Summary
Différentiel capacité concurrentielle des spermatozoïdes chez les
Abstract
La concurrence entre les mâles conspécifiques pour féconder l'ovule est l'un des mécanismes de la sélection sexuelle, à savoir la sélection qui fonctionne sur la maximisation du nombre d'événements d'accouplement réussi plutôt que sur la survie et la viabilité maximisation 1. Compétition spermatique représente la compétition entre les mâles après accouplement avec la même femelle 2, dans lequel leur sperme sont une coïncidence dans le temps et l'espace. Ce phénomène a été rapporté dans plusieurs espèces de plantes et d'animaux 3. Par exemple, sauvage capturé D. melanogaster femelles contiennent généralement des spermatozoïdes 2-3 mâles 4. Les spermatozoïdes sont stockés dans des organes spécialisés ayant une capacité de stockage limitée, ce qui pourrait mener à la concurrence directe du sperme de différents hommes 2,5.
En comparant sperme compétitivité des mâles différents types d'intérêts (mâles expérimentaux) a été réalisée à travers contrôlée expérimentale double accouplementts dans le laboratoire 6,7. En bref, une seule femelle est exposé à deux mâles différents consécutivement, un mâle expérimental et un mâle de référence croisée accouplement. Le même schéma d'accouplement est suivie par d'autres types d'expérimentation, facilitant ainsi la comparaison indirecte de la capacité concurrentielle de leur sperme à travers une référence commune. La fraction d'individus engendrés par les expériences et les mâles référence est identifié en utilisant des marqueurs, qui permet d'estimer la capacité concurrentielle du sperme en utilisant des expressions mathématiques simples 7,8. En outre, la capacité concurrentielle sperme peut être estimée à deux scénarios différents selon que le mâle expérimentale est la deuxième ou la première à s'accoupler (infraction et le dosage de la défense, respectivement) 9, qui est supposé être le reflet de différents attributs de compétences.
Nous décrivons ici une approche qui permet d'interroger le rôle des différents facteurs génétiques qui sous-tendent putativement tIl phénomène de la capacité concurrentielle sperme dans D. melanogaster.
Introduction
Depuis Geoff Parker a noté la prévalence de la compétition spermatique chez les insectes et ses implications évolutives 2, une vague d'études chez la drosophile et d'autres espèces ont tenté de faire la lumière sur ce phénomène à différents niveaux. Quelques exemples de domaines d'intérêt ont fait l'étude de sa variation dans les populations naturelles 9,10, son architecture génétique et la pertinence des facteurs sous-jacents génétiques 11-14, et son rôle dans la coévolution entre les sexes 15,16 conduite. Dans D. melanogaster femelles, la capacité limitée des organes de sperme stockage spécialisés, une paire de spermathèque et le réceptacle séminal 6,17, contribue à la compétition du sperme de mâles différents. Environ 1.500 spermatozoïdes sont transférés pendant l'accouplement pour la femelle, mais seulement ~ 500 peuvent être logés dans les organes mentionnés 18,19. Dans le laboratoire, contrôlée en double accouplement expériencements impliquant un mâle de référence et un ou plusieurs mâles d'intérêt ont été largement utilisés pour évaluer la capacité concurrentielle sperme 7,8.
Capacité concurrentielle sperme est estimée comme étant la proportion de la progéniture désirée par le mâle expérimental dans des expériences double accouplement sur la descendance totale, c'est à dire à la fois le dispositif expérimental et les mâles de référence. Compétitivité sperme comprend deux composants, chacun d'entre eux évaluée dans un essai séparé. Dans le dosage d'infraction, la capacité du sperme mâle expérimental pour déplacer le sperme du premier mâle, soit le mâle de référence, est évaluée. Inversement, dans le dosage de la défense, la capacité du sperme mâle expérimental pour résister à un déplacement ou à réduire le taux de fécondation des spermatozoïdes de sexe masculin de référence est évalué. Selon le type de dosage, de la défense ou de délit, la capacité concurrentielle de sperme est estimé par les scores P 1 ou P 2, respectivement. P1 et P 2 ne peut prendre des valeurs entre 0 et 1. Les valeurs intermédiaires sont habituellement interprétées comme une preuve indirecte de sperme de mélange, ce qui suggère un scénario physiologique impliquant la compétition spermatique direct. Suivant le même raisonnement, les valeurs extrêmes peuvent être interprétées comme une preuve d'une forte capacité compétitive de sperme de différentiel. Les premières études ont montré que P 2 D. melanogaster est plus de 0,8 augmente à mesure que le temps écoulé entre les deux accouplements allonge 7. Ce même protocole expérimental a été utilisé dans d'autres espèces de drosophiles, P 2 étant la statistique communément utilisée dans les études pour évaluer sperme capacité concurrentielle 20. Pour la plupart des espèces, les 2 valeurs P des souches testées est supérieur à 0,6 21. Néanmoins, plusieurs autres mécanismes non liés à la concurrence directe entre le sperme des mâles différents peuvent donner des scores identiques (voir la discussion).
