Summary
Le but de ces expériences est de générer des données temps-parcours quantitatives sur la croissance et la dynamique de l'expression des gènes des atténué
Abstract
Le but de ces expériences est de générer des données temps-parcours quantitatives sur la croissance et la dynamique de l'expression des gènes de S. atténué colonies bactériennes typhimurium croissance à l'intérieur des tumeurs.
Nous avons généré des modèles de xénogreffes de tumeurs chez la souris par injection sous-cutanée d'une lignée de cellules de cancer ovarien humain, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).
Nous avons transformé des souches atténuées de S. bactéries typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) avec une luciférase exprimée de façon constitutive (luxCDABE) plasmide pour la visualisation 2. Ces souches colonisent spécifiquement les tumeurs tout en restant essentiellement non virulente pour la souris 1.
Une fois les tumeurs mesurables ont été établis, les bactéries ont été injectés par voie intraveineuse via la veine queue avec dosage variable. La tumeur localisée, l'expression du gène bactérien a été suivie en temps réel au cours de 60 heures en utilisant undans le système d'imagerie in vivo (IVIS). A chaque instant, les tumeurs ont été excisés, homogénéisés, et étalées pour quantifier colonies bactériennes pour la corrélation avec les données d'expression génique.
Ensemble, ces données donne une mesure quantitative de la croissance in vivo et la dynamique de l'expression des gènes des bactéries qui se développent à l'intérieur des tumeurs.
Introduction
La biologie synthétique a progressé rapidement au cours de la dernière décennie et est maintenant positionné à l'impact des problèmes importants dans l'énergie et la santé. Cependant, l'expansion dans le domaine clinique a été ralentie par des problèmes de sécurité et l'absence d'élaborer des critères de conception pour les circuits génétiques in vivo. Accélération des applications médicales à fort impact, il faudra utiliser des méthodes qui s'interfacent directement avec les infrastructures médicales, les circuits génétiques qui fonctionnent en dehors de l'environnement de laboratoire contrôlé, et les hôtes microbiens sûrs et cliniquement acceptée.
Un certain nombre de souches ont été étudiés pour le traitement du cancer en raison de leur capacité à se développer de manière préférentielle dans les tumeurs. Celles-ci ont inclus C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum et S. typhimurium 3-8. S. typhimurium a suscité un intérêt particulier car ils ont montré la sécurité et la tolérance dans un certain nombre d'essais cliniques humains 9-12. Ces bacteri un été initialement montré pour créer des effets anti-tumoraux par la stimulation du système immunitaire de l'hôte et de l'épuisement des nutriments nécessaires au métabolisme des cellules cancéreuses. La production de marchandises thérapeutique a été ajouté plus tard grâce à des modifications génétiques. Bien que ces études représentent des avancées importantes dans l'utilisation de bactéries pour les thérapies tumorales, la majorité des efforts actuels se sont appuyés sur l'expression de haut niveau qui se traduit généralement par la livraison des doses élevées, les effets hors-cible, et le développement de la résistance de l'hôte 13-16 .
Maintenant, la biologie synthétique peut ajouter la production de marchandises programmable en utilisant des circuits génétiques calcul conçues qui peuvent effectuer la détection et la livraison 17-20 avancés. Ces circuits peuvent être conçus pour agir en tant que systèmes de distribution qui détectent des stimuli spécifiques de la tumeur et l'auto-régulation de la production de marchandises que nécessaire. Cependant, l'étude de la fonction de ces circuits in vivo a été jusqu'ici difficile.
ve_content "> Depuis plasmides sont le cadre commun pour les circuits de synthèse, nous décrivons une méthode pour caractériser la dynamique de l'expression génique à base de plasmides in vivo utilisant un modèle de souris. Ces méthodes utilisent l'imagerie de luminescence time-lapse et la mesure quantitative de biodistribution. Ensemble, ces approches fournissent un cadre pour l'étude des réseaux à base de plasmide in vivo pour des applications cliniques.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation des cellules
- des lignées de cellules de passage en utilisant des techniques de culture cellulaire standard. Dans cette expérience, nous avons utilisé-8 OVCAR cellules (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Cultiver des cellules vers une cible confluence de 80 - 100%.
- Incuber les cellules avec 5 ml de trypsine pendant 5 min, puis ajoutez 5 ml de milieu RPMI + FBS pour inactiver la trypsine.
- Récolte des cellules et compter sur un hématimètre. Remettre en suspension dans phénol DMEM sans rouge à une concentration cible de 5 x 10 7 cellules / ml, soit environ 200 pi par flacon.
- Ajouter 15% réduit le facteur de croissance Matrigel (BD Biosciences) et maintenir la suspension de cellules sur la glace jusqu'à l'implantation.
