Summary
マイクロ熱泳動（MST）が広く細胞溶解物から標的タンパク質を精製することなく結合親和性の決定のために用いることができる。プロトコルは、GFP融合タンパク質、非変性条件下での細胞溶解、及びリガンドの濃度を変化させるの存在下で、MST信号の検出の過剰発現を伴う。
Abstract
タンパク質相互作用の定量的特性評価、特に生命科学、創薬の実質的にすべての分野で必要不可欠である。 K D判定の現在利用可能な方法のほとんどは、時間がかかり、高価である生成うち目的のタンパク質を精製へのアクセスを必要とする。我々は、細胞溶解物から標的タンパク質の精製をせずにマイクロ熱泳動（MST）による結合親和性の決定を可能にするプロトコルを開発した。この方法は、非変性条件下でのGFP融合タンパク質および細胞溶解の過剰発現を伴う。 STAT3-GFPへの法の適用は、一過性に初めて異なる配列を有するオリゴヌクレオチドによく研究転写因子の親和性を決定するために許可されたHEK293細胞で発現。プロトコルは、簡単であり、小分子、ペプチド、DNA、RNAとタンパク質の相互作用を研究するための、アプリケーションの様々な構造を有することができ、及びproteins。
Introduction
分子間相互作用の親和性の定量的特性評価は、生物医学研究の多くの分野において重要である。結合定数（K D）解離だけでなく、創薬に不可欠であるだけでなく、任意の生物学的システム内の任意のバイナリの相互作用の特性評価に重要なパラメータである。このような免疫沈降および酵母ツーハイブリッドスクリーニングなどのタンパク質-タンパク質相互作用の検出のために使用生化学的方法では、親和性は、この特定の複合体が、生体内で与えられた条件の下に存在するかどうかを定義しながら、それらの相互作用は、どのように締まっている私たちを上に通知していない。創薬プロセスにおいては、結合アッセイの開発が必要と頻繁に最も時間のかかる工程の一つである。 K D判定の最も一般的に使用される方法は、蛍光偏光、1表面プラズモン共鳴（SPR）技術、2放射性リガンド結合、3等温滴定熱量測定、4 equilibriを含むウム透析（ED）、5限外濾過（UF）、5及び超遠心分離（UC）6は、それらのすべては、標的タンパク質の精製かなりの量を必要とする。マイクロスケール熱泳動（MST）は、微視的温度勾配中の分子の指示動きを検出急速に発展方式です。温度勾配に沿った移動の相対的な変化で生体分子結果の水和殻のいずれかに変化する。7 MSTが結合親和性を決定するために使用され、蛍光標識したタンパク質または標的タンパク質の蛍光リガンドに結合するリガンドの研究に適用されている。8、 9 MSTは表面への固定化の必要性（固定フリー技術）せずに直接溶液中での相互作用の測定が可能。変化の大きさが大きく、システムによって異なるが、実質的に、任意の結合は、MST信号の変化を伴っている。 MSTによる分子の動きの検出のために、彼らが蛍光を発するしなければならないNT。このメソッドの主な制限は、利点に変換することができます。タンパク質は、任意のシステムにおけるGFP融合体として発現される場合、それは唯一の蛍光分子となり、従って、細胞溶解物又は無細胞発現系から単離することなく研究することができる。最小限のアーティファクトとの結合条件を可能に細胞溶解物の生成は、大きな課題です。ここでは、多くの可溶性および膜タンパク質を使用することができ、細胞溶解物の準備とMST実験のプロトコルを記述します。
STATタンパク質は、細胞外シグナルに応答してチロシンリン酸化により活性化細胞転写因子の潜在していると免疫、造血、炎症、および開発を含む多くの生物学的過程に関与している。哺乳類で10、STATファミリーは、STAT 1、2、3、4から成り、5A、5B、及び図6。すべてのアクティブ統計をIFN-γ活性化するシーケンスので、GASモチーフと呼ばれる、同じDNA配列に結合することが知られている。しかし、transcriSTATは異なるのptional効果は非常に異なっています。関与にもかかわらず、11種類のDNA配列と17,000出版、STAT相互作用のK Dにわたってもたらす多くの病理学的プロセスと広範な研究で決定されていない。ガスのみモチーフの変種に異なるSTATはの相対親和性が特徴づけられている。タンパク質の発現と精製11難しさは、STATS 'DNA結合選択性の特性評価における主要な障害である。