Dprogéniture istinguishing engendré par la première ou la deuxième mâles est possible grâce à l'utilisation de marqueurs facilement identifiables. Dans les premières études, l'un des hommes a été irradiées à des doses sublétales de, par exemple, les rayons X de telle sorte que pratiquement tous les ovules fécondés par le sperme irradié n'ont pas réussi à éclore 7. Par la suite, mutations altérant la pigmentation des yeux ou de la forme de l'aile ont été les marqueurs les plus couramment utilisés. Des exemples du premier sont les mutations pc (brun) 9, cn (cinabre) et 22 W (blanc) 23, tandis que les mutations CY (Curly) 24 correspond au deuxième type de phénotypes; certaines de ces mutations ont été combinés dans le même individu, par exemple cn pc. Dans une moindre mesure, allozymes 25 et microsatellites avec 26,27 modes de transmission connus ont également été utilisés.
Le dispositif expérimental pour tester les différences danscapacité concurrentielle sperme décrit ici suit essentiellement celle de Clark et al. 9. Résultats tirés de ces expériences donnent des informations uniquement sur la paternité différentielle des types masculins expérimentaux sous la loupe. Les analyses qui font également compte des différences post-fécondation in aptitude 14,28 et techniques de visualisation sperme 24 permettent des différences de 1 P (ou P 2) marque à être interprétées comme des différences dans les compétences de sperme.
La figure 1 présente la justification de l'infraction et les analyses de défense. Pour illustrer la logistique du processus, une expérience d'infraction réalisée en D. melanogaster 14 sera expliquée en détail. Ce test d'infraction particulière a été utilisée pour tester un effet mesurable de la famille chaîne intermédiaire dynein spécifique des spermatozoïdes multigénique (Sdic) sur la capacité concurrentielle sperme. Tous les membress de cette famille multigénique résident en tandem sur le chromosome X. mâles Knockout ont été générés par la suppression de la grappe Sdic. Parce que le segment supprimé comprenait également l'aile courte du gène essentiel (SW) et le but de l'étude était d'évaluer la pertinence de Sdic, les hommes portant la délétion Sdic-sw ont été secourus par une copie transgénique sw (symbolisé par P {sw} , qui a également réalisé un gène rapporteur mini-white) sur le chromosome 2. La couleur des yeux a été utilisée comme un marqueur visible pour l'identification de paternité. Tous les mouches étaient dans un fond blanc mutant à l'exception de ceux de la souche Oregon-R, qui ont été utilisés comme hommes de référence.
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Protocol
Expériences à petite échelle doivent être effectuées afin de se familiariser avec la procédure.
1. Collecte femelles vierges et les mâles Naïve
La version la plus simple de l'expérience décrite se compose de quatre types de croisements initiaux, qui impliquent la combinaison suivante des adultes: A) W individus 1118 afin de recueillir des femelles vierges, b) Oregon-R individus afin de recueillir les mâles de référence naïfs, c ) P {sw} mâles homozygotes et les femelles vierges à partir d'une ligne de commande qui porte l'organisation de type sauvage de Sdic afin de recueillir les mâles expérimentaux naïfs (type I) et d) P {sw} Les mâles homozygotes et Sdic-sw-suppression porteurs femelles vierges afin de recueillir les mâles expérimentaux naïfs qui portent le déficit Sdic-sw (Type II).
