Summary
قياسات القوة يمكن أن تستخدم لإظهار التغيرات في وظيفة العضلات نتيجة للتنمية، والإصابة، والمرض، والعلاج أو السمية الكيميائية. في هذا الفيديو، ونحن يبرهن على وجود طريقة لقياس قوة خلال انكماش القصوى من الزرد العضلات الجذع اليرقات.
Abstract
اليرقات الزرد تقديم نماذج من تنمية العضلات، وأمراض العضلات والعضلات المتصلة السمية الكيميائية، ولكن غالبا ما تفتقر إلى الدراسات ذات الصلة تدابير وظيفية للصحة العضلات. في هذه المقالة الفيديو، ونحن يبرهن على وجود طريقة لقياس قوة الجيل أثناء انقباض عضلة الجذع الزرد اليرقات. يتم إنجاز قياسات القوة عن طريق وضع اليرقة تخدير في غرفة مليئة محلول ملحي. ويرتبط نهاية الأمامي من اليرقة إلى محول القوة وقيدت نهاية الخلفي من يرقة إلى وحدة تحكم طول. وأثارت انكماشا نشل متساوي القياس عن طريق تحفيز الحقل الكهربائي ويتم تسجيل استجابة قوة للتحليل. جيل القوة خلال الانكماش يوفر مقياسا لصحة العضلات عموما وعلى وجه التحديد على قدر من وظيفة العضلات. على الرغم من أننا وصف هذه التقنية للاستخدام مع البرية من نوع اليرقات، ويمكن استخدام هذه الطريقة مع يرقات المعدلة وراثيا أو مع يرقات تعامل مع العقاقير أو المواد السامة،لتوصيف نماذج مرض في العضلات وتقييم العلاجات، أو لدراسة تنمية العضلات، والإصابة، أو السمية الكيميائية.
Introduction
يتم التعرف على نحو متزايد الشباب الزرد (دانيو rerio) اليرقات، 3-7 أيام بعد الإخصاب (DPF)، كما كائن مفيد للبحوث العضلات والهيكل العظمي. وتستخدم اليرقات الشباب إلى نموذج الإنسان مرض في العضلات 1-9، وتقييم العقاقير والاستراتيجيات العلاجية 10-11، الدراسة 12 اصابة في العضلات، فهم العضلات التنمية 13-16، والتحقيق في العضلات المتصلة السمية الكيميائية 17-19. دراسات نموذجية في هذه المناطق فحص الدرجة التي يتم تقديمها العضلات صحية غير طبيعية من خلال التلاعب وراثية أو التعرض للسميات، وبعض الدراسات دراسة الدرجة التي يستجيب العضلات غير طبيعية للعلاج. بالغ الأهمية لنجاح هذه الدراسات هو القدرة على تقييم دقيق الصحية العضلات.
في حين أن هناك مجموعة متنوعة من الطرق المتاحة لتقييم صحة العضلات في اليرقات الزرد، وعدد قليل تقديم معلومات مباشرة حول وظيفة العضلات. عادة ما يتم تقييم الحالة الصحية للعضلات من قبل appearancه، وفقا لتقييم تلطيخ النسيجية 6،8،11، المناعية 9،15،16،18، المجهر الضوئي 3،13، والإلكترون المجهري 3،4،14،16، أو الانكسار 7،9،11، ولكن هذه التقنيات توفير المعلومات الصرفية فقط. الجذع والتشريد الذيل وسرعة السباحة 4،17 تقييم وظيفة الحركة، ولكن هذه ليست التدابير المباشرة من وظيفة العضلات نظرا لأنها تعكس أيضا المدخلات العصبية، والتمثيل الغذائي والطاقة، وغيرها من العمليات.
في المقابل، قياس توليد القوة خلال الانكماش يوفر التقييم المباشر من وظيفة العضلات ويمثل مقياسا لصحة العضلات بشكل عام. فوائد إضافية من هذا النهج يشمل تحليل البيانات واضحة والنتائج الكمية. في هذه المقالة الفيديو، ونحن نقدم إجراءات مفصلة لقياس توليد القوة من قبل العضلات اليرقات، على أمل أن المزيد من الباحثين سوف تستخدم هذا الأسلوب لتكمل التدابير القائمة من صحة العضلات في أبحاثهم.
