Summary
이 실험의 목적은 감쇠의 성장과 유전자 발현 역학 양적 시간 코스 데이터를 생성하는 것입니다
Abstract
이 실험의 목적은 감쇠 S.의 성장과 유전자 발현 역학 양적 시간 코스 데이터를 생성하는 것입니다 종양 내부 성장 티피 뮤 리움 박테리아 식민지.
우리는 인간의 난소 암 세포주의 피하 주사, OVCAR-8 (NCI DCTD 종양 저장소 프레 더릭, 메릴랜드).에 의해 생쥐 모델 이종 이식 종양을 생성
우리는 S.의 감쇠 균주를 형질 전환 시각화 2 플라스미드 구조적 표현 루시 페라 제 (luxCDABE)와 함께 : 티피 뮤 리움 균 (SL1344 phoPQ-1 ELH430). 마우스 1 본질적으로 비 독성을 유지하면서 이러한 긴장은 특히 종양을 식민지.
측정 종양이 설립되었다되면, 박테리아는 용량을 변화와 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사 하였다. 종양의 지역화, 박테리아 유전자 발현을 사용하여 60시간의 과정을 통해 실시간으로 측정 하였다생체 내 이미징 시스템 (IVIS)합니다. 각 시점에서, 종양은 균질화, 절제, 유전자 발현 데이터와 상관 관계 세균성 식민지를 정량을 도금했다.
함께,이 데이터는 종양 안에 성장 박테리아의 생체 성장과 유전자 발현 역학의 정량적 측정을 얻을 수 있습니다.
Introduction
합성 생물학은 지난 십 년간 급속하게 진행되고 지금은 에너지와 건강에 중요한 문제에 영향을 배치됩니다. 그러나, 임상 분야 진출은 안전 문제 및 생체 내 유전자 회로의 설계 기준을 개발 부재로 둔화되었다. 높은 충격 의료 애플리케이션을 가속화하여 의료 인프라, 제어 실험실 설정 이외의 기능 유전자 회로, 안전하고 임상 승인 미생물 호스트와 직접 인터페이스 방법을 활용해야합니다.
균주의 수는 종양에서 우선적으로 성장 할 수있는 능력으로 인해 암 치료에 조사되었다. 이들은 C.을 포함 novyi, E. 대장균, V. cholorae, B. longum의, 그리고 S. 티피 뮤 리움 3-8. S. 그들은 9-12 인간의 임상 실험의 숫자에 안전성과 내성을 전시 것처럼 티피 뮤 리움 특히 관심을 생성했습니다. 이 bacteri 처음에 숙주 면역 체계의 자극을 통해 암 세포의 신진 대사에 필요한 영양소의 결핍에 의한 항 종양 효과를 만들 보였다. 치료화물의 생산은 이후 유전자 변형을 통해 추가되었습니다. 이 연구는 종양 치료를위한 박테리아의 사용에 중요한 진보를 대표하는 동안, 기존의 노력의 대부분은 일반적으로 높은 복용량, 오프 대상 효과 및 호스트 저항 13-16 개발의 배달 결과 높은 수준의 표현에 의존 .
이제, 합성 생물학 고급 감지 및 배달 17-20을 수행 할 수 계산 설계 유전자 회로를 이용하여 프로그래밍화물의 생산을 추가 할 수 있습니다. 이 회로는 종양 특정 자극하고 필요한 자기 조절화물의 생산을 감지 배달 시스템으로 작동하도록 설계 할 수 있습니다. 그러나 생체 내에서 이러한 회로의 기능을 공부하는 것은 지금까지 도전하고있다.
플라스미드 합성 회로를위한 공통 프레임 워크입니다 ve_content "> 때문에, 우리는 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 플라스미드 기반의 유전자 발현의 역학을 특성화하는 방법을 설명합니다.이 방법은 시간 경과 발광 이미징 및 생체 분포의 정량적 측정을 사용합니다. 함께, 이러한 접근은 임상 응용을위한 생체 내에서 플라스미드 기반의 네트워크를 공부하기위한 프레임 워크를 제공합니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 세포의 준비
- 표준 세포 배양 기술을 사용하여 통과 세포주. 이 실험에서, 우리는 OVCAR-8 세포 (NCI DCTD 종양 저장소 프레 더릭, 메릴랜드)를 사용. - 100 % 80 자랄 대상으로 세포를 성장.