- Mettre en place plusieurs flacons contenant 8-10 femelles et 5 mâles chacun. Laisser les femelles pondentœufs et de transférer les adultes à de nouveaux flacons tous les 3-5 jours. Utilisez des bouteilles plutôt que des flacons si nécessaire et utilisez toujours des aliments frais. Le nombre de flacons requis dépendra du nombre de types d'expérimentation, l'étude et le nombre d'individus estimés nécessaires pour détecter des différences (tableau 1). Plus de 10 femmes par flacon pourraient aboutir à la surpopulation cours de la croissance larvaire, ce qui peut entraîner une variation de la fertilité de la descendance. Conserver les flacons à 25 ° C dans une chambre à température contrôlée.
- Commencez à collecter des femelles vierges et les hommes naïfs, les jours 11 et 12 ème après la mise en place des croix initiales. Le délai d'attente varie selon la température; inférieure températures résultat dans le temps de développement plus retarder la collection d'individus. Un autre facteur affectant le calendrier de l'éclosion est le type de milieu. Aliments nutritifs, tel que le milieu de semoule de maïs levure 29, assure le bon développement de l'adultele système reproducteur, ce qui facilite l'accouplement. Recueillir désaccouplé vole tous les 4-6 heures. Lors de la collecte, anesthésier les mouches en introduisant CO 2 dans le flacon, appuyez sur les mouches vers le bas, et le sexe les sous loupe binoculaire (Figure 2). Placez les mouches souhaités dans différentes fioles selon le sexe et le phénotype et l'étiquette des flacons de façon appropriée.
Note 1. routine de collecte commence le matin en écartant les adultes qui ont émergé au cours de la nuit précédente. Recueillir femelles vierges et les hommes naïfs une ou deux fois pendant la journée. Typiquement, D. melanogaster mâles deviennent sexuellement matures 8 h après l'éclosion à 25 ° C 30. Si les mouches sont maintenus sous lumière / obscurité cycles h 12:12, deux pics d'éclosion sont attendus: au cours de l'1-2 premières heures après le feu est allumé, et au cours de la 2 h avant que le feu est éteint. Eclosion se produit dans les 24 heures après le s'assombrit chrysalide.
Note 2. Pas plus de 10 femelles should être mis dans le même flacon pour éviter la surpopulation. Cela limite également la perte de femelles dans le cas où ils doivent être jetés parce qu'au moins l'un d'eux n'est pas vierge.
Note 3. Afin de recueillir le nombre approprié de femelles vierges et les hommes naïfs dans un court laps de temps, les mesures suivantes peuvent être adoptées. Mettre en place des flacons de 15-20 w 1118 pour des expériences impliquant deux types de mâles expérimentaux (tableau 1). Saupoudrer la surface des médias et ajouter quelques granules de levure active séchées pour faciliter la ponte. Transfert des parents au moins 4 fois sur plusieurs jours consécutifs. Pour augmenter la surface disponible pour la nymphose dans chaque flacon, insérer du papier multi-plié (7 x 5 cm) au cours de la 4 e ou 5 e jour après que les parents sont transférés dans un autre flacon (Figure 3). Si le nombre d'adultes issus de la croix initiale ne suffit pas, attendre quelques jours de plus et de recueillir des individussal de flacons mis en place à des dates différentes. Prévoyez de réaliser les expériences sur plusieurs jours consécutifs pour égaliser la charge de travail.
2. Expériences Double-accouplement
La figure 4 montre les principales étapes impliquées dans des expériences double accouplement effectuées dans 14.
- Le matin du Jour 1, mis en place le premier accouplement. Les mâles Oregon-R sont les premiers à s'accoupler dans l'essai d'infraction.
- L'utilisation de l'aspirateur, mettre en place des flacons contenant 4 au 5 octobre, un jour w femelles vierges 1118 aux yeux blancs et 10 mâles naïfs Oregon-R aux yeux rouges chacun. Deux à trois flacons sont mis en place tous les jours pendant 5 jours consécutifs. Le nombre de flacons à mettre en place peut varier en fonction du nombre de personnes disponibles. Laisser les mouches s'accouplent pendant 2 heures.
