Summary
这些实验的目的是产生定量的时间 - 过程的减毒的生长和基因表达的动力学数据
Abstract
这些实验的目的是产生定量的时间-过程数据的生长和基因表达动力学的减毒S.鼠伤寒沙门氏菌的细菌菌落生长肿瘤内。
我们生成的模型移植瘤小鼠皮下注射人类卵巢癌细胞株OVCAR-8（NCI DCTD肿瘤仓库，弗雷德里克，MD）。
我们转化减毒菌株的鼠伤寒沙门氏菌细菌（ELH430：SL1344 phoPQ 1）组成性表达的荧光素酶（luxCDABE）质粒的可视化2。这些菌株专门殖民肿瘤基本上是无毒的，而其余的鼠标1。
一旦建立可测量的肿瘤，细菌具有不同的剂量经尾静脉静脉注射。肿瘤局部，细菌基因表达的实时监控，60小时使用的过程在体内成像系统（IVIS）。在每个时间点，肿瘤被切除，匀浆，接种相关基因表达数据的定量细菌菌落。
总之，这种数据产生在体内生长和生长肿瘤内的细菌的基因的表达动力学的定量测量。
Introduction
合成生物学进展迅速，在过去的十年中，现在的定位是影响能源和健康的重要问题。然而， 体内遗传电路开发设计标准的安全问题，并没有扩展到临床上已放缓。加快高影响医疗应用将需要利用接口直接与医疗基础设施，遗传受控的实验室环境以外的电路，功能，安全和临床公认的微生物宿主的方法。
优先在肿瘤生长的能力，由于癌症治疗研究已进行了一些菌株。这些都包含C. novyi，大肠杆菌，V. cholorae，长双歧杆菌 ，和S。鼠伤寒沙门氏菌S. 3-8。 鼠伤寒沙门氏菌产生了特别令人感兴趣的，因为他们已经在数9-12的人体临床试验显示出安全性和耐受性。这些细菌学一个最初创建的抗肿瘤效果，通过刺激宿主的免疫系统和癌细胞代谢所需的营养物质的耗竭。通过基因修改，后来又增加治疗货物的生产。虽然这些研究的重要进展，在肿瘤的治疗中使用的细菌，多数依靠现有努力的高水平表达，通常会产生高剂量的交付，脱靶效应，与主机发展的阻力13-16 。
现在，合成生物学可能会增加可编程的货物生产，利用设计计算遗传电路，可以执行先进的传感和交付17-20。这些电路可被设计为作为检测肿瘤特异性刺激自律和货物的生产必要的运输系统。然而，研究这些电路在体内的功能迄今一直具有挑战性。
由于质粒ve_content“>合成电路的共同框架中，我们描述了一种基于质粒的基因表达在体内使用的小鼠模型的动态特性的方法，这些方法利用时间推移发光成像和定量测量的生物分布。一起这些方法提供了一个框架， 在体内的临床应用研究基于质粒网络。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。细胞的制备
- 使用标准的细胞培养技术的传代细胞系。在这个实验中，我们使用OVCAR-8细胞（NCI DCTD肿瘤库，冯检基，MD）。细胞生长到目标汇合的80 - 100％。
- 用5ml胰蛋白酶消化5分钟孵育细胞，然后加入5 ml RPMI培养基+ FBS的胰蛋白酶失活。
- 收获和血球计数细胞。重悬于无酚红的DMEM中，在目标浓度为5×10 7个细胞/ ml，或约200微升每烧瓶。
- 添加15％降低生长因子基底膜（BD Biosciences公司），并保持细胞悬液植入直到冰。
2。肿瘤植入
- 4周龄雌性NCR /怒江小鼠的使用3％的异氟醚麻醉并等待大约5分钟，以确保麻醉过深。兽医软膏，防止肌肤干燥，而在麻醉状态下对眼睛。
- 负载的细胞（100微升每个肿瘤）的1毫升注射器，附加27 1/ 2压力表针。
- 对于每两个双边的后侧翼注射部位，用钳子轻轻提起皮肤做一个帐篷，并注入细胞基底部。小心不能刺入过深，产生血液。使用镊子轻轻取出注射器没有飞溅。
- 2 - 4毫米的肿瘤直径为10 - 20天，直到达到每天监视肿瘤生长。
3。活菌制剂
- 过夜培养的细菌在3毫升LB培养基+氨苄青霉素-80℃冰柜股票的或冷冻板。在这个实验中，我们使用了S。鼠伤寒沙门氏菌株ELH430（SL1344 PhoPQ AROA）。
- 早晨，培养1:100稀释过滤LB和成长OD600 0.4 - 0.6。
- 旋转，并洗涤3次，在磷酸盐缓冲盐水（PBS），重悬在终OD 600为0.1（约1×10 7个细胞/ ml）。
4。菌素注射液
- 麻醉动物D位置在其一侧用尾巴指向你的惯用手。兽医软膏，防止肌肤干燥，而在麻醉状态下对眼睛。