- 5 분 5 ML 트립신으로 세포를 배양 한 후 + FBS는 트립신을 비활성화하는 5 ML RPMI 매체를 추가합니다.
- 혈구에 수확 수를 셀. 5 × 10 7 세포 / ㎖, 또는 플라스크 당 200 μL의 목표 농도에서 페놀 레드없는 DMEM에 resuspend을.
- 15 % 감소 성장 인자 마트 리젤 (BD Biosciences의)를 추가 주입까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
2. 종양 이식
- isoflurane을 3 %를 사용 사주 오래 된 여성 NCR / 뉴 쥐를 마취 깊은 마취를 보장하기 위해 약 5 분을 기다립니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
- 1 ML의 주사기에 세포 (종양 당 100 μL)을로드하고 27 연결 1/ 2 게이지 바늘.
- 두 양측 후방 측면 주사 부위의 각각에 대해 텐트를하고 기지에 세포를 주입하는 집게로 부드럽게 피부를 들어 올립니다. 혈액을 생산, 너무 깊이 침투하지 않도록주의하십시오. 가볍게 튀어없이 주사기를 제거하는 핀셋을 사용합니다.
- 2 종양의 직경까지 - 20 일 - 4mm에 도달 할 때 10 일간 종양의 성장을 모니터링 할 수 있습니다.
3. 박테리아 준비
- -80 C 냉동고 주식 또는 냉장 판에서 3 ML LB 미디어 + 암피실린 박테리아의 하룻밤 문화를 시작합니다. 이 실험에서, 우리는 S를 사용 티피 뮤 리움 균주 ELH430 (SL1344 PhoPQ - 로랑 -).
- 아침에 필터링 LB에 문화 1:100 희석 OD600 0.4로 증가 - 0.6.
- 스핀 다운 및 인산염에 3 회 세척 식염수 (PBS)는 버퍼와 0.1의 최종 OD600 (1 X 10 7 세포 / ML 약)에 resuspend을.
4. 박테리아 주입
- 동물을 마취꼬리가 지배적 인 손을 향해 가리키는 측면에서 D 위치. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
- 따뜻한 물이나 가열 램프를 사용하여 꼬리 정맥을 팽창.
- 1 ML의 주사기에서 박테리아 (마우스 당 100 μL)을로드하고 90도 이상 그냥 작은 팁을 구부립니다.
- 꼬리 정맥에 주사기 끝을 맞추고 얕은 깊이 (아무런 저항을 느끼지한다)에 침투하고, 박테리아를 주입. 성공적으로 주입 혈류 변위를 관찰합니다.
5. 마우스 이미지
- 유도 챔버에있는 동물을 마취 후 이미징 플랫폼에서 각 마우스를 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. 시점 사이의 정량적 인 결과를 보장하기 위해 정확한 위치를 유지합니다.
- IVIS 스펙트럼 이미징 시스템 (캘리퍼스 생명 과학)를 사용하여 이미지 동물. 그들 사이 영상 1 개 이상의 동물, 장소 라이트 배리어 간 ILLU을 방지하는 경우mination. 동물은 박테리아의 현지화를 확인하기 위해 복부 측면에 먼저 몇 군데해야합니다.
- 이미지 동물 dorsally 실험 (36 시간) 동안 IVIS마다 2 시간 사용. 특정 ROI에 대한 시간 경과를 생성합니다.
6. 세균 생체 분포를 정량화
- 흡수성 기저귀의 뒷면에 CO 2와 장소를 사용하여 동물을 안락사.