- Jeter Oregon-R mâles et placer chaque femelle dans un nouveau flacon à l'aide d'un aspirateur (figure 5). identification du sexe peut être réalisé par une inspection visuelle de quelquesdifférences morphologiques (Figure 2). Étiqueter chaque flacon de façon appropriée et laisser la femelle dans la fiole pendant 2 jours (ci-après "v1").
- Au jour 3, mis en place le deuxième accouplement. Sélection d'hommes et de cross mis en place devrait être effectuée au hasard afin de minimiser tout risque de biais vers l'un des types masculins expérimentaux.
- Deux heures avant que le feu est éteint, transférer à nouveau la femelle dans un nouveau flacon avec un aspirateur. Étiqueter le nouveau flacon de façon appropriée (ci-après "v2").
- Présentez trois 5-6-jour vieux mâles expérimentaux du même génotype en v2.
- Répéter 2.2.1 et 2.2.2 pour chaque femelle.
- Le jour 4, deux heures juste avant la lumière est allumée (pas plus de 12 heures après la 2.2.1), jeter les mâles à l'aide de l'aspirateur.
- Au jour 6, transférer chaque femelle à nouveau dans un autre nouveau flacon. Etiqueter les nouveaux flacons de manière appropriée (ci-après «v3»).
- Le jour 10, jeter le 1118 w
- Examiner les descendances en v2 et v3. La première inspection est effectuée après 13-15 jours après que la femelle est introduit dans v2 (ou v3), par exemple le jour 17 après la première ponte a commencé féminin dans v2. La deuxième inspection est effectuée exactement au bout de 17 jours. Ce délai constitue une limite temporelle supérieure de sécurité qui garantit l'absence de deuxième génération dans le même flacon. Deux inspections prévenir la surpopulation, tout en facilitant le comptage des descendants.
- Le jour 17, inspecter v1 et s'assurer qu'il n'y progéniture yeux rouges présents, sinon marquer le flacon en conséquence. Présence de descendants aux yeux blancs indique que la femelle n'était pas vierge au moment de l'accouplement initial alors qu'aucune descendance indique que l'accouplement avec la référence ou les mâles expérimentaux n'ont pas eu lieu.
- Le jour 17, effectuer la première inspection de la v2. Anesthetize émergé progéniture en v2 avec le CO 2 et les trier par couleur des yeux et le sexe. numéros de descendance record engendrés par le premier et sechommes ond. Figure 6 montre les phénotypes attendus dans la descendance de chaque système d'accouplement. Dans cette expérience, notamment 14, seule la descendance femelle peut être affecté sans ambiguïté comme engendré par la référence ou les mâles expérimentaux et donc que l'information de filles peut être utilisé pour calculer P 2. Si d'autres marqueurs de la paternité de la progéniture mâle peut être affecté sans ambiguïté, le nombre de descendants des deux sexes peuvent être utilisés dans les calculs en aval. Jeter la descendance, mais garder v2 pour la deuxième inspection.
- Au jour 20, procédez comme en 2.5.2 avec la progéniture nouvellement apparues dans v2, puis jetez le flacon.
- Au jour 20, inspecter la descendance émergé en v3 pour la première fois et suivez l'étape 2.5.2.
- Le jour 23, procédez comme en 2.5.3 avec la progéniture nouvellement apparues dans la version 3.
Note 1: En raison de l'effet gonflant potentiel sur P scores que l'accouplement multiple pourrait avoir (2.2.2 et 2.2.3), l'accouplementpeut être limitée à un laps de temps particulier. Le délai dépendra de la fréquence remating associée avec le génotype des femelles et des mâles utilisés. La probabilité d'accouplement multiple est spécialement réduite pendant la nuit 11.
Note 2: Ne pas ajouter de pellets de levure vivantes, car cela pourrait causer des problèmes dus à la prolifération potentielle de la levure lorsque le nombre de mouches adultes est faible.
3. Analyse des données
- Compte de la descendance enregistrés devraient être organisées de manière appropriée pour une inspection visuelle facile et analyse efficace avec un progiciel statistique approprié (par exemple JMP de SAS Institute) ou des outils Web gratuits (par exemple http://vassarstats.net/ ).
