neglisjerbar forandring i størrelse eller bråkjøling egenskaper i minst ett år i våre studier (data ikke vist). Det er fortsatt anbefalt å teste porphysome størrelse og leskende effektivitet før hvert dyr injeksjonå sikre porphysome intactness.

Porphysomes er de første organiske nanopartikler for å tjene som effektive photothermal enhancers samtidig opprettholde stoffet leveringskapasitet og biokompatibilitet av konvensjonelle liposomer. De er basert på porfyriner, som har en utmerket rekord for theranostic applikasjoner. ¹² De har høy ekstinksjonskoeffisient komparative til gull nanopartikler (bruttonasjonalprodukt) for rask varmeutvikling og effektiv termisk ablasjon ^en. De in vivo-studier har vist fordelene ved porphysome aktivert PTT som en alternativ metode til konvensjonell kreftbehandling. PTT er svært enkel, med laserbehandling relativt lokalisert til den valgte bestrålingsområdet (9 mm diameter), og meget kort behandlingsperiode (1 min) som kreves for å oppnå tumor temperatur som er høyere enn 55 ° C for effektiv termisk ablasjon. Både enkle og høy selektivitet kan bidra til å øke utvinningen tid og redusere risikoen for komplikasjoner for translasjonell terapeutiske bruksområder. Hvis andre xenograft typer som har mindre tumor akkumulering enn KB tumor (7,5% ID / g) anvendes, kan høyere porphysome dose være IV injisert for effektiv varmeutvikling ved laserbestråling. Under bestrålingsprosessen, er det viktig at laserpunkt dekker hele tumor-området, og tumor temperaturen økes til 55 ° C eller høyere for rask og fullstendig termisk ablasjon i tumorer.

Studier nå pågår for å utforske den multimodal bildebehandling og terapeutiske anvendelser av porphysomes som potent TOS agenter i mer klinisk relevante dyremodeller for fremtidig translasjonell studie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotary evaporator	Thermo-Savant	SPD131DDA
Votex	Scientific Industries	SI-0236	Model number: G560
High pressure extruder	LIPEX, Northern Lipids Inc.	T.001	10 ml Thermobarrel Extruder
Heated bath circulators (Thermostatted circulator)	Thermo SCIENTIFIC	SC100-S5P
Polycarbonate filters	Avanti Polar Lipids	610005	Pore size 100 nm, and membrane diameter 19 mm
Zetasizer	Malvern Instruments	ZS90
UV/Visible Spectrophototmeter	Varian Australia	Cary 50 Bio UV/ Visible Spectrophotometer
Spectrofluorometer	HORIBA Scientific	FluoroMax-4
Transmission Electron Microscopy (TEM)	Hitachi	H-7000
Cell culture incubator	SANYO	MCO-18AIC
Powermeter	Thorlabs	PM100D	with sensor S142C
671nm Laser	LaserGlow Technologies	LRS-0671_PFN-02000-05	S/N:10097270
Infrared Thermometer	Mikroshot, LUMASENSE Technologies	9102409
Laser protective eye goggles	LaserGlow Technologies	AGF6602XX	Optical Density: 1.5+ at 630-700 nm