- 尾静脉扩张，用温水或热灯。
- 负载的细菌（每只小鼠100微升），在1毫升注射器，只是小于90度的弯曲的前端。
- 尖尾静脉注射器对准，穿透深度浅（应该感到无阻力），并注入细菌。对于一个成功的注射观察血流量位移。
5。鼠标成像
- 麻醉动物感应室，然后将每个鼠标成像平台上。兽医软膏，防止肌肤干燥，而在麻醉状态下对眼睛。保持精确的定位，以确保时间点之间的定量结果。
- 图片动物使用IVIS频谱成像系统（卡尺生命科学）。如果为超过1动物，地方光他们之间的障碍，以防止交叉亮起的税款。动物应首先成像于腹面，确认本地化细菌。
- 图片动物背侧使用IVIS每隔2小时的实验的持续时间（36小时）。生成一个时间过程，对于一个给定的投资回报率。
6。量化细菌体内的分布
- 使用CO 2的吸收性尿布的背面上，并将其置于动物安乐死。
- 将动物暴露两后肢的侧翼皮下肿瘤。剪切周围的皮肤组织，为了分离，除去肿瘤。控股肿瘤用镊子去除皮肤使用一个反相剪刀运动。当大部分的皮肤已经分开，完全切除肿瘤，用小镊子。
- 放置在预先称重的微量离心管中的器官。由于这些管的质量可以显着不同，重要的是要预先称重定量结果。
7。量化细菌体内的分布
- 对于每一个时间点，消费税和重的肿瘤。
- 加入500μlPBS + 15％甘油和均质使用一个组织（BioSpec）的Tearor的。冲洗3次，用乙醇样品之间的均化器。
- 生成序列稀释和菌落计数板。板多单盘上使用预先切片板稀释。
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Representative Results
使用这个协议中，我们能够产生的肿瘤靶向细菌在体内生长和基因表达的动力学数据。在图1中概括的全部工作流程。
在第一阶段中，我们注入细菌（绿色）和图像的动物使用IVIS发光（蓝色）作为一个记者来衡量基因表达。
然后，在第二阶段中，我们的消费税，均质化，和菌落计数板肿瘤的数量来确定在肿瘤生长的细菌。
细菌菌株所产生的生物发光是用IVIS（ 图2）。信号增加时，与注入的剂量，以最小的定植剂量约5×10 5（ 图2A）。在所有情况下，只能够减毒细菌要么专门殖民肿瘤或不能生长在小鼠。用辐射单位的归量化信号泽为曝光时间，典型值10 ^ 6或更高表示定植。
对于一个给定的感染，信号随时间增加，超过24到48小时（ 图2B）。发病高峰为注射后36小时左右，但时间可能取决于所使用的菌株和质粒上。确保将鼠标完全相同的方式，以确保每次定量结果。
在下一组的实验，细菌biodistrution的定量测量了细菌的生长（ 图3）随着时间的推移。存活的细菌在肿瘤切除和均质的系列稀释液（ 图3A）的肿瘤，电镀量化。其他器官也可以同样进行量化。这里，我们已经使用脾，由于肿瘤脾比细菌特异性21，22是一个典型的措施。
让我们这些计数测量细菌种群随着时间的推移重刑（ 图3B）。在左侧，我们可以看到，稳步增长，在肿瘤的细菌数量在整个实验期间，与倍增时间为1-3小时，大大慢于在分批培养实验。这减少的速度很可能是由于肿瘤环境中的营养条件较差。在右边，我们已经量化肿瘤脾比，并观察整个实验过程中，它增加。这一发现表明特异性，脾数量基本上是恒定的，而细菌在肿瘤继续增长。
图1。整个实验过程的示意图（一）细菌在尾静脉注射，具体殖民肿瘤。（二）在每个时间点，肿瘤切除，匀浆，镀菌落计数。转载与许可25。版权所有2012年美国化学学会。
图2。全动物发光成像使用IVIS（一）信号随注入剂量及（b）的时间。改编许可25。版权所有2012年美国化学学会。
图3。电镀和菌落计数来衡量经济增长的动力。（a）串行稀释允许单个菌落计数的代表脾样本（底部），（b）根据这些罪名，我们可以创建在肿瘤内的细菌在体内人口措施（在b </>带和不带质粒（c）中）的细胞数和肿瘤脾比（d）中。改编许可25。版权所有2012年美国化学学会。
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Discussion
使用此过程中，我们是能细菌的肿瘤的生长和基因表达的动态课程生成时间。虽然这些测量的常规在体外进行分批培养或微流体装置中，它们是更难以执行在体内 。