- Capacité concurrentielle sperme. Ajouter chefs de v2 et v3. Les mouches femelles qui ont donné lieu à aucune ou très peu de descendants (par exemple <10), décédée au cours de la procédure, ou ont seulement réussi à l'inséminationted par l'un des deux hommes sont considérés comme non-informatif et sont exclus de toute analyse statistique aval (2.5.1 et tableau 2). Calculer la note 2 P pour chaque femelle informative.
- Vérifier s'il existe des différences statistiquement significatives dans les valeurs P 2 entre les hommes expérimentaux comparés. Cela peut être fait en utilisant paramétrique (HSD de Tukey par exemple) ou des tests non paramétriques (par exemple acier Dwass) en fonction de plusieurs facteurs, notamment l'asymétrie de la distribution des valeurs P 2 et la dépendance entre la variance et la moyenne. La transformation angulaire est couramment appliquée dans des proportions telles que P 2 avant l'utilisation de tests paramétriques 31.
- différences de taux de connexion (en option). Pour chaque type masculin expérimental, calculer le nombre de femelles fécondées doublement et ceux qui ne accouplé avec le premier homme (le mâle de référence dans l'essai d'infraction et le mâle expérimental dans le ddosage de efense). L'utilisation d'un test exact bilatéral de Fisher (disponible à http://www.langsrud.com/fisher.htm ), déterminer s'il existe des différences statistiquement significatives entre les deux types de mâles expérimentaux.
- Le sex-ratio (en option). Pour chaque mâle expérimental, à utiliser le test du chi-carré pour déterminer si le sex-ratio dans la descendance de chaque femelle s'écarte du rapport 1:1 attendu.
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Representative Results
Le tableau 2 résume quelques traits saillants de deux expériences d'infractions (essais 1 et 2) dans laquelle D. melanogaster mâles expérimentaux avec et sans (Type I et II, respectivement) un cluster Sdic fonctionnel sont comparées 14. Après prise en compte des incidences différentes rencontrées avec certaines répliques, 58-83% des femelles ont été trouvés à être informatif et donc les comptes de la paternité de leur progéniture pourraient être utilisées pour le calcul de P 2. Les résultats des tests non paramétriques étaient compatibles avec une capacité concurrentielle de spermatozoïdes chez les hommes sans la grappe Sdic (Type II) par rapport aux hommes avec le groupe intact (Type I) 14. Ce modèle était reproductible à travers les analyses des infractions réalisées. Une tendance similaire mais non statistiquement significative n'a été observée dans les essais de défense effectuées en parallèle (non représenté). Surtout, l'absence de différences de taux d'accouplement (étape 3.4) a écarté la possibilité quele génotype masculin pourrait affecter le comportement féminin remating 14.
| Essai de Offense | Essai de la Défense | |||||
| Experimental ♂ type | w 1118 ♀ | OU-R ♂ | Expérimental ♂ | w 1118 ♀ | Expérimental ♂ | OU-R ♂ |
| Je | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
| II | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
Tableau 1. Nombre de personnes requises dans les expériences double accouplement pour comparer deux types masculins expérimentaux. OR-R, Oregon-R.
| ♀ | ||||||
| Experimental ♂ type | Nombre initial | Pas de réussite de la fécondation avec référence ♂ | Pas de réussite de la fécondation avec expérimentale ♂ | Problématique 1 | Informative (%) | P 2 2 |
| Essai 1 | ||||||
| B +(Type I) | 60 | 5 | 6 | 2 | 47 (78%) | 1.000 (1,000 à 0,987) |
| A-(Type II) | 55 | 1 | 7 | 5 | 42 (76%) | 0,986 (1.000-0.936) |
| Essai 2 | ||||||
| I + (Type I) | 74 | 9 | 7 | 15 | 43 (58%) | 1.000 (1,000 à 0,979) |
| E-(Type II) | 75 | 3 | 8 | 2 | 62 (83%) | 0,983 (1.000-0.927) |
Tableau 2. Résumé de l'impact des différents événements sur le nombre de femelles utilisées dans les essais d'infraction effectué pour tester les différences entre les types masculins expérimentaux. 1 Mort, escaped pendant le test, ou donnant lieu à un certain nombre de descendants dessous d'une valeur seuil. 2 médian (intervalle interquartile).