أن تكون واضحة، وهذا الأسلوب لا يقيس القوات التي تولدها عضلات اليرقات أثناء السباحة. لأن ترتبط طرفي اليرقة إلى معدات ولأن يرقة يبقى تخدير، فإنه لا يمكن الشروع في الحركة أثناء الاختبار. وعلاوة على ذلك، والتحفيز حقل ينشط جميع ألياف العضلات في نفس الوقت للحث على مليارانكماش ateral، الذي ليس هو ما يحدث بشكل طبيعي 20. لذلك، بدلا من قياس القوى الفعلية المتولدة أثناء السباحة، وهذا الأسلوب يحدد قدرة توليد قوة عضلات اليرقات.
وقد استخدمنا هذه التقنية لإثبات ضعف العضلات في نموذج الزرد من اعتلال عضلي خيطي 21، وكذلك لتقييم تأثير العلاج المضادة للأكسدة على وظيفة العضلات في نموذج الزرد من مرض متعدد minicore 22. وقد استخدمت تقنية مماثلة الآخرين 23 لدراسة الآثار المترتبة على الملوثات البيئية على وظيفة العضلات 19.
Protocol
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الزرد وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة واللوائح، والهيئات التنظيمية. وقد وافق جميع الإجراءات استخدام الحيوان هو موضح في هذا المقال من قبل جامعة ميشيغان اللجنة على استخدام ورعاية الحيوانات (UCUCA).
1. جعل الحلقات خياطة
- استخدام ملقط لفصل خياطة غير معقمة (USP 10/0 حيدة النايلون، 3 رقائق) إلى ثلاثة فروع.
- البدء في ربط عقدة مزدوجة الذراع في واحدة من فروع. وقف قبل تشديد عقدة تماما لجعل صغيرة حلقة (~ 1 ملم قطر) بدلا من عقدة.
- استخدام مقص لقطع الدرز الزائدة من ذيول حلقة. ويرد مثال من حلقة انتهت في الشكل 1.
- وضع حلقة على الجانب زجة من بعد أن لاحظ لاستخدامها لاحقا. وسوف تستخدم الحلقات خياطة لعقد اليرقات في مكان أثناء اختبار قوة.
- كرر الخطوات من 1،1-1،4 عند الضرورة. MAKه اثنين من الحلقات خياطة لكل يرقة التي سيتم اختبارها.
2. جعل الحل اختبار
- جعل Tyrodes حل بإضافة 7.977 غرام كلوريد الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم 0.373 غرام، 0.265 غرام الكالسيوم ثنائي هيدرات كلوريد، 0.102 غرام هيدرات كلوريد المغنيسيوم، 0.048 غرام صوديوم فوسفات أحادى، 1.000 غرام بيكربونات الصوديوم، و0.037 ز ethylenediaminetetraacetic حامض الصوديوم تبلور الملح إلى 1،000 مل من المياه النقية.
- تحريك الحل حتى تذوب تماما الأملاح. ويمكن تخزين هذا الحل لمدة شهر على 4 درجات مئوية.
- إضافة 2.1 مل من 4 ملغ / مل تريكين، الذي أعد وفقا لالزرد كتاب 24، إلى 47.9 مل Tyrodes حل والمزيج. حماية هذا الحل من ضوء عن طريق تخزينه في زجاجة داكنة أو في زجاجة مغطاة بورق الألومنيوم. يجب أن يتم تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة وأدلى الطازجة كل يوم.
3. ربط اليرقة Aanesthetized إلى غرفة التجريبية
- <لى> ضع جهاز الفحص (الشكل 2) على مسرح المجهر ستيريو.
- قم بتوصيل محول القوة وكابلات تحكم طول لجهاز الفحص. بدوره على محول القوة. بدوره على وحدة تحكم طول بحيث يظل جامدة. (ملاحظة:. يوفر وحدة تحكم طول القدرة على تمدد أو تقصير إعداد العضلات خلال الانكماش ومع ذلك، لا يتم استخدام هذه الميزة للتحكم في طول الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة لذلك، وحدة تحكم طول يمكن اعتبار كمرفق جامدة النقطة التي شنت على نظام تحديد المواقع XYZ).
- مع ماصة نقل القابل للتصرف، وملء الغرفة التجريبية مع حل الاختبار.