研究の大半はTyrのリン酸化転写因子への代名詞となった"活性化" STATは、転写の調節に非リン酸化STATは（U-STATS）の役割の役割に焦点を当ててきたが、急速に浮上している12は、しかし、これらのメカニズムは十分に理解され、それがU-STATSは、実際に他の転写因子との相互作用を介してDNAまたは行為にバインドするかどうかは不明であったされています。我々は最近、U-STAT3がDNA sequenに結合することができることが示されているさらに高い親和性を有するガスモチーフ異なるCES 13は、発見は、この重要なタンパク質の生物学的機能の理解のために重要な意味を持っています。我々はガスにし、オリゴヌクレオチドS +100（ 図4）豊富なAT STAT3の相対的な親和性を決定するために、マイクロ熱泳動を適用している。陰性対照として用いた関連転写因子、GFP-STAT1とほぼ同一のプロトコルが異なるSTAT3リガンド、リポペプチド阻害剤の結合のためのK Dを決定するために使用されている。14結合はこのような相互作用の選択性を確認した検出することができなかった。 14
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Protocol
1。細胞溶解物の準備
このプロトコルは、任意のGFP融合タンパク質を発現する接着細胞を対象としています。必要とされる細胞数は、低タンパク質発現のレベルに応じて、最大20×10 6細胞〜6 10とで変えることができる。例えば、HEK細胞を過剰発現するGFP-STAT3の溶解物を、1mlの溶解緩衝液で70％コンフルエントに近い10 T75フラスコ中で培養した細胞を処理することによって調製した。しかし、この溶解物MST実験に蛍光の最適なレベルを提供するために150倍に希釈しなければならなかった。細胞溶解プロトコルは、調査中の性質と蛋白質の細胞内局在化に強く依存する。洗剤を使用しているため、タンパク質の不安定性の望ましくない場合は、超音波処理は、以下に説明するように、最良の選択かもしれません。別の添加剤は、タンパク質の修飾反応を防ぐために、溶解緩衝液に添加することができる。EDTAは、リン酸化を防ぎ、バナジン酸ナトリウムので、チロシンプロテインホスファターゼの阻害diumフッ化セリン/スレオニンホスファターゼの阻害剤である。
- 溶解バッファーを準備します。以下の組成がうまくための簡単に抽出する細胞質タンパク質：25mMトリス塩酸、pHは8.0、および2mM AEBSF、0.3μMアプロチニン、130μMのベスタチン、から構成される（シグマアルドリッチP2714、100倍希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル1mMのEDTA、14μME-64、1μMロイペプチン）。また、少ない可溶性タンパク質、1つは、プロテアーゼ阻害剤カクテルと非変性洗剤と商業RIPA緩衝液を使用することができます。氷の上のバッファに保管してください。
- 氷冷PBSでT75フラスコ当たりバッファー10mlのを使って簡単に細胞を洗浄する。 5分間氷上で細胞を維持する、または細胞がフラスコから取り外し始めるまで。必要に応じてデタッチするには、セルスクレーパーで細胞をこすり取る。
- 10ミリリットルの氷冷PBSと予冷14ミリリットルの丸底遠心管への転送中に再懸濁した細胞。
- 4で400-600×gで遠心分離により細胞をペレット化℃で5分間。私はこの時点でいくつかのフラスコから細胞を組み合わせるfは必要としていました。
- あらかじめ冷やした1.5ミリリットルエッペンドルフチューブにサスペンションを転送、氷冷溶解バッファー200μlのPBS清とペレットを再懸濁しを削除します。
- 局所的な過熱を最小限に抑えるために氷の上に細胞を保管してください。あらかじめ冷やした先端2〜3ミリメートルを使用して30％の振幅で超音波処理の3倍の10秒パルスで細胞を溶解。泡立ち最小限に抑えるために表面下先端を保管してください。代わりに30分間氷上で洗剤含有バッファとインキュベートを使用している場合、この手順を省略します。
- 生理的塩濃度（100mMのNaCl）5 MのNaClを使用して必要に応じて格納するための溶解液ソリューションを修正してください。
- 10分間4℃で約26,000×gで遠心分離によって溶解物を収集します。
- 1滴（通常プレ希釈ライセート300μlの周り）に必要な溶解液の最適な溶解液の希釈（以下のセクション3に記載）と量を決定します。
- 調査中のタンパク質（-80°C、ほとんどの場合）に適した温度でアリコートライセートや店舗。 </ OL>