Figure 1. Dispositif expérimental pour l'infraction et les analyses de la défense. Le code couleur utilisé pour chaque génotype désigne la couleur des yeux de la mouche adulte. Oregon-R mâles sont utilisés comme référence pour comparer indirectement la capacité concurrentielle sperme de deux hommes expérimentaux: l'un portant la forme sauvage du facteur génétique à l'étude (type I) et dans lequel la fonctionnalité du facteur génétique a été perturbé (Type II). Le cluster Sdic, le facteur génétique dans ce cas, est situé sur le chromosome X alors que le sw transgène est situé sur le chromosome 2. Les expériences illustrées font partie de celles réalisées en
Figure 2. identification du sexe dans D. melanogaster. (A) dorsale, (B) latérale, et (C) vue ventrale de 1 h vieilles femelles (à gauche) et les hommes (à droite) anesthésiés avec du CO 2 sous la loupe binoculaire. L'appareil génital masculin est sensiblement plus pigmentée que la plaque vaginale donnant lieu à une tache sombre apparent, ce qui est le personnage le plus fiable à utiliser pour le sexage. En outre, les tarses antérieurs des mâles possèdent une frange de poils sombres (sexe peigne) absent dans lefemelle. (D) fiable et rapide l'identification du sexe des mouches âgées à l'oeil nu est fortement recommandé lors du transfert de personnes dans des flacons en utilisant des aspirateurs. Chez les personnes âgées, abdomen du mâle est dorsale beaucoup plus sombre que celui de la femelle. Les femelles sont généralement plus grandes et ont un abdomen plus pâle que les mâles. Le ovipositor rend l'abdomen femelle a.
Figure 3. Papier multi-plié utilisé pour augmenter la surface disponible pour l'errance larves.
Figure 4. Grandes lignes de l'expérience des différences de dosage dans la capacité concurrentielle sperme dans D. melanogaster. accouplement de masse pendant 2 heures en utilisant vir gin w femelles 1118 et Oregon-R mâles sont lancés chaque jour pendant 5 jours. Dans chaque accouplement de masse, une fois terminé, 12-14 femelles doivent être aspirés séparément dans des flacons individuels (v1). Deux jours plus tard, chaque femelle est transféré dans un nouveau flacon (v2) avec trois mâles expérimentaux du même génotype. Ces personnes ont le droit de s'accoupler pendant la nuit. Les mâles sont jetés après ~ 12 heures tandis que les femmes sont autorisées à pondre pendant 2 jours. Par la suite, les femelles sont transférés dans de nouveaux flacons (v3), a permis de pondre à nouveau, et finalement jetés après 3 jours. Treize à quinze et 17 jours après que les femmes ont commencé à pondre à la fois v2 et v3, la progéniture engendré par le dispositif expérimental et les mâles de référence sont identifiés en utilisant des marqueurs appropriés et enregistrés. Après les descendances en v2 et v3 sont inspectés deux fois, les flacons sont jetés. Flèche vers le bas, individus rejetés; symbole de l'œil, de l'inspection du flacon. Adapté à partir de 9.d/50547/50547fig4large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 5. Aspirateur flexible. Assemblé à partir de tubes de latex orange, un 1 ml graduée astuce pour recevoir des mouches et une autre fonctionnant comme mouthpart jetable. Pour empêcher les mouches d'être aspiré dans le tube, tissu à mailles fines est utilisé pour protéger la pointe de fly-recevoir à la jonction avec le tube.