- استخدام ملقط لالتقاط حلقة خياطة من قبل واحدة من ذيول وتعلقها على أنبوب محول القوة. شنق حلقة خياطة الثاني على أنبوب تعلق على وحدة تحكم طول. (ملاحظة: تجتاح حلقة خياطة على الجزء المنحني يمكن شبك خياطة والكمنولثحد ذاتها لكسر أثناء الخطوات اللاحقة).
- مع ماصة نقل القابل للتصرف، ونقل اليرقة الزرد إلى طبق بتري صغيرة مليئة حل الاختبار. انتظر مخدر في حل اختبار (تريكين) نافذة المفعول (~ 1 دقيقة). مع ملقط، دفع بلطف الذيل والتحقق من أن يرقة هو تخدير بسبب عدم وجود لمسة أثار السباحة.
- استخدام ماصة الزجاج لنقل يرقة إلى الغرفة التجريبية.
- بواسطة بايعاز بلطف اليرقة مع ملقط مغلقة، وتوجيه الجزء الأمامي من اليرقة خلال الحلقة خياطة على أنبوب محول القوة. توجيه الجزء الأمامي من اليرقة خلال الحلقة خياطة على أنبوب. فهم على حد سواء ذيول حلقة خياطة مع ملقط وسحب منها في وقت واحد لإحكام حلقة خياطة الخلفي للكيس المح أو swimbladder (الشكل 3A).
- مع ملقط، عقد واحد خياطة الذيل حلقة وسحب، مما تسبب اليرقة إلى 90 درجة قطب حول الأنبوب حتى الجانب الوحشي من الوجه يرقةمتروك (الشكل 3B). إذا تم تشديد حلقة بما فيه الكفاية، وسوف يكون هناك بعض المقاومة إلى سحب، وينبغي اليرقة لا قطب بسهولة. إذا تم تشديد حلقة كثيرا، وسوف اليرقة لا قطب حول الأنبوب.
- باستخدام جهاز تحديد المواقع XYZ تعلق على طول تحكم، حرك أنبوب تحكم طول على طول محور X (التعاريف محور في الشكل 2A) وتحت الجذع والذيل من يرقة. ترك مسافة بين طرفي أنبوب تحكم طول وأنبوب محول القوة.
- توجيه حلقة خياطة أكثر من ذيل اليرقة وتشديد حلقة خياطة كما هو موضح سابقا (الشكل 3C). قد تحتاج إلى تدوير الجزء الخلفي من يرقة بحيث تواجه الجانب الوحشي حتى. تقليم ذيول حلقة خياطة (الشكل 3D).
4. اليرقة موقف في غرفة التجريبية
- نقل يرقة لمسافة مناسبة من أسفل غرفة لضمان ث يرقةيكون مريضا داخل "العمل عن بعد" من هدف مجهر مقلوب خلال الخطوات اللاحقة. لإنجاز هذا، استخدام أجهزة تحديد المواقع XYZ لخفض ببطء أنابيب (مع يرقة المرفقة) على طول محور Z-حتى أنابيب مجرد تلمس الجزء السفلي من الغرفة. ثم، ورفع أنابيب حتى اليرقة هو على مسافة مناسبة من أسفل غرفة (~ 100 ميكرون).
- باستخدام جهاز تحديد المواقع XYZ تعلق على وحدة تحكم طول، وضبط أنبوب تحكم طول على طول المحور Y لمحاذاة المحور الطويل لليرقة مع محور طويل من الأنبوب محول القوة.
5. قوة سجل خلال الانكماش نشل القصوى
- نقل جهاز الفحص إلى مرحلة مجهر مقلوب.
- ضبط درجة حرارة غرفة إلى القيمة المطلوبة. للبدء، قم بتوصيل دائري ماء الحمام، ميزان الحرارة، وتحكم في درجة الحرارة لجهاز الفحص. بدوره على المكونات الضرورية وضبط الإعداد على درجة الحرارة مقاولاتoller حتى ميزان الحرارة تقارير القيمة المطلوبة. وقد تم جمع البيانات الواردة في هذه المقالة عند 25 درجة مئوية، ولكن يمكن أيضا أن إجراء قياسات في RT أو في 28.5 درجة مئوية.
