Summary
יכולת התחרותית ההפרש בין זרע
Abstract
תחרות בין הזכרים conspecific לדישון הביציות היא אחד מהמנגנונים של ברירה מינית, כלומר בחירה שפועלת למקסם את מספר אירועי הזדווגות המצליחים ולא על הישרדות וכדאיות 1 מרחיבה את עוצמה. תחרות זרע מייצגת את התחרות בין זכרים לאחר הזדווגות עימו 2 הנקבה, שבזרע שלהם הם מקריים בזמן ובמרחב. תופעה זו כבר דווחה במינים רבים של צמחים ובעלי חיים 3. לדוגמה, שנלכד בטבע ד ' נקבות melanogaster מכילות בדרך כלל זרע 2-3 זכרים 4. הזרע מאוחסנים באיברים מיוחדים עם קיבולת אחסון מוגבלת, אשר עלול להוביל לתחרות הישירה של הזרע מזכרים שונים 2,5.
השוואה בין היכולת התחרותית זרע של זכרים שונים של עניין (סוגים ניסיוניים גברים) שבוצע באמצעות ניסיוני כפולת הזדווגות מבוקרתTS במעבדה 6,7. בקצרה, נקבה אחת חשופה לשני זכרים שונים ברצף, גברים ניסיוניים אחד ואחת ממין זכר התייחסות צולבת הזדווגות. אותו ערכת ההזדווגות לאחר מכן ואחרי השימוש בסוגי גברים ניסיוניים אחרים וכך להקל על ההשוואה העקיפה של היכולת התחרותית של הזרע שלהם באמצעות התייחסות משותפת. חלק קטן מאנשי אביהם היו הזכרים הניסיוניים והתייחסות מזוהה באמצעות סמנים, המאפשר אחד כדי להעריך את היכולת התחרותית זרע באמצעות ביטויים מתמטיים פשוטים 7,8. בנוסף, ניתן להעריך את היכולת התחרותית זרע בשני תרחישים שונים, תלויים אם הזכר הניסיוני הוא שני או ראשון להזדווג (עבירה וassay הגנה, בהתאמה) 9, שהנחה הוא שהוא משקף את יכולת תכונות שונות.
כאן, אנו מתארים את הגישה שעוזרת לחקור את תפקידם של גורמים גנטיים שונים שעומדים בבסיס לא putativelyהוא התופעה של כושר תחרות זרע בד melanogaster.
Introduction
מאז ג'ף פרקר ציין השכיחות של תחרות זרע בחרקים והשלכותיה אבולוציוניים 2, גל של מחקרים בדרוזופילה ומינים אחרים ניסה לשפוך קצת אור על תופעה זו ברמות רבות ושונות. כמה דוגמאות לתחומי העניין היו הסקר של הווריאציה שלה באוכלוסיות טבעיות 9,10, הארכיטקטורה ורלוונטי של גורמים גנטיים שבסיס הגנטי שלה 11-14, ותפקידה בנהיגת אבולוציה משותף בין המינים 15,16. בד melanogaster נקבות, הקיבולת המוגבלת של איברי זרע האחסון מיוחדים, זוג spermatheca וקיבול זרע 6,17, תורם לתחרות של הזרע מזכרים שונים. כ -1,500 זרע מועבר במהלך הזדווגות לנקבה אבל רק ~ 500 ניתן לאכלס באיברים שהוזכרו 18,19. במעבדה, מבוקרת כפולה הזדווגות ההתנסותments מעורב זכר התייחסות ואחד או יותר מזכרים של עניין נעשה שימוש נרחב להערכת יכולת 7,8 זרע תחרותית.