Figure 6. Phénotypes attendus dans la descendance de l'essai d'infraction. Gauche et à droite, croise à évaluer la capacité concurrentielle sperme de contrôle et d'hommes knock-out, respectivement. Génotype et la couleur des yeux pour parentals et la descendance des deux fathers sont affichés. Parce que des marqueurs génétiques particuliers utilisés dans cet essai, seulement la descendance femelle peut être utilisé pour calculer P 1 (ou P 2) marque (voir le texte pour plus de détails), une partie de la descendance mâle engendré par le mâle expérimentale est aux yeux blancs et . donc phénotypique indiscernable de la descendance mâle du mâle référence Df, carence; P {} sw, transgène;. w 1118 allèle mutant du gène blanc Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Nous avons décrit le protocole expérimental pour évaluer les différences dans la contribution relative des organismes génétiquement distincte D. melanogaster mâles à la descendance dans des expériences contrôlées en double accouplement 7,8. Cela a été fait dans le cadre d'un facteur génétique hypothèse d'influer sur la capacité concurrentielle sperme et il a été illustré dans le dosage de l'infraction même si une procédure similaire s'applique à l'analyse de la défense (Figure 1). Cette conception expérimentale peut être modifié pour tester d'autres aspects de la réussite de paternité comme l'influence du génotype femelle 32. Un exemple des modifications qui peuvent être incorporés est la surveillance directe de la copulation entre le féminin et le deuxième homme. En outre, il est également important de noter que la performance relative des types d'expérimentation, dépend du génotype du testeur mâle et femelle utilisée et donc ne peut être extrapolé à d'autres scénariosimpliquant différents mâles et les femelles testeur 10,32,33.
Depuis la collecte des individus requis (femelles vierges et les hommes naïfs) et la notation de la descendance est de main-d'œuvre, le nombre de types masculins expérimentaux distincts à évaluer doit être ajustée en fonction du nombre de personnel qualifié disponible. Les expériences décrites ici peuvent être facilement manipulés par une personne de plus de six semaines. En fait, jusqu'à cinq types d'expérimentation, pourraient être évalués en parallèle. La seule mesure supplémentaire doit être adopté est de prolonger le nombre de jours de la mise en place d'accouplements masse initiale et la collecte des individus nécessaires pour eux.
Dans notre expérience, le nombre de départ des femelles utilisées (60-70) est suffisant pour accueillir réduction de la taille de l'échantillon sans compromettre notre puissance statistique pour détecter les différences entre les types masculins expérimentales (tableau 2). La diminution du nombre de ifemelles nformative peuvent résulter de différents facteurs, par exemple l'absence de preuves d'un double accouplement ou la mort prématurée. Néanmoins, le nombre de femelles nécessaires pour chaque type d'expérimentation, afin d'obtenir une puissance statistique adéquate varie en fonction de l'ampleur de l'effet du facteur génétique à l'étude. Une expérience pilote est fortement conseillé afin d'estimer le niveau approprié de réplication.
Les différences statistiques en P 1 (ou P 2) scores indiquent variation de l'efficacité de la fertilisation garçons mais ils n'informent pas sur les mécanismes sous-jacents qui contribuent à ces différences. Cela est dû à plusieurs variables qui pourraient avoir une incidence compétitivité sperme (examinée en détail 20 et 34). attributs de sperme comme la taille, le nombre et la motilité peuvent avoir un impact sur la concurrence des spermatozoïdes directement 35. En outre, d'autres mécanismes non liés directement au sperme concurrence can contribuer aussi à des différences de P 1 ou P 2 valeurs. Par exemple, la première sperme mâle peut être retiré de manière préférentielle, repositionné ou rincé avant ou au cours de l'accouplement avec le mâle 19,20 secondes. Cela peut se produire par la stimulation mécanique, par exemple, lors de la copulation et par des molécules présentes dans le liquide séminal de la deuxième mâle, ce qui affectera négativement 19,36 première sperme masculin. Par conséquent, les analyses complémentaires qui permettent d'évaluer l'impact de ces mécanismes indirects supplémentaires doivent être effectuées, idéalement avant l'expérience à double accouplement décrit ici. Exemple de ces tests sont ceux dont le test des différences de viabilité zygote (par exemple la survie des larves) et les taux d'éclosion des œufs (un indicateur de la fécondation des oeufs réussie) 28,37, ce qui résulte en fin de compte des différences dans le nombre de descendants.
Les techniques d'imagerie de sperme peuvent également être très instructif 19,24,28. Essentiellement, un of les mâles sont modifiées génétiquement de sorte que le sperme est marquée avec une protéine de fusion fluorescente (par exemple celle de l'homme de référence avec une protéine fluorescente verte) aidant surveillance dynamique du sperme dans l'appareil reproducteur féminin. Cette approche combinée avec davantage coloration utilisant 4 ',6-diamidino-2-phenyllindole (DAPI) a été utilisé pour identifier directement le nombre de spermatozoïdes du premier et du second hommes en réceptacles séminaux disséqués de D. melanogaster femelles 24,28. Dans une étude de 24, les différences dans le nombre de spermatozoïdes sont en bon accord avec les différences de P 2 valeurs soutenant la notion que ces différences de paternité masculin étaient le reflet de véritables différences dans la capacité concurrentielle sperme et non de mécanismes indirects.