- توصيل الكابلات من محفز لجهاز الفحص. بدوره على السلطة إلى محفز ولكن لا تحفز اليرقة حتى الخطوة 5.6.
- تأكد من اليرقة موازية للأسفل القاعة. من خلال الهدف 40X، عرض جزء من اليرقة بين نهايات الأنابيب. إذا موازية لأسفل، وسوف طرفي يرقة يكون في التركيز. إذا لزم الأمر، وضبط أنبوب محول القوة على طول المحور Z حتى طرفي هي في التركيز.
- تحقق من أن طول اليرقة هو أقصر من المستوى الأمثل. بدوره على نظام قسيم عضلي طول الفيديو وتدوير كاميرا الفيديو مثل أن التصدعات موازية لجانبي الإطار الفيديو. هذا النظام يراقب تباعد العتابي من خلال تحليل الاختلافات في كثافة بكسل على طول كل صف أفقي من بكسل داخل المنطقة المعرفة من قبل المستخدم من الفائدة(ROI). وبلغ متوسط النتائج لجميع الصفوف داخل ROI وذكرت مع تردد يعادل الفيديو معدل الإطار (≥ 80 ثانية -1). يتم استخدام تباعد العتابي كمؤشر على طول قسيم عضلي.
- ضبط المجهر التركيز على الألياف الطرفية ثم لاحظ طول قسيم عضلي المشار إليه. إذا لزم الأمر، استخدم جهاز تحديد المواقع XYZ تعلق على وحدة تحكم لضبط طول طول اليرقة (X-محور) حتى طول قسيم عضلي أقل من المستوى الأمثل (على سبيل المثال 1.90 ميكرون).
- ضبط التحفيز الحالية لتحسين قوة نشل. للبدء، تعيين الانتاج الحالي على محفز لحجم منخفض (مثل 100 مللي أمبير). يمكن أن تسبب مشجعا يدويا أو بواسطة جهاز كمبيوتر تشغيل برنامج ابفيف العرف. استثارة للعضلات نشل اليرقات مع نبض الحالية من 0.2 ميللي ثانية في المدة.
- استخدام الذبذبات لتسجيل الإخراج القوة وقياس قوة نشل ذروة استخدام المؤشرات والذبذبات و. زيادة التيارزيادات بنسبة 50 مللي أمبير وقياس قوة نشل الذروة في كل مستوى الحالي. انتظر 30 ثانية بين تشنجات لمنع التعب. كما يزيد من التحفيز الحالية، قوة نشل الذروة يزيد عادة إلى حد أقصى ثم يتناقص تدريجيا. التيار الذي اليرقة يولد أعظم قوة هو التيار التحفيز الأمثل. تعيين السعة الحالية للتيار التحفيز الأمثل.
- باستخدام جهاز تحديد المواقع XYZ، وضبط طول اليرقة (وبالتالي، طول قسيم عضلي) من أجل انتزاع قوة نشل أقصى. البرية من نوع اليرقات الزرد (3-7 DPF) توليد قوة نشل أقصى في أطوال قسيم عضلي من 2.10 ميكرومتر أو 2.15 ميكرومتر. ومع ذلك، فإن طول قسيم عضلي يمكن تعيين إلى 2.08 ميكرون إلى تجنب إجهاد الزائد على يرقة.
- استثارة للعضلات نشل اليرقات. استخدام الذبذبات لتسجيل استجابة القوة وحفظ السجل لتحليلها لاحقا.
6. قياس الأبعاد مع الجهاز العضلي اليرقة في طول الأمثل
Representative Results
في صحية من النوع البري اليرقات الزرد، يجب أن تكون الألياف العضلية موازية لبعضها البعض دون ثغرات كبيرة بينها وبين ديك التصدعات واضح (الشكل 5A). يجب التخلص من النوع البري اليرقات الزرد التي لا تظهر هذه الميزات، أو يعانون من تلف واضح مثل ألياف منفصلة (الشكل 5B)،.
ويرد مؤامرة ممثل القوة نشل الذروة مقابل التحفيز الحالية ليرقة واحدة الزرد في الشكل (6). لمن النوع البري اليرقات الزرد بين 3-7 DPF، والحالي التحفيز الأمثل هو عادة بين 400-600 مللي أمبير، مع 3 DPF اليرقات التي تتطلب عموما أكبر التحفيز الحالية من 6-7 يرقات DPF.