- タンパク質 - リガンド相互作用は、緩衝液条件に依存するので、MST緩衝液組成物は、特定のシステムの特性に基づいて選択される。それは、少なくとも2つの異なるバッファをテストすることが一般に有利である。
- 2 5倍MSTバッファを準備します。とトリス塩酸（250mMのトリス塩酸、pH7.4の; 750のNaCl、50 HEPES（; 25のMgCl 2;; 500mMのNaClを0.25％NP-40 250のHEPES、pH7.4）に：我々は、これらの2つの組成物との良好な経験を持っていたのMgCl 2、0.05％のTween-20）。 BSAの添加（最終結合混合物中の5％）、プラスチックチューブやガラスキャピラリーへのタンパク質の付着を防ぐことができます。のNaN 3（0.5ミリモル）も、微生物の増殖を防ぐために含めることができる。
- MST機器に波長λ= 470nmのLEDで励起源を選択します。
- CEと毛細血管を読み込む2に希釈し、MSTバッファーで10倍抽出う。
- MST機器の制御ソフトウェアの "毛細血管を検索"操作を実行します。希釈溶解物中の最適な蛍光範囲は400〜1,500蛍光単位からのものである。
- リガンドの最高濃度は、予想される解離定数よりも少なくとも20倍以上である必要があります。
- 最低のリガンド濃度は、蛍光タンパク質のモル濃度よりも低くなければなりません。
- 氷の上の0.5ml LoBind遠心管の必要な番号（通常は10-16）と管ラックを置きます。各チューブの底にMSTバッファのピペットで25μlの。最初のタブにリガンドストック溶液25μlをE（＃1、リガンド最高濃度）とチューブの残りの部分を使用したリガンドの連続2倍希釈を行う。氷の上のリガンドサンプルでラックに保管してください。
- 雪解けセルは氷の上でゆっくりと溶解物。
- 結合反応における蛍光標的タンパク質の最適なレベルを提供するために、MST緩衝液で細胞溶解物を希釈する。最終タンパク質濃度が予想されるK D以下に近くなければならない。これは、最終溶液中の蛍光カウント必要な数が得られるように調整されるべきである。溶解物中のGFP-STAT3の濃度を決定するために、器具は、フルオレセインの助けを借りて較正した。溶解物中のGFPのモル濃度は、フルオレセインおよびEGFPの量子収率は、それぞれ0.85および0.61の比を用いて決定した。15
- MST機器でλ= 470nmでのLED励起源を選択します。
- Tにおける場所の0.5ml LoBindチューブリガンド連続希釈サンプルとチューブの向かいUBEラック。慎重に各チューブの底に細胞溶解液15μLを加える。サンプルの損失を回避するために、管壁に触れないようにしてください。
- 細胞溶解物に対応するチューブに最高濃度（＃1）＃1とリガンドのサンプル15μLを加える。よく混ぜ、ピペットチップを変更してください。全く配位子を含むべきではありません最後のを除いて、チューブの残りの部分と、この手順を繰り返します。
- 最後のチューブにMSTバッファー15μLを加え、よく混ぜる。
- 中心に向かって解決策を移動し、位置＃1（トレイ開口部に最も近い位置）にキャピラリートレイにキャピラリーを配置し、それを傾け、チューブ＃1から結合混合物を用いて約2/3最初のキャピラリーを埋める。残り毛細血管でこの手順を繰り返します。キャピラリー両端はもはや実験のためのワックスで差し込むことができます。
- MST機器内部にトレイを置き、機器のドアを閉める。
- "毛細血管を検索"を実行コマンドでは、楽器が毛細血管の正確な位置を見つけて、サンプルの蛍光を測定できるようにする。
- 蛍光信号強度に基づいて、400-1,500単位間隔にそれを持って来るために電源LEDを（10から100パーセントから）を調整します。
- 熱泳動実験を実行するための "スタート"ボタンをクリックします。複数のIRレーザーパワーは、特定のシステムのための最適な温度勾配を見つけるために実験のために選択することができる。測定の再現性を確保するための毛細血管の同じセットの実行2-3からデータを収集する。それは16毛細血管の1セットを実行するために10-12分かかります。
- 解析ソフトウェアを開きます。
- プロジェクトフォルダを読み込みます。登場情報ランビューアで選択し、特定のIRレーザパワー熱泳動曲線で収集。このようなIRレーザーパワーなど、さまざまな条件の下で収集されたすべての熱泳動トレースを開くためのオプションがあり、pは、LEDとower、温度、濃度など 。一度、それらをオンとオフを切り替えることにより、解析のために、任意の曲線を選択すると、（実験の名前をクリックします）。