- 두 개의 뒷다리 측면 피하 종양을 노출하는 동물을 켭니다. 종양을 분리하고 제거하는 주변의 피부 조직을 잘라. 핀셋으로 종양을 잡고, 역 가위의 움직임을 사용하여 피부를 제거합니다. 피부의 대부분이 분리되었을 때, 완전히 핀셋을 사용하여 종양을 제거합니다.
- 미리 무게의 microcentrifuge 튜브에 기관을 배치합니다. 이 튜브의 질량이 크게 달라질 수 있기 때문에 정량적 인 결과를 미리 무게를하는 것이 중요합니다.
7. 세균 생체 분포를 정량화
- 각 시점, 소비세에 대한 그리고 종양의 무게.
- 500 μL PBS + 15 % 글리세롤을 추가하고 조직 Tearor (BioSpec)를 사용하여 균질화. 샘플 간의 에탄올로 균질화 3 번 씻어.
- 직렬 희석 및 세균성 식민지 계산을위한 격판 덮개를 생성합니다. 하나의 플레이트 사용 전 단면 플레이트에 플레이트 여러 희석한다.
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Representative Results
이 프로토콜을 사용하여, 우리는 종양 표적 박테리아의 생체 성장과 유전자 발현 역학에 데이터를 생성 할 수 있습니다. 전체적인 흐름은 그림 1에 요약되어 있습니다.
첫 번째 단계에서, 우리는 발광 (블루) 기자 등으로 유전자 발현을 측정하는 IVIS를 사용하여 동물을 박테리아를 주입 (녹색) 및 이미지.
그런 다음, 두 번째 단계에서, 우리 소비세는, 균질화, 그리고 식민지 카운트에 대한 플레이트 종양은 종양의 성장 박테리아의 수를 결정합니다.
균주에 의해 생성 된 생물 발광은 시각화하여 IVIS (그림 2)입니다. 5 × 10 5 정도의 최소 정착 용량 (그림 2A)를 주입 용량과 신호 증가. 모든 경우에, 감쇠 박테리아는 어느 특정 종양을 식민지화하거나 마우스에서 성장하는 데 실패 할 수 있습니다. 신호가 normali에 생기 단위를 사용하여 정량화10 ^ 6 이상 전형적인 값이 식민지의 지표로 노출 시간에 대한 ZE.
주어진 감염 24-48 시간 (그림 2B)에 시간 신호 증가합니다. 피크 발병 주사 후 약 36 시간이지만, 타이밍 사용되는 균주 및 플라스미드에 따라 달라질 수 있습니다. 정량적 인 결과를 보장하기 위해 마우스를 매번 정확히 같은 방식으로 배치해야합니다.
실험의 다음 세트에서 세균 biodistrution은 시간이 지남에 박테리아의 성장 (그림 3)를 측정하는 계량입니다. 종양에 가능한 박테리아는 시리얼 희석 (그림 3A)에서 종양 도금을 절개하고 균질화에 의해 정량화된다. 다른 기관도 마찬가지로 정량화 할 수있다. 종양 비장 비율이 세균의 특이도 21, 22의 전형적인 측정이기 때문에 여기에서, 우리는 비장를 사용했습니다.
이 수는 우리가 박테리아 인구를 측정 할 수시간이 지남에 TION (그림 3B). 왼쪽에, 우리는 배치 배양 실험에서보다 훨씬 느리게 1-3 시간의 두배 시간으로, 실험 기간 내내 박테리아의 수는 종양 꾸준히 성장할 것을 볼 수 있습니다. 이 감소 비율은 가능성이 종양 환경의 빈약 한 영양 상태에 의한 것입니다. 오른쪽에, 우리는 종양 비장 비율을 정량화하고 실험을하는 동안 증가한다는 것을 관찰했다. 이 발견은 박테리아가 종양 성장을 계속하면서 비장 카운트는 기본적으로 일정한한다는 점에서 특이성을 보여줍니다.
그림 1. 전체 실험 과정의 개략도. () 박테리아가 꼬리 정맥에 주입하고 구체적으로 종양을 식민지화하고 있습니다. (B) 각 시점에서 종양 절제하는,균질화, 그리고 식민지 카운트를 위해 도금. 권한이 25 일 재판. 저작권 2012 미국 화학 학회.