البيانات قوة الخام (التي تم جمعها خلال الخطوة 5.8) لابد من معالجتها وتحليلها مع برامج تحليل البيانات. أولا، يتم تعيين خط الأساس من المحضر قوة الى نقطة الصفر. ثانيا، يتم تحويل الجهد الناتج من محول القوة لإجبار (مN) (انظر تعليمات الشركة الصانعة لإنشاء منحنى المعايرة لمحول القوة). ويرد ردا قوة ممثل جمعها خلال انكماش نشل القصوى من يرقة واحدة في الشكل 7. برامج تحليل البيانات يمكن أن تستخدم لقياس ذروة القوة والميزات الأخرى للاستجابة قوة.
يتم عرض مجموعة تمثيلية من بيانات القوى الذروة من تقلصات نشل القصوى في الشكل 8A. نموذجي ذروة القيم قوة نشل لمن النوع البري 3-7 DPF مجموعة اليرقات 0،9-1،7 مليون، مع اليرقات الأكبر سنا توليد المزيد من القوة من اليرقات الأصغر سنا. يمكن أن الاختلافات في قوة نشل الذروة يكون راجعا إلى العمليات العادية مثل النمو والتنمية (الشكل 8) أو عمليات غير طبيعية مثل الجينات علم الأمراض المتصلة طفرة 21،22.
تطبيع من قبل العضلات منطقة مستعرضة (CSA) يمكن استخدامها لتحديد الدرجة التي الاختلافات في قوة نشل الذروة هي ببساطة بسبب اح الامتحانات التنافسية الوطنية في حجم عضلات 21،22. ويمكن تقدير CSA العضلات باستخدام الصيغة: CSA = π (A / 2) (ب / 2)، حيث A هو ارتفاع الجهاز العضلي كما ينظر اليها من الجانب، B هو عرض عضلات كما ينظر إليها من أسفل، ويفترض على المقطع العرضي بيضاوي الشكل. القيم النموذجية لCSA البرية من نوع 3-7 DPF مجموعة اليرقات 0،027-0،034 مم 2، 3-4 مع يرقات DPF تظهر عموما القيم CSA أصغر من 5-7 يرقات DPF. يتم عرض مجموعة تمثيلية من تطبيع بيانات القوى الذروة من تقلصات نشل القصوى في 8B الشكل. نموذجي تطبيع الذروة القيم قوة نشل لمن النوع البري 3-7 DPF مجموعة اليرقات 34-51 مليون / مم 2، 4-7 مع يرقات DPF تظهر عموما القيم أكبر من 3 DPF اليرقات.
الشكل 1. نقطة حلقة خياطة. سهام إلى ذيول حلقة خياطة.
الشكل 2. (A) جهاز الفحص مع مكونات المسمى. (ب) آراء عن قرب للغرفة التجريبية (أ) غرفة التجريبية مع أسفل شفافة. (ب) محول القوة. (ج) وحدة تحكم طول. (د) أجهزة تحديد المواقع XYZ. يتم تعريف X، Y، Z والفؤوس في الزاوية اليمنى العليا. (ه) نظام التحكم في درجة الحرارة باستخدام وحدات الحرارية. أنابيب يستوعب تدفق المياه للتبريد وحدات الحرارية. (و) غير القابل للصدأ أنابيب الصلب تعلق لإجبار محول. (ز) غير القابل للصدأ أنابيب الصلب المرفقة إلى وحدة تحكم طول. (ح) مسبار مجهري ميزان الحرارة. (ط) البلاتين أقطاب لوحة موازية، والتي تمتد على طول الغرفة. لوحات البلاتين 2.5 ملم عالية و0.255 مم.
الشكل (3). ربط اليرقة إلى الغرفة التجريبية. (A) اليرقة تعادل في في نهاية الأمامي ولكن ليس استدارت حتى الآن 90 درجة. (B) اليرقة بعد استدارت 90 °. (C) اليرقة تعادل في في نهاية الخلفي ولكن ليس استدارت حتى الآن. (D) بعد اليرقة يتم قطع ذيول حلقة استدارت وخياطة.