2. Implantation de la tumeur
- Anesthésier femelles âgées de 4 semaines NCR / Nu souris en utilisant 3% d'isoflurane et attendre environ 5 min à assurer une anesthésie profonde. Appliquer une pommade pour vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
- Chargez les cellules (100 pi par la tumeur) dans une seringue de 1 ml et joindre un 27 1/ 2 aiguille de la jauge.
- Pour chacun des deux sites d'injection de flanc arrière bilatéraux, soulevez délicatement la peau avec des pinces pour faire une tente et injecter des cellules à la base. Veillez à ne pas pénétrer trop profondément, la production de sang. Utilisez des pinces pour enlever délicatement la seringue sans éclaboussures.
- Surveiller la croissance tumorale par jour pendant 10 à 20 jours, jusqu'à un diamètre tumoral de 2 - 4 mm est atteint.
3. Préparation des bactéries
- Démarrer une culture de nuit de bactéries dans 3 ml de LB + ampicilline médias à partir d'un -80 ° C stock congélateur ou une plaque réfrigérée. Dans cette expérience, nous avons utilisé S. typhimurium souche ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
- Dans la matinée, diluer le 1:100 culture en LB filtré et croître à DO600 0.4 - 0.6.
- Isoler et laver 3 fois dans un tampon phosphate salin (PBS) et remettre à une finale DO600 de 0,1 (environ 1 x 10 7 cellules / ml).
4. Les bactéries Injection
- Anesthésier l'animal d'uneposition D sur le côté avec la queue pointant vers votre main dominante. Appliquer une pommade pour vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
- Dilater la veine de la queue de l'eau chaude ou une lampe chauffante.
- Chargez les bactéries (100 pi par souris) dans une seringue de 1 ml et pliez la pointe un peu moins de 90 degrés.
- Aligner la pointe de la seringue avec la veine de la queue, pénétrer à une faible profondeur (il devrait se sentir aucune résistance), et injecter des bactéries. Observez le déplacement de flux sanguin pour une injection réussie.
5. Mouse Imaging
- Anesthésier les animaux dans la chambre d'admission puis placer chaque souris sur la plate-forme de formation d'image. Appliquer une pommade pour vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. Maintenir un positionnement précis pour obtenir des résultats quantitatifs entre les points dans le temps.
- animaux d'image en utilisant le système d'imagerie du spectre SIIV (Caliper Life Sciences). Si l'imagerie plus de 1 animal, un lieu barrières lumineuses entre eux pour prévenir cross-illumination. Les animaux doivent être visualisés sur le premier côté ventral pour confirmer la localisation de la bactérie.
- animaux Image dorsale utilisant SIIV toutes les 2 heures pendant toute la durée de l'expérience (36 heures). Générer un cours à temps pour un retour sur investissement donné.
6. Quantifier Biodistribution bactérienne
- Euthanasier les animaux à l'aide de CO 2 et le placer sur le dos sur une couche absorbante.
- Tourner l'animal afin d'exposer les deux tumeurs sous-cutanées de flanc arrière. Coupez le tissu de la peau environnante pour séparer et enlever les tumeurs. Tenir la tumeur avec des pincettes, enlever la peau en utilisant un mouvement de ciseaux inversé. Quand la majorité de la peau a été séparé, supprimer complètement la tumeur en utilisant des pinces.
- Placez les organes dans des microtubes pré-pesés. Comme la masse de ces tubes peut varier considérablement, il est important de pré-peser sur les résultats quantitatifs.
7. Quantifier Biodistribution bactérienne
- Pour chaque point de temps, d'accise et de peser les tumeurs.
- Ajouter 500 pi de PBS + 15% de glycérol et d'homogénéiser l'aide d'un tissu-Tearor (BioSpec). Rincer l'homogénéisateur 3 fois avec de l'éthanol entre les échantillons.
- Générer des dilutions en série et la plaque pour le comptage de colonies bactériennes. Pour plaque dilutions multiples sur une seule utilisation des plaques pré-sectionnés plaque.
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Representative Results
En utilisant ce protocole, nous sommes en mesure de produire des données sur la croissance in vivo et la dynamique de l'expression des gènes des bactéries ciblant les tumeurs. Le flux de travail global est résumé dans la figure 1.
Dans la première étape, on injecte les bactéries (en vert) et l'image de l'animal à l'aide SIIV pour mesurer l'expression du gène de luminescence (bleu) en tant que journaliste.
Puis, dans la deuxième étape, nous accise, homogénéiser, et les tumeurs de la plaque pour le nombre de colonies de déterminer le nombre de bactéries qui se développent dans la tumeur.