- 評価点グラフ]ウィンドウで、[T-ジャンプと熱泳動または熱泳動を選択します。青と赤の線が正しく配置されていることを確認。標準偏差と平均点を取得するには、選択し、 "平均を使用する"、または別の実行のために、 "区別が実行されます"。
- 解離定数近似をプロットするには、標識分子の濃度値（フィットウィンドウメニューの "濃度"正方形を確認）を入力して修正し、 "平均を使用する"を選択し、曲線にフィット。その標準偏差とのK D値は、独立した情報のポップアップウィンドウに表示されます。ヒルメソッドを使用してフィット感をプロットするには、 "平均"ヒル方法を選択し、カーブにフィット。その標準偏差との親和性EC 50値は、この場合、示されている。時飽和K Dまたはヒル"枠"の特徴を利用することもできる束縛状態に達していない。
- テキストファイル内の平均近似データを保存して、Excelに転送します。
- 非標識（滴定）分子の濃度の関数として（下記化学式参照）を結合したプロットF ノルム （正規化された蛍光）、ΔF ノルム （正規化蛍光の差が異なる実験が比較される場合）、または画分。
2。 MSTバッファの選択と準備
3。最適な溶解物の希釈の決定
4。最適なリガンド濃度範囲の決定
リガンド濃度範囲推定のためNanoTemperテクノロジーズ集中ファインダーツールを参照してください。
5。細胞可溶化物とリガンド希釈の調製
6。マイクロスケール熱泳動バインディング研究
7。マイクロスケール熱泳動データ解析
サーム（C）は、結合していないが、バインドされていない状態のために熱泳動濃度Cを測定し熱泳動です分数バウンド（複合体における分子の割合）=（サーム（C）非結合）/（バウンド非結合）、（分子があるとき完全に束縛状態に対する熱泳動ではない複雑な）、およびバインドされています。
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Representative Results
オリゴヌクレオチドに結合非リン酸化STAT3タンパク質の親和性を測定する。
STAT3-GFPを発現するHEK293細胞を、DNA結合アッセイのために蛍光標識されたSTAT3の供給源として使用した。細胞溶解物をRIPA緩衝液（20×10 6細胞/ ml）を用いて調製した。結合研究のために、溶解物を結合反応（約20nM）の蛍光タンパク質の最適なレベルを提供するようにMST-DNA結合緩衝液で150倍希釈した。非トランスフェクトHEK293細胞であっても、非希釈した溶解物の非検出可能であることが判明したバックグラウンド蛍光を評価するために使用されている。しかしながら、バックグラウンド蛍光は、他の発現系においてより顕著にすることができるので、監視されなければならない。リガンド結合せずに11混合物および溶解物からなる試料の滴定一連調製されている。各サンプルは、希釈細胞溶解液15μlのとconcentratを変えるのオリゴ液15μlのが含まれていたイオン。 50mMのNaCl;; 2.5のMgCl 2、および0.025％NP-40最終バッファ組成物は、25mMのHEPESを、pHが7.2を含んでいた。測定は室温でλ= 470nm以下でIR-レーザパワーとLED励起源50％を使用したモノリスNT.115機器で処理された標準キャピラリーで撮られた。高度に荷電したオリゴヌクレオチドの結合は、温度勾配におけるSTAT3モビリティ（ 図2）の有意な変化をもたらした。 図3では、熱泳動信号は、オリゴヌクレオチドの濃度の関数としてプロットされている。各データ点は3つの測定値の平均を表す。 NanoTemper分析1.2.20ソフトウェアは、データに合うように見かけのK D値を決定するために使用された。見かけの解離定数は37.9であった±1.0μMとそれぞれGASとS +100、のために23.3±0.6μM（ 図4）。対Gの置換は、S +100 MUT＃1（ 図4）との親和性が劇的に減少した一方、ムー重要S +100 MUT＃2は、S +100 STAT3の検出可能な結合こうして確認配列選択的な結合を示さなかった。驚くべきことに、S +100シーケンスは3つの測定の繰り返しでは、ガスよりも少しタイトな結合を示した。