الشكل 4. قياسات مستعرضة تقدير المنطقة. الجهاز العضلي كما ينظر اليها من (A) والجانب (B) ز> أسفل. موضع الحانات الحمراء تشير إلى موقع افتتاح البولي التناسلي. طول الحانات الحمراء تشير إلى ارتفاع وعرض الجهاز العضلي كما ينظر اليها من الجانب وأسفل على التوالي.
الشكل 5. عرض الوحشي من الزرد اليرقات عضلات الجذع. (A) الأنسجة السليمة. (B) الأنسجة مع تلف واضح. يتم وضع علامة التقلصات الناتجة عن مفارز الألياف مع العلامات النجمية.
الشكل (6). مؤامرة ممثل القوة نشل الذروة مقابل التحفيز الحالية. التيار التحفيز الأمثل هو 500 مللي أمبير.
E = "دائما"> 
الرقم 7. وقد أثارت سجل القوة ممثل للانكماش نشل واحدة. هذا الانكماش مع نبض التحفيز في 0 مللي ثانية. قوة ذروة 1.56 مليون.
الرقم 8. بيانات القوى ممثل 3-7 DPF اليرقات. (A) بيانات القوى الذروة من تقلصات نشل القصوى. (B) بيانات القوى الذروة من تقلصات نشل القصوى لتطبيع CSA. كانوا من كبار السن اليرقات (6-7 DPF) بنك الاحتياطي الفيدرالي Hatchfry Encapsulon الصف 0 مع سبيرولينا (الفضي المختبرات) اعتبارا من يوم 5 DPF. الوسائل + يتم الإبلاغ عن الانحرافات المعيارية مع N = 5 في كل مجموعة. يشار إلى مجموعات مختلفة بشكل ملحوظ من 3 يرقات DPF (*) و 4 يرقات DPF (#) (أنوفا، P <0.05). الزيادة الكبيرة في قوة تطبيع بين 3 و 4 DPF (B) يدل على وجود زيادة في القوة الجوهرية قدرة توليد خلال هذه الفترة الزمنية، في حين وتعزى الزيادة في القوة بين 4 و 6-7 DPF (A) إلى النمو على أساس لا تغيير 4-7 DPF في قوة تطبيع.
Discussion
يقيس هذا الأسلوب في توليد القوة أثناء نشل لتقييم وظيفة عضلة في عضلات الجذع من اليرقات الزرد. على الرغم من تقلصات كزازي يمكن استخلاصها في اليرقات الزرد (على سبيل المثال بنسبة 200 التحفيز البقول / ثانية لمدة 0.2 ثانية)، القوة كزازي الحد الأقصى هو فقط 10-15٪ أكبر من قوة نشل أقصى. ولذلك، فإن القوة المتولدة أثناء نشل هو مقياس معقول من القدرة على توليد قوة. ويفضل أكثر من تشنجات تقلصات كزازي بسبب تشنجات هي أقل احتمالا للتسبب تمزيق أو الانزلاق في العلاقات خياطة.
من أجل توليد بيانات ذات مغزى مع هذه التقنية، ينبغي أن يتحقق قوة نشل أقصى لكل يرقة وينبغي التقليل من التباين بين المجموعات التجريبية. مع هذه الأهداف في الاعتبار، ونحن نقدم الاقتراحات التالية. الأول، اتخاذ الحذر عند ربط اليرقة إلى محول القوة وأنابيب تحكم طول. إذا يتم شد الحلقات خياطة جدامن ذلك بكثير، فإن خياطة قطع طريق الأنسجة العضلية. إذا لم يتم إحكام حلقات خياطة بما فيه الكفاية، والقوة المتولدة من يرقة لن تنتقل بالكامل إلى محول القوة. كلتا الحالتين، ولكن خصوصا الأخير، نقلل من قوة نشل أقصى. الثانية، منذ اختبار مجموعات تجريبية متعددة يمكن أن يستغرق عدة ساعات (20-30 دقيقة / يرقة)، بالتناوب بين المجموعات لأن يرقات سوف تستمر في النمو خلال فترة الاختبار.