Les améliorations subséquentes ont été atteints par la génération des souches transgéniques qui expriment des marqueurs fluorescents verts et rouges fusionnés à des protéines spécifiques de sperme 19. Ces improvements ont permis aux chercheurs de surveiller le sperme des deux en concurrence directe sperme masculin avec un degré sans précédent de la résolution. En conclusion, l'exécution des expériences double accouplement et essais supplémentaires comme celles proposées aident à affiner la nature des différences en P 1 ou P 2 scores trouvés parmi les types masculins expérimentaux, ce qui ouvre la possibilité de disséquer la base génétique de la variation naturelle dans la capacité concurrentielle sperme.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs remercient NSF (MCB-1157876) pour le financement. Nous remercions également Alberto Civetta, John Roote, et deux arbitres anonymes pour leurs commentaires.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber latex tubing | VWR | 62996-473 | 1/4 inch ID, 1/6 inch Wall |
| 1 ml graduated XL filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed |
| Parafilm | Sigma | P-7793 | |
| Mesh Fabric | Thin and smooth | ||
| Stereomicroscope | Leica | S6D | |
| CO2 Tank | Airgas | CD-50 | Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available |
| FlyStuff Foot Valve, complete system | Genesee Scientific | 59-121C | Not necessary if FlyNap is used |
| Plastic vials | Genesee Scientific | 32-109 | Come with carboard trays that can be reused for holding vials |
| Cotton balls | Fisher Scientific | AS-212 | |
| Active dry yeast | Red Star | Found in general grocery store | |
| Sharpie markers | Different colors may be used for marking different genotypes |
References
- Darwin, C. The descent of man and selection in relation to sex. , John Murray. (1871).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).
- Birkhead, T. R., Møller, A. P. Sperm competition and sexual selection. , Academic Press. (1998).
- Jones, B., Clark, A. G.
- Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster. Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).
- Jonsson, U. B. Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster. Genetics. 47, 1719-1736 (1962).
- Boorman, E., Parker, G. A. Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status. Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).
- Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C. Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. Smith, R. L. , Academic Press. 372-427 (1984).
- Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster. Genetics. 139, 189-201 (1995).
- Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. Female x male interactions in Drosophila sperm competition. Science. 283, 217-220 (1999).
- Civetta, A., Clark, A. G. Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila. Genet. Res. 75, 143-151 (2000).
- Greenspan, L., Clark, A. G. Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster. Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).
- Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).
- Yeh, S. D., et al. Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).
- Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila. Evolution. 53, 1804-1822 (1999).
- Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A.
- Nonidez, J. F. The internal phenomenon of reproduction in Drosophila. Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).
- Miller, G. T., Pitnick, S.
- Manier, M. K., et al. Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster. Science. 328, 354-357 (2010).
- Simmons, L., Siva-Jothy, M. Sperm competition and sexual selection. Birkhead, T. R., Møller, A. P. , Academic Press. 826 (1998).
- Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila. Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).
- Markow, T. A. A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei. Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).
- Barbadilla, A., Quezada-Díaz, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance. Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).
- Civetta, A. Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila. Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).
- Turner, M. E., Anderson, W. W. Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes. Evolution. 38, 983-995 (1984).
- Harshman, L. G., Clark, A. G. Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila. Evolution. , 1334-1341 (1998).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).
- Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation. Nature. 400, 449-452 (1999).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , CSHL. (1997).
- Sokal, R. R., Rohlf, F. J. Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , 3d, Freeman, W.H. (1994).
- Clark, A. G., Begun, D. J. Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila. Genetics. 149, 1487-1493 (1998).
- Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A.
- Wigby, S., Chapman, T.
- Pizzari, T., Parker, G. A. Sperm biology: an evolutionary perspective. Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. , Academic Press. 674 (2008).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction. Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).
- Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).