יכולת התחרותית זרע הערכה היא כמו היחס של צאצאים הוליד על ידי הזכר הניסיוני בניסויים כפול הזדווגות על הצאצאים המוחלט, כלומר, שגם מניסיוני והתייחסות לזכרים. יכולת התחרותית זרע מורכב משני מרכיבים, שכל אחד מהם הוערך בassay נפרד. ב assay העבירה, ביכולתו של הזרע הגברי הניסיוני כדי לעקור את הזרע מהזכר הראשון, כלומר ההתייחסות הגברית, מוערכת. לעומת זאת, בassay ההגנה, יכולתו של הזרע הגברי הניסיוני להתנגד עקירה או להפחית את ההצלחה ההפריה של הזרע גברי ההתייחסות מוערכת. בהתאם לסוג של assay, הגנה או התקפה, יכולת התחרותית זרע הערכה היא דרך עשרות P 1 או 2 P, בהתאמה. P1 ו-P 2 יכול לקחת ערכים בין 0 ו -1 בלבד. ערכי ביניים בדרך כלל מתפרשים כראיות עקיפות של זרע ערבוב, אשר טוען תרחיש פיסיולוגי מעורב תחרות זרע ישירה. בעקבות אותו הרציונל, ניתן לפרש את ערכים קיצוניים כהוכחה ליכולת התחרותית זרע ההפרש חזקה. מחקרים מוקדמים הראו כי P 2 בד melanogaster הוא מעל 0.8 הגדלת כמו הזמן שחלף בין שתי ההזדווגויות מאריכות 7. אותו עיצוב ניסיוני זה כבר נעשה שימוש במינים תסיסנית אחרים, P 2 להיות נתון נפוץ במחקרים כדי להעריך את יכולת זרע 20 התחרותית. עבור רוב המינים, את 2 ערכי P של הזנים שנבדקו הוא גבוהים יותר מאשר 0.6 21. עם זאת, מספר מנגנונים אחרים שאינם קשורים לתחרות הישירה בין הזרע של זכרים שונים יכולים להניב תוצאות זהות (ראה דיון).
Dצאצאי istinguishing הוליד ידי הזכרים הראשונים או שני אפשרי באמצעות שימוש בסמני זיהוי בקלות. במחקרים מוקדמים, אחד מהזכרים היה מוקרן במינונים sublethal של, למשל, קרני ה-X כך שכמעט כל הביציות מופרות על ידי זרע מוקרן לא הצליחה לבקוע 7. בהמשך, מוטציות משינוי פיגמנטציה עין או צורת כנף היו הסמנים הנפוצים ביותר. דוגמאות ללשעבר הן מוטציות BW (חום) 9, cn (כינאבאר) 22 ו w (לבן) 23, ואילו את המוטציה (קרלי) 24 מקבילה Cy לסוג השני של פנוטיפים, כאשר חלק ממוטציות אלו כבר משולבים ב אותו אדם, למשל CN BW. במידה פחותה יותר, היו בשימוש allozymes 25 ומייקרו 26,27 עם דפוסי ירושה ידועים גם בשם.
תכנון הניסוי לבדיקת הבדלים בהיכולת התחרותית זרע שתוארה כאן נובע למעשה זה של קלארק ואח'. 9. תוצאות ניסויים אלה נגזרים מלתת מידע אך ורק על אבהות ההפרש של סוגי הגברים הניסיוניים תחת בדיקה. מבחני שגם הופכים את ההפרשה להבדלים לאחר הפריה בכושר 14,28 וטכניקות להדמיה זרע 24 לאפשר הבדלים ב1 P (או P 2) ציונים להתפרש כהבדלים ביכולת זרע.
איור 1 מתאר את הרציונל של שניהם עבירה והמבחנים הבטחוני. כדי להמחיש את הלוגיסטיקה של התהליך, ניסוי בוצע בעבירת ד melanogaster 14 שיוסבר בפירוט. assay עבירה מסוים זה משמש לבדיקת השפעה מדידה של שרשרת multigene משפחת הזרע הספציפית dynein ביניים (SDIC) על יכולת התחרותית זרע. כל חברים של משפחת multigene זה מתגורר במקביל על כרומוזום X. הזכרים נוקאאוט נוצרו על ידי מחיקת אשכול SDIC. בגלל הקטע שנמחק כלל גם זרוע הקצרה הגן החיוני (SW) ומטרתו של המחקר הייתה להעריך את הרלוונטיות של SDIC, גברים שנשאו את מחיקת SDIC-SW חולצו על ידי עותק מהונדס של SW (סמלה כP {SW} , שגם נשא את גן כתב מיני לבן) בכרומוזום 2. צבע עיניים שימש כסמן גלוי לזיהוי אבהות. כל הזבובים היו ברקע לבן עם מוטציה למעט אלה מזן אורגון-R, אשר שמשו כזכרי התייחסות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בקנה מידה קטנה צריכים להתבצע כדי להכיר את ההליך כולו.