図1。実験の全体的なスキームは。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 ATリッチオリゴヌクレオチドとGFP-STAT3の相互作用のために生成された未処理の熱泳動データ。希薄化後の細胞ライセートcontaini ngの20nMのGFP-STAT3は、指定されたリガンドの濃度を得た二本鎖オリゴヌクレオチド（5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA）の増加量と混合した。データは50％のレーザーパワーで収集し、100％がLEDした。
図3。 NanoTemper分析1.2.231ソフトウェアによって生成された結合曲線。（ホット初期/蛍光蛍光）蛍光正規化は、オリゴヌクレオチドの濃度の関数としてプロットされている。タンパク質が結合していない状態に比べてバウンドで蛍光の増加を示しています。データはNanoTemper解析ソフトウェアに組み込まれヒル方程式法を用いて取り付けられている。
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図4。 GASにSTAT3-GFPのSTAT3異なる配列を有するオリゴヌクレオチドに結合。マイクロスケール熱泳動結合測定（K D = 37.9±1.0μM）、S 100（K D = 23.3±0.6μM）、S +100変異体1（K D = 740±21μM）、およびS +100変異2（無バインディング）。 STAT3-GFP濃度は約20nMで一定に保たれ、オリゴヌクレオチドの濃度は666から0.650μMまで変化させた。正規化された蛍光の差は、[‰]オリゴヌクレオチド濃度の関数としてプロットし、曲線はNanoTemper解析ソフトウェアの丘法を用いて取り付けられている。エラーバーは3測定値の標準誤差を表す。
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Discussion
タンパク質の発現および精製は、しかし、ほとんどの現在使用されている方法により相互作用'K Dを決定するために必要な労力を要しかつ高価な工程である。 MSTの適用が大幅に相互作用の定量的な特性評価を簡素化し、加速するため、タンパク質精製を避けることができます。このような膜タンパク質及び転写因子などの困難な発現及び精製タンパク質の場合に特に顕著な利点を提示する。
MSTの主要な制限と要件は、緑色蛍光タンパク質との融合体としてタンパク質を発現する能力である。しかし、GFP-融合したヒトおよびマウスタンパク質の大部分を発現させるための構築物は、市販されている。 GFP融合タンパク質はまた、広くトラフィッキング及び分解研究のために使用されているので、MST試験と組み合わせて "ダブル義務"を果たすことができる。
タンパク質ウェブの必要性の欠如に加えてK D判定の従来の方法と比較した場合、すべての試薬 およびバッファー組成のわずかな変化に鈍感のurification、非常に経済的な使用は、MSTは、他の利点を提供しています。表面プラズモン共鳴とは異なり、MSTベースの実験は、以下の2時間を取るより広い範囲でのK Dの決定を可能にし、表面固定アーティファクトに悩まされることはありません。我々はSTAT3タンパク質の精製の 購入のための資金のかなりの量を投資しているものの、例えば、私たちは、SPRによってオリゴヌクレオチドへのSTAT3結合のためにK Dを決定することができませんでした。相互作用のK Dは、転写因子のために頻繁にある場合、あまりにも高く、SPR実験の濃度範囲から落ちた。
滴定熱量はエンタルピーの変化を伴っている相互作用のためにのみ機能します。この制限は、多くのケースを除外します。一方、熱泳動移動度の変化は、ジの値で多くのことを異なるんがfferentシステムは、相互作用の大部分のために発生します。 MSTの最大の利点の一つは、それがバッファのさまざまな働き、洗剤、ミセル、およびシステム内のバイセルの存在を許容することである。このプロパティは、他の方法で勉強することは事実上不可能である膜タンパク質に適用することができます。しかし、注意がリガンドとの滴定中に洗剤とミセル含有量や組成の変動を回避するために使用しなければなりません。