في حين أن بعض المعدات المذكورة أمر ضروري لقياس القوة نشل أقصى (على سبيل المثال محول القوة، مشجعا الحالية)، والبنود الأخرى ليست ضرورية على الإطلاق. وقسيم عضلي نظام طول الفيديو هو مرغوب فيه ولكن ليس المطلوب. وكبديل لذلك، سلسلة من تشنجات يمكن استخدامها للعثور على طول الأمثل، وخلالها يتم ضبط طول اليرقة حتى يتم تحقيق أقصى قدر من قوة نشل. نظام التحكم في درجة الحرارة هو أيضا ليس ضروريا على الاطلاق. التحكم في درجة الحرارة أمر بالغ الأهمية عندما MEAsuring حركية نشل، التي تعتبر حساسة للغاية لدرجة الحرارة، في حين أن قوة نشل أقصى ليست حساسة بشكل خاص للتغيرات طفيفة في درجة الحرارة ويمكن أن يقاس في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أنه بغض النظر عن درجة الحرارة في مقصورة خلال اختبار القوة، ينبغي الحفاظ على اليرقات في درجة الحرارة المثلى للنمو من 28.5 ° C 24 قبل فرض اختبار لانطلاق دقيقة.
ويتم اختبار اليرقات في حل Tyrodes تحتوي على تريكين. نحن نستخدم 0.02٪ (W / V) تريكين، وتركيز أوصى للتخدير 24، للقضاء على تقلصات عفوية أثار من قبل الجهاز العصبي، وبالتالي منع التعب أثناء اختبار قوة. يسهل تريكين أيضا التعادل في خطوة ويقلل من وقت الاختبار الشامل. ومع ذلك، فإننا نلاحظ أن تريكين بما في ذلك في حل الاختبار باستمرار يقلل من قوة نشل أقصى ما يقرب من 30٪. كما لوحظ تأثير مماثل في العضلات الذيل الشرغوف، حيث tricaiشمال شرق خفض توليد قوة بعد أن منعت انتقال العصبية والعضلية، مما يوحي بأن تريكين له تأثير مباشر على العضلات 25. تريكين قد يقلل من استثارة الخلايا العضلية عن طريق الحد من تصرف الصوديوم عبر غشاء الخلية، كما هو الحال في الخلايا العصبية 26. خيارات أخرى لمنع تفعيل من قبل العصبونات الحركية هي D-توبوكورارين وα-بنغاروتوكسين ولكن، على عكس تريكين، هذه المركبات ليست قابلة للاختراق الجلد، ويجب أن يتم حقنه مباشرة في الرأس والحبل الشوكي، أو قلب 27. سوف تحتاج المحققين الفردية لتقييم ما إذا كان أو لا تريكين أمر مرغوب فيه لتطبيقها محددة. إذا تم تضمين تريكين في حل الاختبار، ويجب أن يكون تركيز متسقة بين التجارب والباحثين وينبغي التحقق من أن تأثير تريكين لا تختلف بين المجموعات التجريبية.
وصفنا هذه الطريقة ليرقات لا تزيد أعمارهم عن 3 DPF وقديمة قدم 7 DPF. على الرغم من ألياف العضلات يبدو أن فوnctional في أقرب وقت 17 ساعة بعد الإخصاب، عندما تبدأ حركات عفوية ذيل 27، وطول قصيرة من الذيل قبل يعيق 3 DPF ربط اليرقة إلى معدات الاختبار. نحن عادة لا اختبار اليرقة بعد 7 DPF منذ العديد من النماذج المرض لا يعيش لفترة أطول بكثير من هذا الوقت. إذا اختبار اليرقات خارج 5 DPF، ويجب أن تغذى اليرقات. وقد لاحظنا أن اليرقات unfed ديك العضلات الصغيرة وتوليد قوة نشل أقل من الحد الأقصى لتغذية اليرقات، على الأرجح بسبب تناقص الكيس المحي. وبالتالي قد يكون من المرغوب فيه لاختبار اليرقات بين 3-5 DPF، لتجنب متغير إضافية من التغذية الخارجية.