그림 2. 전체 - 동물의 발광 이미징은 IVIS를 사용하여. () 주입 용량 그리고 (b) 시간 증가를 신호. 권한을 25으로 적응. 저작권 2012 미국 화학 학회.
그림 3. 성장 역학을 측정하는 도금과 식민지 카운트. () 시리얼 희석 개별 식민지를 대표하는 비장 샘플 (아래)에 대해 계산 될 수 있습니다. (b)는 이러한 조사를 수행함으로써, 우리는 종양 내부의 박테리아의 생체 인구 대책 만들 수 있습니다 ( B에서와 같이 </ strong>을 비장 비율) (C에서 같은)와 플라스미드이없는 셀 수와 종양 (D에서와 같이). 권한을 25으로 적응. 저작권 2012 미국 화학 학회.
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Discussion
이 절차를 사용하여, 우리는 종양을 식민지화 박테리아의 성장과 유전자 발현 역학 시간 코스를 생성 할 수 있습니다. 이러한 측정은 정기적으로 일괄 문화 나 마이크로 유체 장치에서 체외에서 수행하는 동안, 그들은 생체 내에서 수행하기가 훨씬 더 어렵습니다.
이러한 메서드에 적용 할 수있는 몇 가지 수정이 있습니다. 우리는 우리의 마우스 모델을 생성하는 OVCAR-8 세포주를 사용하면서, 다른 세포 라인의 수는 동등하게 사용할 수 있습니다. 예를 들어, luciferized 세포 라인은 종양 및 세균 루시퍼 채널 3D colocalization을 위해 허용하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 양자 뒷다리 측면 모델, 다른 번호와 주사 부위의 위치를 사용하는 동안 또한, 서로 다른 현상을 연구하는 모델을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 종양의 크기가 중요한 변수이며, 세포의 시리얼 희석을 준비 할 수 있으며, 스말를 생성, 동시에 다른 사이트로 주입LER과 큰 크기의 종양. 마지막으로, 우리는 S를 사용하면서 균의 typhimurium 균주 ELH430, S.의 다른 변종 티피 뮤 리움 또는 C와 같은 다른 박테리아 주입 박테리아 수를 조정해야 할 수도 있지만 novyi는 E. 대장균, V. cholorae, B. longum의는 이러한 방법으로 동등하게 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 마우스 암 모델의 작성 및 세균의 준비 및 사출을 포함하고 있습니다. 암 모델 생성을 위해, 세포 수와 농도, 주입량, 및 주입 사이트 배치 정밀도는 크게 생성 된 종양의 일관성을 향상시킬 것입니다. 우리는 동등의 크기, 모양 및 배치 종양이 가장 정량적으로 비교 데이터를 만들 것으로 나타났습니다. 박테리아의 준비를 위해, 완전히 주입하기 전에 그 (것)들을 세척하고 조심스럽게 세균의 농도, 양 및 주사 사이트에 대한 제어하는 것이 중요합니다. 이 단계는 아보 필요합니다주사의 ID 과도한 면역에 미치는 영향, 별도의 마우스 모델 사이의 정량적 인 비교를 유지합니다. 종양을 입력 박테리아의 숫자가 주입 된 용량의 작은 부분이기 때문에, 마우스 사이에 주입 된 박테리아의 수의 변화는 식민지의 진행에 극적인 차이가 발생할 수 있습니다. 자세한 내용은 생체 연구 3, 4의 정량에 대한 세균의 준비에 몇 가지 추가 자료를 참조하십시오
이러한 기술은 특정 연구의 다양한 높은 적응력 있지만, 몇 가지 제한 사항이 특정 응용 프로그램을 확장하기위한 존재한다. 예를 들어, 높은 박테리아 수의 정맥 배달 면역 학적 영향으로 인해 특정 박테리아 및 / 또는 마우스 모델 바람직하지 않을 수 있습니다. 행정의 하나의 대안 경로는 경구 전달 (위관), 주피터 23에 설명되어 있습니다 기술입니다. 또한, 시간 경과 영상은 매우 노동 집약적 인 시험편에 따라 할 수 있습니다사용 가능한 FIC 실험 길이, 시간 해상도 및 장비. 이미징 프로세스를 자동화하면 이러한 부담을 많이 완화뿐만 아니라 새로운 기술적 과제를 소개한다. 이러한 심장 박동, 호흡 속도, 온도와 같은 마우스 바이탈 지속적으로 추가 장비에 의해 감시되어야한다. 또한, 장기 마취, 눈 연고가 적절한 수분을 유지하는 데 사용되어야합니다. 마지막으로, 마우스에 전달 마취의 수준이 지속적으로 마취의 적절한 깊이를 유지하기 위해 조정해야합니다. 마취 배달 마우스 중요한 측정을 통합하는 폐쇄 루프 피드백 제어 시스템은 크게이 과정을 촉진한다.