有几种修改，可以应用这些方法。虽然我们使用OVCAR-8细胞系，以产生我们的小鼠模型，也可以使用一些其他的细胞系等价。例如，可用于luciferized细胞系，允许肿瘤和细菌荧光素酶通道的三维共定位。另外，虽然我们使用一个双侧后肢侧翼模型，不同数量和注射部位的位置可被用来生成模型来研究不同的现象。例如，如果肿瘤的大小是一个重要的变量，细胞的系列稀释液来制备，并同时注入到不同的网站，生成阿小礼的LER和更大尺寸的肿瘤。最后，虽然我们使用了S。鼠伤寒沙门氏菌 ，其他菌株的菌株ELH430 鼠伤寒沙门氏菌或其他细菌如C novyi大肠杆菌，cholorae，长双歧杆菌可以被等同地使用这些方法，虽然可能需要进行调整，注射用的细菌计数。
在这个协议中最关键的步骤涉及建立的小鼠癌症模型，并编制和注射液的细菌。癌症模型的创建，细胞计数和浓度，注射量，注射部位的位置精度将大大提高肿瘤产生的一致性。我们已经发现，等效尺寸，形状，并置于肿瘤创造最定量比较的数据。对于细菌的制备中，关键是完全冲洗在注射之前，并对其进行控制的细菌浓度，体积和注射部位仔细。这些步骤都必须避免id值过度免疫注射的影响，并保持单独的小鼠模型之间的定量比较。由于进入肿瘤的细菌的数量的一小部分的注射剂量，注入老鼠之间的细菌数量的变化可以导致菌落进展的巨大差异。有关其他信息，请参阅一些额外的参考细菌制剂体内研究3，4，定量
虽然这些技术是适应性强的多种具体研究，存在一定的局限性，延伸到目标应用程序。例如，静脉交付大量细菌可能不是可取的某些细菌和/或鼠标型号由于免疫的影响。一个可供选择的给药途径是口服给药（管饲法），朱庇特23描述一种技术，它。此外，时间推移成像能相当劳力密集根据规定FIC实验长度，时间分辨率和设备。自动成像过程中对这些负担会减轻许多，但也引入了新的技术挑战。小鼠重要器官，如心脏率，呼吸率和温度，必须连续监测由额外的设备。此外，对于较长期的麻醉，眼用软膏，必须用于保持充足的水分。最后，传递到鼠标的麻醉剂的水平必须被连续地调整，以维持适当的麻醉深度。一个封闭的闭环反馈控制系统，集成了鼠标的重要测量麻醉分娩将极大地促进这一进程。
尽管合成生物学已经取得了很大的成功17，19，20，应用基因工程电路体内应用将需要定量， 在体内作用时间的课程设计原则通知。S.鼠伤寒沙门氏菌是一个极好的应变临床合成生物学用于癌症治疗，因为它是类似于大肠杆菌 OGY 大肠杆菌 ，特别是寄生的肿瘤，并已被证明在人类临床试验6，12，14，22的安全。此外，最近的研究发现，许多已发表 的电路功能在S鼠伤寒沙门氏菌无需修改24。使用这里描述的实验平台，我们最近描述了如何动态在体内表达谱可以进行编程，使用固有的不稳定性质粒载体25。此外，最近的研究开发的新方法稳定地保持在体内 23的质粒载体。
虽然荧光素酶是一种常见的用于活体成像 ，其灵敏度5记者，有优良的研究的实例，使用绿色荧光蛋白26 在体内的基因表达定量。利用GFP将允许研究者研究个别细菌在体内的时空动态。此外，虽然我们采用皮下模型，这些研究朝着更相关的癌症模型延伸将进一步增加其预测能力7。未来像这样的研究可能使下一代在体内合成生物学的临床应用。
开发实验和计算技术在音乐会将体内遗传电路工程的关键。计算模型能迅速探测系统参数，发掘潜在产出，但必须保持紧密联系在一起的实验结果保持相关性。到目前为止，这些结果已经很难获得定量的，部分原因是由于缺乏用于研究基因在体内的电路的方法。
在这个平台的基础上，未来的应用将包括基因电路设计表达的动态范围进一步扩大，检测肿瘤特异性的刺激和自我调节的货物产品所需要的离子。由于在体内的电路增加的复杂性的要求，需要定量数据，以调整它们也将增加。我们相信，这里描述的方法，随着新的创新，在长期的鼠标成像，使该过程可能。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢H.弗莱明批判性阅读和编辑的稿件。这项工作是由Misrock博士后奖学金（TD）和NDSEG研究生奖学金（AP）的支持。 SNB是一个霍华德休斯医学研究所研究员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
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