1. איסוף נקבות וזכרי בתולה נאיביים
הגרסה הפשוטה של הניסוי שתואר מורכבת מארבעה סוגים של צלבים ראשוניים, אשר כרוך השילוב הבא של מבוגרים: א) יחידים w 1118 על מנת לאסוף נקבות בתולה, ב) יחידים אורגון-R כדי לאסוף זכרים התייחסות נאיביים; ג ) P {} SW זכרים ונקבות הומוזיגוטים בתולה מפס בקרה שמבצע ארגון פראי הסוג של SDIC כדי לאסוף זכרים ניסיוניים נאיביים (סוג I); ו-D) P {} SW זכרים הומוזיגוטים וSDIC-SW-מחיקה נשיאת נקבות בתולה כדי לאסוף זכרים ניסיוניים נאיביים הנושאים את מחסור SDIC-SW (סוג II).
- הגדר את בקבוקונים המכילים מספר רב של 8-10 נקבות וזכרים 5 כל אחד. לאפשר לנקבות להטיל אתביצים ולהעביר את המבוגרים לבקבוקונים חדשים בכל 3-5 ימים. להשתמש בבקבוקים ולא בבקבוקונים במידת צורך, ותמיד להשתמש במזון טרי. מספר הבקבוקונים הנדרשים יהיה תלוי במספר סוגי גברים ניסיוניים תחת מחקר ואת מספר האנשים העריכו שצריכה כדי לזהות הבדלים (טבלת 1). יותר מ -10 נשים בכל בקבוקון עלולות לגרום לצפיפות יתר במהלך צמיחת הזחל, שעלול לגרום לשינוי בפוריות של הצאצאים. בקבוקונים לאחסן ב -25 ° C בתא בטמפרטורה מבוקר.
- להתחיל לאסוף נקבות וזכרי בתולה נאיביות בימים ה 11 וה 12 לאחר ההגדרה הראשוניים הצלבים. תקופת המתנה משתנה בהתאם לטמפרטורה, תוצאת טמפרטורות נמוכה יותר בזמן ארוך יותר עיכוב התפתחותי האוסף של יחידים. גורם נוסף המשפיע על העיתוי לeclosion הוא הסוג של מדיום. אוכל מזין, כגון קמח תירס, שמרים בינוניים 29, מבטיח התפתחות תקינה של המבוגרמערכת רבייה, המאפשרת הזדווגות. אסוף מבלי שהזדווגו לפני עף כל 4-6 שעות. בעת איסוף, להרדים זבובים על ידי החדרת CO 2 לתוך הבקבוקון, הקש על הזבובים למטה, ומינם תחת stereomicroscope (איור 2). מניחים את הזבובים הרצויים לתוך צלוחיות שונות לפי מין ופנוטיפ ותווית את הבקבוקונים כראוי.
שים לב 1. שגרת אוסף מתחילה בבוקר על ידי השלכת את המבוגרים שצצו במהלך הלילה הקודם. לאסוף נקבות וזכרי בתולה נאיביים פעם או פעמיים במהלך היום. בדרך כלל, ד ' זכרים melanogaster להיות 8 שעות לבגרות מינית אחרי eclosion של 25 מעלות צלזיוס 30. אם זבובים נשמרים תחת מחזורי אור / חושך הפועל 12:12, שתי פסגות של eclosion צפויות: במהלך 1-2 שעות הראשונה לאחר שהאור דולק, ובמהלך שעות 2 לפני שהאור כבוי. Eclosion מתרחש בתוך 24 שעות לאחר מכהת הגולם.
שימו לב 2. לא יותר מ 10 נקבות shולד יהיה להכניס אותו הבקבוקון כדי למנוע צפיפות יתר. זה גם מגביל את ההפסד של נקבות במקרה שיש להם להיות מושלכים, כי לפחות אחד מהם הוא לא בתולה.
הערה 3. על מנת לאסוף את המספר המתאים של נקבות וזכרי בתולה תמים בפרק זמן קצר, אפשר לאמץ את הצעדים הבאים. הגדר את הבקבוקונים של 15-20 W 1118 לניסויים מעורבים שני סוגים של גברים ניסיוניים (טבלת 1). קל ומפזרים את פני השטח של כלי התקשורת ולהוסיף כמה כדורי שמרים פעילים יבשים כדי להקל על ההטלה. העבר את ההורים לפחות 4 פעמים ביום ברציפות. כדי להגדיל את השטח זמין להתגלמות בכל בקבוקון, הכנס נייר מקופל רב (7 ס"מ X 5) ביום ה -4 או 5 לאחר שההורים מועברים לתוך בקבוקון נוסף (איור 3). אם מספר המבוגרים עלו מהצלבים ראשוני זה לא מספיק, תחכה לעוד כמה ימים ולאסוף individuALS מבקבוקונים להגדיר בתאריכים שונים. מתכנן לבצע את הניסויים על פני כמה ימים רצופים כדי לאזן את עומס העבודה.