합성 생물학은 생체 내 응용 프로그램을 설계 유전자 회로를 적용 많은 성공 17, 19, 20, 달성하면서 설계 원칙을 알리기 위해 생체 시간 과정의 정량적 필요합니다. S.는 티피 뮤 리움 임상 합성 생화학을위한 우수한 균주이다암 치료를위한 OGY는 E. 비슷하기 때문에 대장균은 특히 종양을 정착하고, 인간의 임상 실험 6, 12, 14, 22 안전 표시되었습니다. 또한, 최근의 연구는 많은 게시 된 회로 S.에서 작동하는지 발견 수정 24없이 티피 뮤 리움. 여기에 설명 된 실험 플랫폼을 사용하여, 우리는 최근 플라스미드 벡터 25의 고유 한 불안정성을 사용하여 프로그래밍 할 수있는 방법을 동적 생체 내 발현 프로파일의 설명. 또한, 최근의 연구는 안정적으로 생체 23 플라스미드 벡터를 유지하기위한 새로운 방법을 개발했다.
루시퍼는 감도 5 생체 내 이미징에 사용되는 일반적인 기자 있지만, GFP 26를 사용하여 생체 내 유전자 발현의 정량에 우수한 연구 사례가있다. GFP를 사용하여 연구자가 생체 내에서 개별 박테리아의 공간적 시간적 역학을 연구 할 수있다.또한,하는 동안 우리는 암의 관련성이 모델쪽으로 이러한 연구가 추가로 예측 능력 7 증가 할 확장, 피하 모델을 사용 하였다. 이 같은 미래의 연구는 임상 응용을위한 생체 합성 생물학의 다음 세대를 가능하게 할 수 있습니다.
콘서트에서 모두 실험 및 전산 기법을 개발하는 것은 생체 내 유전자 회로 설계에 중요합니다. 전산 모델링을 빠르게 잠재적 인 출력을 탐구하는 시스템 매개 변수를 조사 할 수 있지만 관련 유지 밀접하게 실험 결과에 묶여 있어야합니다. 지금까지, 이러한 결과는 일부에서 생체 내에서 유전자 회로를 공부하는 방법의 부족으로 인해, 정량적으로 얻기 어려운되었습니다.
이 플랫폼 구축, 미래의 애플 리케이션은 더 종양 특정 자극과 자기 조절화물 제품을 감지, 표현 역학의 범위를 확장 설계 유전자 회로를 포함한다필요가 이온. 생체 회로 증가에 이러한 정교함으로, 양적 데이터에 대한 요구 사항은 그들도 증가 조정해야합니다. 우리는 장기 마우스 이미징의 새로운 혁신과 함께,이 과정을 가능하게 할 것이다, 여기에서 설명한 방법 믿습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 원고의 중요한 읽기 및 편집 H. 플레밍 감사합니다. 이 작품은 Misrock 박사 학위 취득 후 친교 (TD) 및 NDSEG 졸업 교제 (AP)에 의해 지원되었다. SNB는 HHMI 탐정이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
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