Summary
O objetivo desses experimentos é gerar dados de curso de tempo quantitativos sobre o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de atenuado
Abstract
O objetivo desses experimentos é gerar dados de curso de tempo quantitativos sobre o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de S. atenuada colônias bacterianas typhimurium crescimento dentro dos tumores.
Geramos um modelo de xenoenxerto de tumores em ratos, por injecção subcutânea de uma linha de células de cancro do ovário humano, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).
Nós transformado cepas atenuadas de S. bactérias typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) com a luciferase expresso constitutivamente (luxCDABE) plasmídeo para visualização 2. Estas estirpes colonizar especificamente tumores, permanecendo essencialmente não virulento para o rato 1.
Uma vez que os tumores eram mensuráveis estabelecido, as bactérias foram injectados por via intravenosa através da veia da cauda, com diferentes doses. Tumor-localizada, a expressão do gene bacteriano foi monitorizado em tempo real, ao longo de 60 horas utilizando umsistema de imagem in vivo (IVIS). Em cada ponto de tempo, os tumores foram excisados, homogeneizados e plaqueados para quantificar colónias bacterianas para a correlação com dados de expressão de genes.
Juntos, estes dados produz uma medida quantitativa do crescimento in vivo de expressão do gene e da dinâmica do crescimento de bactérias no interior de tumores.
Introduction
A biologia sintética progrediu rapidamente na última década e agora está posicionada para influenciar importantes problemas de energia e saúde. No entanto, a expansão na arena clínica tem sido retardado por questões de segurança e ausência de desenvolvimento de critérios de projeto para em circuitos genéticos in vivo. Acelerar aplicações médicas de alto impacto vai exigir a utilização de métodos que interagem diretamente com a infra-estrutura médica, circuitos genéticos que funcionam fora do ambiente de laboratório controlado, e hospedeiros microbianos seguras e clinicamente aceito.
Um certo número de estirpes têm sido investigados para a terapia do cancro devido à sua capacidade para crescer preferencialmente em tumores. Estes incluíram C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, e S. typhimurium 3-8. S. typhimurium tem gerado interesse particular como eles exibiram segurança e tolerância em um certo número de ensaios clínicos em humanos 9-12. Estes bactericida um foram inicialmente mostrado para criar efeitos anti-tumorais através da estimulação do sistema imunitário do hospedeiro e pela depleção de nutrientes necessários para o metabolismo de células do cancro. Produção de carga terapêutica foi adicionado mais tarde através de modificações genéticas. Embora estes estudos representam avanços importantes no uso de bactérias para as terapias do tumor, a maioria dos esforços actuais têm confiado na expressão de alto nível, que normalmente resulta na entrega de doses elevadas, os efeitos fora do alvo, e do desenvolvimento de resistência do hospedeiro 13-16 .
Agora, a biologia sintética pode adicionar a produção de carga programável, utilizando circuitos genéticos computacionalmente desenhados que podem executar detecção avançadas e entrega 17-20. Estes circuitos podem ser concebidas para funcionar como sistemas de entrega que detectam estímulos específicos de tumores e auto-regulam a produção de cargas, conforme necessário. No entanto, o estudo da função destes circuitos in vivo tem sido até agora difícil.
ve_content "> Desde plasmídeos são o quadro comum para circuitos sintéticos, nós descrevemos um método para caracterizar a dinâmica da expressão gênica baseada em plasmídeo in vivo utilizando um modelo de mouse. Estes métodos utilizam imagens luminescência time-lapse e medição quantitativa de biodistribuição. Juntos, essas abordagens fornecem uma estrutura para o estudo de redes baseadas em plasmídeo in vivo para aplicações clínicas.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação celular
- Linhagens de células utilizando técnicas de cultura de células padrão. Neste experimento, foi utilizado OVCAR-8 células (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Crescer as células-alvo a uma confluência de 80-100%.
- Incubar as células em 5 ml de tripsina durante 5 min, em seguida, adicionam-se 5 ml de meio RPMI + FBS para inactivar a tripsina.
- Células colheita e contar com um hemocitômetro. Ressuspender em DMEM livre de fenol vermelho em uma concentração alvo de aproximadamente 5 x 10 7 células / ml, ou cerca de 200 mL por frasco.
- Adicionar 15% de redução do fator de crescimento Matrigel (BD Biosciences) e manter a suspensão de células em gelo até a implantação.