وباختصار، نحن تصف طريقة الكمي وموثوق بها لقياس قوة جيل خلال انكماش نشل القصوى من الزرد العضلات الجذع اليرقات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم الصحة العامة للعضلة اليرقات الزرد وعلى وجه التحديد المعلومات حول وظيفة العضلات. بالإضافة إلى توفير المعلومات حولحجم توليد القوة، وهذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة حركية جيل القوة أو تكييفها لدراسة العضلات والتعب 22. على الرغم من أننا وصف هذه التقنية للاستخدام مع البرية من نوع اليرقات، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في يرقات المعدلة وراثيا أو ليرقات تعامل مع العقاقير أو المواد السامة، لتوصيف نماذج مرض في العضلات وتقييم العلاجات، أو لدراسة تنمية العضلات، اصابة في العضلات، أو العضلات المتصلة السمية الكيميائية.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
المؤلفان بالشكر أنجيلا بوستا للحصول على المساعدة مع الزرد تربية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (AG-020591 إلى SVB و1K08AR054835 إلى JJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EQUIPMENT | |||
| Nonsterile-suture | Ashaway Line Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
| Force transducer |  Aurora Scientific |
400A | |
| Length controller | Aurora Scientific |
318B | |
| XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
| Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
| Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
| Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
| Stimulator | Aurora Scientific |
701C | High-power, follow stimulator |
| Video sarcomere length system | Aurora Scientific |
900B-5A | |
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
| Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
| Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences | ||
References
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Nixon, S. J., Wegner, J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14 (13), 1727-1743 (2005).
- Hall, T. E., Bryson-Richardson, R. J., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. PNAS. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Hirata, H., Watanabe, T., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134, 2771-2781 (2007).
- Dowling, J. J., Vreede, A. P., et al. Loss of myotubularin function results in t-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5 (2), e1000372 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Hall, T. E., Lieschke, G. J., Currie, P. D. Dystrophin-deficient zebrafish feature aspects of the Duchenne muscular dystrophy pathology. Neuromuscul. Disord. 20 (12), 826-832 (2010).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum. Mol. Genet. 19 (4), 623-633 (2010).
- Wallace, L. M., Garwick, S. E., et al. DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo. Ann. Neurol. 69, 540-552 (2011).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum. Mol. Genet. , (1093).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. PNAS. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J. Cell Mol. Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Seger, C., Hargrave, M., Wang, X., Chai, R. J., Elworthy, S., Ingham, P. W. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Dev. Dyn. 240, 2440-2451 (2011).
- Postel, R., Vakeel, P., Topczewski, J., Knöll, R., Bakkers, J. Zebrafish integrin-linked kinase is required in skeletal muscles for strengthening the integrin-ECM adhesion complex. Dev. Biol. 318 (1), 92-101 (2008).
- Zoeller, J. J., McQuillan, A., Whitelock, J., Ho, S. Y., Iozzo, R. V. A central function for perlecan in skeletal muscle and cardiovascular development. J. Cell Biol. 181 (2), 381-394 (2008).
- Kim, H. R., Ingham, P. W. The extracellular matrix protein TGFBI promotes myofibril bundling and muscle fibre growth in the zebrafish embryo. Dev. Dyn. 238, 56-65 (2009).
- Beqqali, A., Monshouwer-Kloots, J., et al. CHAP is a newly identified Z-disc protein essential for heart and skeletal muscle function. J. Cell Sci. 123 (7), 1141-1150 (2010).
- Huang, H., Huang, C., et al. Toxicity, uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid (PFOS). Aquat. Toxicol. 98 (2), 139-147 (2010).
- Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).
- Chandrasekar, G., Arner, A., Kitambi, S. S., Dahlman-Wright, K., Andersson-Lendahl, M. Developmental toxicity of the environmental pollutant 4-nonylphenol in zebrafish. Neurotoxicol. Teratol. 33 (6), 752-764 (2011).
- Buss, R. R., Drapeau, P. Activation of embryonic red and white muscle fibers during fictive swimming in the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 87 (3), 1244-1251 (2002).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Arbogast, S., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135 (4), 1115-1127 (2012).
- Dou, Y., Andersson-Lendahl, M., Arner, A. Structure and function of skeletal muscle in zebrafish early larvae. J. Gen. Physiol. 131, 445-453 (2008).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , Univ. of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Herr, V. D., Sonnenburg, D. C., Courogen, P. M., Fiamengo, S. A., Downes, H. Muscle weakness during tricaine anesthesia. Comp Biochem Physiol Part C. 110 (3), 289-296 (1995).
- Frazier, D. T., Narahashi, T. Tricaine (MS-222): effects of ionic conductances of squid axon membranes. Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