研究対象のタンパク質はしばしば、他のタンパク質、核酸、および補因子との複合体であり、その天然の形態で存在し得ること細胞抽出物を用いた場合にも留意すべきである。したがって、結合親和性は、任意の複雑な地層に関与していない単離されたタンパク質に対して異なっていてもよい。過剰発現は頻繁に非結合状態の研究の下でタンパク質の分子のほとんどを残して相互作用パートナーを滴定することができます。これはachieしようとするためのもう一つの理由です細胞のトランスフェクション時のGFP融合タンパク質のVEは非常に高い発現レベル。他のハード·トゥ·制御パラメータには、システムに大きな異質性を追加することができます翻訳後修飾である。追加の制限は、タンパク質や広い特異とライセート中に存在し、複数のタンパク質と相互作用することができ、低親和性の大量または分子で細胞溶解物中に存在する小分子への結合を検討している。 Wienken、CJ ら 。 K Dは EにMSTによって決まることがわかった大腸菌抽出液は、抗体9とインターフェロンγの相互作用のためのバッファよりも高い桁以上だった。抽出物はないプロテアーゼ阻害剤を持っていないので、効果はタンパク質分解に部分的に起因している可能性があります。血清アルブミンに結合する小分子はまた、MST 9によって相互作用の研究でK Dを変更することが見出された。
抽出の有効性は、またのdiffereごとに異なることができます細胞内局在と物理化学的性質に応じて、NTは、タンパク質。したがって、いくつかの細胞溶解およびタンパク質抽出条件をしようとする人がある。ない洗剤を使用していない細胞質タンパク質については、細胞破壊のためだけの超音波は、しばしば非常に良好な収率とデータを生成する。一方、膜タンパク質は、種々の濃度や洗剤、脂質ミセル、またはバイセルの自然と抽出条件のより広範なスクリーニングが必要です。洗剤コンテンツが結合親和性に影響を与えることを避けるために最小に保たれなければならない。
記載されている制限にもかかわらず、我々は多くのタンパク質とリガンドの種類の結合親和性の定量のために非常に便利であることが非精製GFP融合タンパク質のMST研究を発見した。多くの研究室での方法の普及はさらにMSTベースのタンパク質結合研究の応用を広げることができますことは間違いありません。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。本書の内容は、必ずしも、保健社会福祉省の見解あるいは政策を反映していない、また、商号、商用製品、または組織の言及は、米国政府による承認を意味するものではありません。
Acknowledgments
からとフェデラル·ファンド; NCIとCalidrisピュー間共同研究契約、; OTに米国癌協会助成IRG 97-152-17この作品は、部分的にNIH、国立がん研究所、がん研究センターの学内研究プログラムによってサポートされていました契約HHSN26120080001E下の国立がん研究所、NIH、。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RIPA buffer | Millipore | 20-188 | Other manufacturer's buffers work as well |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Monolith NT.115 | NanoTemper Technologies GmbH | G008 | |
| Monolith NT.115 Capillary Tray | NanoTemper Technologies GmbH | T001 | |
| Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries | NanoTemper Technologies GmbH | K002 | |
| NT Control software | NanoTemper Technologies GmbH | 2.0.2.29 | |
| NT Analysis software | NanoTemper Technologies GmbH | 1.4.27 | |
| Table-top refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5417R | Other microtube refrigerated centrifuges providing |
| Protein LoBind Tube 0.5 ml | Eppendorf | 22431064 |
References
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