2. Implantação do Tumor
- Anestesiar quatro semanas femininos Ncr / Nu ratos velhos que usam 3% isoflurano e esperar cerca de 5 min para garantir a anestesia profunda. Use pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia.
- Carregar as células (100 ul por tumor) numa seringa de 1 ml e anexar uma 27 1/ 2 agulha de calibre.
- Para cada um dos dois locais de injecção flanco traseiras bilaterais, levantar a pele suavemente com uma pinça para fazer uma tenda e injectar células na base. Tome cuidado para não penetrar muito profundamente, produzindo sangue. Use uma pinça para remover suavemente a seringa sem respingos.
- Controlar o crescimento do tumor por dia, durante 10 - 20 dias até um diâmetro de tumor de 2-4 mm, é alcançado.
3. Bactérias Preparação
- Iniciar uma cultura durante a noite de bactérias em 3 ml de LB + ampicilina mídia a partir de um estoque C -80 congelador ou placa refrigerada. Neste experimento, utilizou-se S. typhimurium estirpe ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
- Na manhã seguinte, dilui-se a cultura de 1:100 em LB filtrou-se e crescer a DO600 0,4-0,6.
- Girar e lavar 3 vezes em tampão fosfato salino (PBS) e ressuspender em definitivo uma DO600 de 0,1 (cerca de 1 x 10 7 células / ml).
4. Bactérias Injection
- Anestesiar o animal umd posição de lado, com a cauda apontada para sua mão dominante. Use pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia.
- Dilatar a veia da cauda com água morna ou uma lâmpada de calor.
- Carregar as bactérias (100 ul por rato) numa seringa de 1 ml e dobrar a ponta apenas menos do que 90 graus.
- Alinhar a ponta da seringa com a veia da cauda, penetrar a uma profundidade rasa (deve sentir nenhuma resistência), e injectar bactérias. Observe o deslocamento bloodflow para uma injeção de sucesso.
5. Rato de imagem
- Anestesiar animais na câmara de indução seguida, coloque cada mouse sobre a plataforma de imagem. Use pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia. Manter o posicionamento preciso para assegurar resultados quantitativos entre os pontos temporais.
- Animais de imagem usando o sistema de imagem IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences). Se uma imagem mais do que um lugar de animais, barreiras de luz entre eles para evitar cross-illuminação. Os animais devem ser fotografada em primeiro lugar no lado ventral para confirmar a localização de bactérias.
- Imagem de animais dorsalmente usando IVIS a cada 2 horas, para a duração da experiência (36 horas). Gerar um campo de tempo para um dado ROI.
6. Quantificar Biodistribution bacteriana
- Eutanásia animais usando CO 2 e colocar na parte de trás em uma fralda absorvente.
- Ligue o animal para expor os dois flancos traseiros tumores subcutâneos. Cortar o tecido da pele circundante, para separar e remover os tumores. Segurando o tumor com uma pinça, retire a pele com um movimento tesoura invertida. Quando a maior parte da pele foi separada, a remover completamente o tumor, usando uma pinça.
- Coloque os órgãos em microtubos pré-pesados. Uma vez que a massa destes tubos pode variar significativamente, é importante pré-pesar de resultados quantitativos.
7. Quantificar Biodistribution bacteriana
- Para cada ponto de tempo, consumo e pesar os tumores.
- Adicionar 500 ul de PBS + 15% de glicerol e homogeneizar utilizando um Tissue-Tearor (BioSpec). Lavar as homogeneizador 3 vezes com etanol entre amostras.
- Gerar diluições em série e placa para contagem de colônias de bactérias. Para prato várias diluições em uma única placa, utilizar placas pré-seccionados.
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Representative Results
Usando este protocolo, somos capazes de gerar dados sobre o crescimento in vivo e da dinâmica de expressão de genes de bactérias específicas do tumor. O fluxo de trabalho global está resumida na figura 1.
Na primeira etapa, nós injetar bactérias (verde) ea imagem do animal usando IVIS para medir a expressão do gene com luminescência (azul) como repórter.
Em seguida, na segunda etapa, de consumo, homogeneizar e tumores placa para contagens de colónias para determinar o número de bactérias que crescem no tumor.
A bioluminescência gerada por estirpes bacterianas é visualizada utilizando IVIS (Figura 2). Sinal aumenta com a dose injectada, com uma dose mínima de colonização cerca de 5 x 10 5 (Figura 2A). Em todos os casos, as bactérias vivas atenuadas são apenas capazes de colonizar ou especificamente tumores ou não conseguem crescer nos ratinhos. Sinal é quantificado utilizando unidades de radiância para normalidadeze para o tempo de exposição, em que os valores típicos de 10 ^ 6 ou mais são indicativos de colonização.