Bioluminescence produite par des souches bactériennes est visualisée à l'aide de SIIV (Figure 2). Signal augmente avec la dose injectée, avec un dosage colonisateur minimum autour de 5 x 10 5 (figure 2A). Dans tous les cas, les bactéries atténués ne sont capables de coloniser non plus spécifiquement les tumeurs ou ne pas se développer chez les souris. Le signal est quantifié à l'aide des unités de l'éclat à normalize pour temps d'exposition, où les valeurs typiques de 10 ^ 6 ou plus sont indicatifs de la colonisation.
Pour une infection donnée, signal augmente avec le temps de plus de 24-48 heures (figure 2B). L'apparition de pointe est environ 36 heures après l'injection, mais le temps peut varier en fonction de la souche et du plasmide utilisé. Assurez-vous de placer la souris exactement de la même façon à chaque fois pour obtenir des résultats quantitatifs.
Dans l'autre série d'expériences, biodistrution bactérienne est quantifiée afin de mesurer la croissance de bactéries dans le temps (figure 3). Bactéries viables dans les tumeurs sont quantifiés par excision de la tumeur et l'homogénéisation et le placage à des dilutions en série (figure 3A). D'autres organes peuvent aussi être quantifiés de façon similaire. Ici, nous avons utilisé la rate, puisque le ratio tumeur rate est une mesure typique de la spécificité bactérienne 21, 22.
Ces comptages permettent de mesurer la population bactériennetion dans le temps (figure 3B). Sur la gauche, nous pouvons voir que le nombre de bactéries croître régulièrement dans la tumeur pendant toute la durée de l'expérience, avec un temps de doublement de 1-3 h, sensiblement plus lent que dans les expériences de culture de lots. Ce taux réduit est probablement dû aux mauvaises conditions de nutriments dans l'environnement tumoral. Sur la droite, nous avons quantifié la proportion de tumeurs rate et observer qu'il augmente tout au long de l'expérience. Ce constat démontre la spécificité, en ce que les chefs de la rate sont essentiellement constant tandis que les bactéries continuent de croître dans la tumeur.
Figure 1. Schéma du processus expérimental global. (A) Les bactéries sont injectés à la queue-veineuse et colonisent spécifiquement les tumeurs. (B) A chaque instant, les tumeurs sont excisées,homogénéisé, et plaqué pour le nombre de colonies. Reproduit avec la permission 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
Figure 2. Imagerie de luminescence animal entier en utilisant SIIV. (A) du signal augmente avec dosage d'injection et (b) du temps. Adapté avec la permission 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
Figure 3. Placage et colonie compte pour mesurer la dynamique de croissance. (A) Des dilutions en série permettent des colonies individuelles soient comptés pour un échantillon de la rate représentant (en bas). (B) En suivant ces chefs d'accusation, nous pouvons créer des mesures de population in vivo des bactéries à l'intérieur des tumeurs ( comme en b </ Strong>) nombre de cellules avec et sans le plasmide (comme dans c) et de la tumeur au rapport de la rate (comme au point d). Adapté avec la permission 25. Copyright 2012 American Chemical Society.
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Discussion
En utilisant cette procédure, nous sommes en mesure de générer des cours à temps pour la croissance et la dynamique de l'expression des gènes des bactéries colonisant les tumeurs. Bien que ces mesures sont régulièrement effectuées in vitro en culture batch ou dispositifs microfluidiques, ils sont beaucoup plus difficiles à réaliser in vivo.
Il ya plusieurs modifications qui peuvent être appliquées à ces méthodes. Alors que nous avons utilisé la lignée cellulaire OVCAR-8 pour générer nos modèles de souris, un certain nombre d'autres lignées cellulaires peuvent être utilisés de manière équivalente. Par exemple, les lignées cellulaires luciferized peuvent être utilisés qui permettent une co-localisation 3D de chaînes luciférase bactérienne et tumorales. En outre, alors que nous avons utilisé un modèle bilatéral arrière des flancs, un numéro différent et l'emplacement des sites d'injection peut être utilisé pour générer des modèles pour étudier des phénomènes différents. Par exemple, si la taille des tumeurs est une variable importante, des dilutions en série de cellules peuvent être préparés et injectés à différents sites simultanément, générant Smaller et les tumeurs de plus grande taille. Enfin, alors que nous avons utilisé S. typhimurium souche ELH430, d'autres souches de S. typhimurium ou d'autres bactéries telles que C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum peut être utilisé de manière équivalente avec ces méthodes, bien que les comptages bactériens pour injection peuvent nécessiter un ajustement.