2. ניסויים כפולי הזדווגות
איור 4 מציג את השלבים העיקריים מעורבים בניסויים כפול הזדווגות שבוצעו ב14.
- בבוקרו של יום 1, להגדיר את ההזדווגות הראשונה. הזכרים אורגון-R הם הראשון להזדווג בassay העבירה.
- שימוש aspirator, להגדיר בקבוקונים המכילים 10 נקבות 4-5-בני יומם לבנים עיני w 1118 בתולה וכל אחד מהם 10 גברים נאיביים אדומי עיניים אורגון-R. שנים עד שלושה בקבוקונים מוגדרים ביום למשך 5 ימים רצופים. מספר הבקבוקונים שיוקמו עשוי להשתנות בהתאם למספר אנשים זמינים. לאפשר לזבובים להזדווג במשך שעה 2.
- בטל זכרים אורגון-R ולמקם כל נקבה לתוך בקבוקון חדש באמצעות aspirator (איור 5). זיהוי מין יכול להיות מושגת על ידי בדיקה ויזואלית של כמההבדלים מורפולוגיים (איור 2). תווית בקבוקון אחד כראוי ולהשאיר את הנקבה בבקבוקון ל2 ימים (להלן "V1").
- ביום 3, להגדיר את הזיווג השני. בחירה של זכרים ולחצות להגדיר צריכה להתבצע באופן אקראי על מנת לצמצם הטיות אפשריות כלפי כל אחד מסוגי הניסויים ממין זכר.
- שעתיים לפני שהאור כבוי, להעביר שוב את הנקבה לתוך בקבוקון חדש עם aspirator. תווית הבקבוקון החדש כראוי (להלן "V2").
- להציג את שלושה זכרים ניסיוניים 5-6 ימים בת של אותו גנוטיפ לv2.
- חזור על 2.2.1 ו2.2.2 עבור כל אישה.
- ביום 4, שתי שעות נכונה לפני שהאור דולקת זכרים (כלומר לא יותר מ -12 שעות לאחר 2.2.1), להשליך על ידי השימוש בaspirator.
- ביום 6, להעביר כל נקבה שוב לתוך בקבוקון חדש אחר. לתייג את הבקבוקונים החדשים כראוי (להלן "V3").
- ביום 10, לבטל את 1118 w
- לבחון את progenies בV2 וV3. הבדיקה הראשונה מתבצעת לאחר 13-15 ימים לאחר הנשי מוחדר v2 (או v3), למשל ביום 17 לאחר ovipositing הראשון התחיל הנשי בv2. הבדיקה השנייה מבוצעת בדיוק לאחר 17 ימים. מסגרת זמן זה מציב גבול עליון בטוח זמני שמבטיח לא דור שני באותו הבקבוקון. שתי בדיקות למנוע צפיפות יתר תוך הקלת ספירת צאצאים.
- ביום 17, לבדוק V1 ולהבטיח כי יש צאצאים אדומים עיני הווה, אם לא יציין את הבקבוקון בהתאם. נוכחות של צאצאים לבנים עיניים מצביעה על כך שהנשים לא היו בתולה בעת ההזדווגות ראשונית בעוד שאף צאצאים מציין כי הזדווגות עם ההפניה או הזכרים הניסיוניים לא התרחש.
- ביום 17, לבצע את הבדיקה הראשונה של V2. הרדם יצא צאצאים בV2 עם CO 2 ולמיין אותם לפי צבע עיניים ומין. מספרי שיא צאצאי אביהם הראשון והשנייהזכרים ond. איור 6 מציג את פנוטיפים הצפויים בצאצאים של כל ערכת הזדווגות. ב14 ניסוי המסוים הזה, רק נקבת צאצאים ניתן להקצות באופן חד משמעי כהולידו על ידי ההפניה או הזכרים הניסיוניים ולכן רק את המידע מבנות יכול לשמש כדי לחשב P 2. אם עם סמנים אחרים האבהות של צאצאי זכרים ניתן להקצות באופן חד משמעי, ספירת צאצאים של שני המינים ניתן להשתמש בחישובים במורד הזרם. מחק את הצאצאים אבל לשמור v2 לבדיקה שנייה.
- ביום 20, פעל כב2.5.2 עם הצאצאים יצאו זה עתה בV2 ואז להשליך את הבקבוקון.
- ביום 20, לבדוק את הצאצאים יצאו בV3 בפעם הראשונה ובצע את השלב 2.5.2.