Para uma determinada infecção, sinal aumenta com o tempo, mais de 24-48 horas (Figura 2B). O aparecimento de pico é de cerca de 36 horas após a injecção, mas o tempo pode variar dependendo da estirpe e do plasmídeo a ser usado. Certifique-se de posicionar o mouse exatamente da mesma maneira cada vez para garantir resultados quantitativos.
No próximo conjunto de experiências, biodistrution bacteriana é quantificado para medir o crescimento das bactérias ao longo do tempo (Figura 3). Bactérias viáveis nos tumores são quantificados através da excisão e homogeneizar o tumor e plaqueamento em diluições em série (Figura 3A). Outros órgãos também pode ser quantificado de forma semelhante. Aqui, nós utilizamos o baço, uma vez que a proporção de tumor baço é uma medida da especificidade típica bacteriana 21, 22.
Estas contagens nos permitem medir a população bacterianação ao longo do tempo (Figura 3B). No lado esquerdo, pode-se ver que o número de bactérias crescem constantemente no tumor durante a duração da experiência, com um tempo de duplicação de 1-3 horas, substancialmente mais lento do que em experiências de cultura de lote. Esta taxa reduzida é provavelmente devido às más condições de nutrientes no ambiente do tumor. À direita, temos quantificada a proporção de tumor no baço e observar que ela aumenta ao longo do experimento. Esta descoberta demonstra a especificidade, na medida em que as contagens no baço são essencialmente constantes, enquanto as bactérias continuam a crescer no tumor.
Figura 1. Esquema do processo experimental geral. (A) As bactérias são injectados na veia de cauda e, especificamente, colonizar tumores. (B) Em cada ponto de tempo, os tumores são excisadas,homogeneizado, e semeadas para contagem de colônias. Reproduzido com permissão 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
Figura 2. Imagem luminescência todo o animal com IVIS. (A) sinal aumenta com a dose de injeção e (b) tempo. Adaptado com permissão 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
Figura 3. Chapeamento e colônia conta para medir a dinâmica de crescimento. (A) diluições seriadas permitir colônias individuais a serem contados para uma amostra representativa do baço (em baixo). (B) Ao seguir estes aspectos, podemos criar em medidas in vivo da população de bactérias no interior dos tumores ( como em b </ Strong>) do número de células com e sem o plasmídeo (como em c), e o tumor em relação ao baço (como em d). Adaptado com permissão 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
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Discussion
Usando este procedimento, somos capazes de gerar campos de tempo para o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de bactérias que colonizam tumores. Embora estas medições são rotineiramente realizados in vitro em cultura descontínua ou dispositivos microfluidics, eles são muito mais difíceis de executar in vivo.
Há diversas modificações que podem ser aplicadas a estes métodos. Quando foi utilizado o OVCAR-8 de linha de células para gerar os modelos de rato, um número de outras linhas de células podem ser utilizadas de forma equivalente. Por exemplo, as linhas celulares luciferized podem ser utilizados que permitem a co-localização dos canais de 3D luciferase tumorais e bacterianas. Além disso, enquanto foi utilizado um modelo de flanco posterior bilateral, um diferente número e localização dos pontos de injecção pode ser utilizado para gerar modelos para estudar fenómenos diferentes. Por exemplo, se o tamanho do tumor é uma variável importante, diluições em série de células pode ser preparada e injectada a diferentes locais ao mesmo tempo, gerando smalLER e tumores de maior porte. Finalmente, enquanto que foi utilizado S. typhimurium cepa ELH430, outras cepas de S. typhimurium ou de outras bactérias tais como C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, pode ser utilizado de forma equivalente com estes métodos, embora as contagens bacterianas para injecção podem precisar de ser ajustadas.