Les étapes les plus critiques dans ce protocole concernent la création d'un modèle de cancer de la souris, et la préparation et l'injection de bactéries. Pour la création du modèle de cancer, de la précision dans le comptage des cellules et la concentration, le volume d'injection et le placement du site d'injection permettra d'améliorer grandement la cohérence des tumeurs générées. Nous avons trouvé que les tumeurs de taille équivalente, en forme, et placé créent les données les plus quantitativement comparables. Pour la préparation de bactéries, il est essentiel de se laver complètement avant l'injection et de contrôler la concentration de bactéries, le volume et le site d'injection avec soin. Ces étapes sont nécessaires pour avoIdentifiant impact immunologique excessive de l'injection, et de maintenir comparaison quantitative entre les modèles de souris distinctes. Comme le nombre de bactéries qui pénètrent dans la tumeur est une petite fraction de la dose injectée, les variations dans le nombre de bactéries injectées entre les souris peuvent entraîner des différences considérables sur la progression de la colonie. Pour plus d'informations, voir plusieurs références supplémentaires sur la préparation bactérienne quantitative pour les études in vivo 3, 4,
Bien que ces techniques sont très adaptables à une variété d'études spécifiques, certaines limitations existent pour l'extension à certaines applications. Par exemple, l'administration intraveineuse de la numération bactérienne élevée peut ne pas être souhaitable pour certaines bactéries et / ou des modèles de souris en raison de l'impact immunologique. Une autre voie d'administration est la livraison par voie orale (gavage), une technique qui est décrite sur JoVE 23. En outre, l'imagerie time-lapse peut être assez de main-d'œuvre en fonction de la spécificationdurée de l'expérience fic, résolution temporelle, et l'équipement disponible. L'automatisation du processus d'imagerie permettrait d'atténuer bon nombre de ces charges, mais introduit également de nouveaux défis techniques. entrailles de la souris telles que le rythme cardiaque, le rythme respiratoire et la température doivent être surveillés en permanence par un équipement supplémentaire. En outre, pour l'anesthésie à plus long terme, de pommades ophtalmiques doivent être utilisés pour maintenir une humidité adéquate. Enfin, le niveau de l'anesthésique directement à la souris doit être ajusté en permanence pour maintenir la bonne profondeur de l'anesthésie. Un système de contrôle en boucle fermée qui intègre des mesures vitales de la souris avec la livraison anesthésique serait grandement faciliter ce processus.
Alors que la biologie synthétique a connu beaucoup de succès 17, 19, 20, appliquant circuits de gènes d'ingénierie pour des applications in vivo, il faudra quantitative, en cours de temps vivo pour informer les principes de conception. S. typhimurium est une excellente souche de biologie synthétique cliniquegie pour la thérapie du cancer car il est semblable à E. coli, colonise spécifiquement les tumeurs, et a été montré en sécurité dans les essais cliniques humains 6, 12, 14, 22. En outre, des études récentes ont montré que de nombreux circuits proposés fonctionnent en S. typhimurium sans modification 24. En utilisant la plate-forme expérimentale décrite ici, nous avons récemment décrit comment dynamique dans les profils d'expression in vivo peut être programmé en utilisant l'instabilité inhérente de vecteurs plasmidiques 25. En outre, des recherches récentes ont mis au point de nouvelles méthodes pour maintenir de façon stable vecteurs plasmidiques in vivo 23.
Alors que la luciférase est un journaliste couramment utilisé pour l'imagerie in vivo pour sa sensibilité 5, il ya des exemples d'excellents études sur quantitative de l'expression des gènes in vivo utilisant la GFP 26. Utilisant la GFP permettrait au chercheur d'étudier la dynamique spatio-temporelle des bactéries individuelles in vivo.En outre, alors que nous avons utilisé un modèle sous-cutanée, l'extension de ces études vers des modèles plus pertinents de cancer augmenterait encore leur pouvoir prédictif 7. Les études futures, comme cela peut permettre à une nouvelle génération de la biologie synthétique vivo pour des applications cliniques.
Développer les techniques expérimentales et numériques en concert sera cruciale pour l'ingénierie dans les circuits génétiques in vivo. La modélisation informatique peut rapidement sonder les paramètres du système pour explorer les résultats potentiels mais doit rester étroitement liée aux résultats expérimentaux pour rester pertinent. Jusqu'à présent, ces résultats ont été difficiles à obtenir quantitativement, due en partie à un manque de méthodes d'étude des circuits génétiques in vivo.
S'appuyant sur cette plate-forme, les applications futures comprendront des circuits de gène modifié qui étendent davantage la portée de la dynamique d'expression, de détection des stimuli spécifiques de la tumeur et des produits de la cargaison d'auto-régulationion si nécessaire. Comme la sophistication de ces circuits en vivo augmente, les exigences en matière de données quantitatives nécessaires pour régler leur permettra également d'augmenter. Nous croyons que les méthodes décrites ici, avec de nouvelles innovations en imagerie de la souris à long terme, rendra ce processus possible.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions H. Fleming pour la lecture et l'édition critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse postdoctorale Misrock (TD) et NDSEG bourse d'études supérieures (AP). SNB est un chercheur du HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
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