Os passos mais críticos neste protocolo envolve a criação do modelo de cancro do rato, e a preparação e a injecção de bactérias. Para a criação do modelo de cancro, a precisão na contagem de células e concentração, o volume de injecção, e a colocação no local de injecção irá aumentar a consistência dos tumores gerados. Encontraram-se que os tumores de tamanho equivalente, em forma, e colocado criar os dados mais quantitativamente comparáveis. Para a preparação de bactérias, é crítico para lavar completamente as mesmas antes da injecção e para controlar a concentração de bactérias, o volume, e no local de injecção cuidadosamente. Essas etapas são necessárias para avoID excessiva impacto imunológico da injecção, e para manter a comparação quantitativa entre distintos modelos do rato. Uma vez que o número de bactérias que entram no tumor é uma pequena fracção da dose injectada, em variações do número de bactérias injectadas entre ratos pode resultar em grandes diferenças na progressão da colónia. Para informações adicionais, ver várias referências adicionais sobre a preparação bacteriana quantitativa para estudos in vivo, 3, 4,
Embora essas técnicas são altamente adaptável a uma variedade de estudos específicos, existem algumas limitações para estender a certas aplicações. Por exemplo, a administração intravenosa de contagem bacteriana elevadas poderão não ser desejável para certas bactérias e / ou modelos de rato, devido ao impacto imunológico. Uma via alternativa de administração é a administração oral (gavagem), uma técnica que é descrita na JOVE 23. Além disso, a imagem de lapso de tempo pode ser bastante trabalhoso, dependendo da especificidadeduração da experiência fic, resolução de tempo e equipamentos disponíveis. Automatizando o processo de imagem iria aliviar muitos desses encargos, mas também introduz novos desafios técnicos. Sinais vitais do mouse, como a frequência cardíaca, frequência respiratória, temperatura e deve ser continuamente monitorado por equipamento adicional. Além disso, para a anestesia de longo prazo, pomadas oftálmicas devem ser utilizados para manter a humidade adequada. Finalmente, o nível de anestesia entregue ao dispositivo deve ser continuamente ajustada para manter a profundidade da anestesia adequada. Um sistema de controle de feedback de circuito fechado que integra medições vitais do mouse com a entrega anestésico facilitaria enormemente esse processo.
Enquanto a biologia sintética tem conseguido muito sucesso 17, 19, 20, aplicando-se os circuitos de genes projetados para aplicações in vivo exigirá quantitativa, em cursos de tempo vivo para informar os princípios de design. S. typhimurium é um excelente esforço para biol sintético clínicagia para a terapia do cancro, uma vez que é semelhante à E. coli, coloniza especificamente tumores, e foi mostrado seguro em ensaios clínicos humanos de 6, 12, 14, 22. Além disso, estudos recentes descobriram que muitos circuitos publicados funcionar em S. typhimurium 24 sem modificação. Usando a plataforma experimental aqui descrito, foi descrito recentemente como dinâmica em perfis de expressão in vivo pode ser programado usando a instabilidade inerente dos vectores de plasmídeo de 25. Além disso, pesquisas recentes desenvolvidos novos métodos para manter de forma estável vectores plasmídeos in vivo 23.
Enquanto um repórter da luciferase é comum utilizado para imagem in vivo para a sua sensibilidade 5, há exemplos de excelentes estudos sobre quantitativas na expressão de genes in vivo utilizando GFP 26. Usando GFP permitiria ao pesquisador estudar a dinâmica espaço-temporal de bactérias individuais in vivo.Além disso, enquanto nós usamos um modelo subcutâneo, estendendo-se em direção a esses estudos modelos mais relevantes de câncer aumentaria ainda mais o seu poder preditivo 7. Futuros estudos como este pode permitir que uma nova geração de em biologia sintética vivo para aplicações clínicas.
Desenvolvimento de ambas as técnicas experimentais e computacionais em concerto será fundamental para engenharia em circuitos genéticos in vivo. Modelagem computacional pode sondar rapidamente os parâmetros do sistema para explorar as saídas possíveis, mas devem permanecer intimamente ligada aos resultados experimentais para permanecer relevante. Até agora, os resultados têm sido difíceis de obter quantitativamente, em parte devido à falta de métodos para estudar circuitos genéticos in vivo.
Com base nesta plataforma, aplicações futuras incluem circuitos de genes modificados que aumentam ainda mais a gama de dinâmica de expressão, sentindo os estímulos específicos de tumor e de auto-regulação de produtos de cargaion, conforme necessário. Como a sofisticação destes circuitos in vivo aumenta, os requisitos de dados quantitativos necessário ajustá-las também irá aumentar. Acreditamos que os métodos descritos aqui, junto com inovações em imagem a longo prazo mouse, vai tornar esse processo possível.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos H. Fleming para a leitura crítica e edição do manuscrito. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de Pós-Doutorado Misrock (TD) e NDSEG graduação comunhão (AP). SNB é um investigador HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
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