- ביום 23, פעל כב2.5.3 עם הצאצאים יצאו זה עתה בV3.
הערה 1: בשל השפעה פוטנציאלי ניפוח על ציוני P שהזדווגות מרובה אולי יש לי (2.2.2 ו2.2.3), הזדווגותיכול להיות מוגבל למסגרת זמן מסוימת. מסגרת הזמן תהיה תלויה בתדירות remating קשורה לגנוטיפ של הנקבה והזכרים בשימוש. ההסתברות להזדווגות מרובה מצטמצמת במיוחד במהלך הלילה 11 פעם.
הערה 2: אל תוסיף כדורי שמרים חיים, כי זה עלול לגרום לבעיות עקב צמיחת יתר של שמרי פוטנציאל כאשר מספר הזבובים הבוגרים הוא נמוך.
3. ניתוח נתונים
- ספירת צאצאי הקלטות צריכה להיות מאורגנת כראוי לבדיקה ויזואלית קלה וניתוח יעיל עם חבילה סטטיסטית מתאימה (למשל JMP ממכון SAS) או כלים מבוססי אינטרנט בחינם (לדוגמא http://vassarstats.net/).
- יכולת התחרותית זרע. הוסף ספירות ומv2 v3. זבובים ממין נקבה שעוררו לא מוגבלים מאוד או צאצאים (למשל <10), נפטרו במהלך ההליך, או שהיו רק בהצלחה inseminaטד על ידי אחד משני הגברים נחשבים לבלתי אינפורמטיבי ואינם נכלל בכל ניתוח סטטיסטי במורד הזרם (2.5.1 וטבלה 2). לחשב את ציון P 2 עבור כל נקבה אינפורמטיבי.
- לבחון האם קיימים הבדלים מובהקים סטטיסטי בערכי P 2 בקרב הגברים בהשוואה הניסיוניים. ניתן לעשות זאת באמצעות פרמטרים (HSD של טיוקי למשל) או שאינן פרמטריים בדיקות (למשל פלדה Dwass) בהתאם למספר גורמים, כולל הטיה של התפלגות ערכי P 2 ותלות בין השונות ואת הממוצע. השינוי זוויתי מיושם בדרך כלל לממדים כגון P 2 לפני השימוש במבחנים פרמטריים 31.
- הפרשי שער מזווגים (אופציונלי). לכל סוג זכר ניסיוני, לחשב את מספר נקבות הזדווגו כפליים ואלה שהזדווגו רק עם הזכר הראשון (זכר ההתייחסות בassay העבירה והגברי הניסיוניים בדassay efense). באמצעות בדיקה המדויקת של פישר שני זנב (זמין בhttp://www.langsrud.com/fisher.htm), לקבוע אם קיימים הבדלים משמעותיים סטטיסטי בין שני הסוגים של גברים ניסיוניים.
- יחס מינים (אופציונלי). לכל זכר ניסיוני, השתמש במבחן צ'י המרובע כדי לקבוע אם יחס מינים בצאצאים מכל נקבה סוטה מ1:1 הצפוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טבלה 2 מסכמת כמה מאפיינים בולטים של שני ניסויי עבירה (מבחני 1 ו -2) שבו ד זכרים ניסיוניים melanogaster עם ובלי (סוג I ו-II, בהתאמה) אשכול SDIC תפקודי הם בהשוואה 14. לאחר שלקח בחשבון מקרים שונים בהם נתקל עם כמה חזרות, 58-83% מהנשים נמצאו להיות אינפורמטיבי ולכן ספירת אבהות של צאצאיהם יכולים לשמש לחישוב P 2. תוצאות של בדיקות שאינן פרמטריים בקנה אחד עם יכולת נמוכה יותר תחרותית בזרע גברים ללא אשכול SDIC (סוג II) בהשוואה לגברים עם האשכול שלם (סוג I) 14. דפוס זה היה שחזור פני מבחני שבוצעו העבירה. מגמה דומה אך לא משמעותית מבחינה סטטיסטית נמצאה במבחני ההגנה שבוצעו במקביל (לא מוצג). חשוב מכך, היעדר הפרשי שער הזדווגות (שלב 3.4) לשלול את האפשרות כיגנוטיפ הזכר יכול להשפיע על התנהגות נשית remating 14.
| Assay העבירה | Assay הביטחון | |||||
| ניסויי ♂ סוג | w 1118 ♀ | OR-R ♂ | ניסוי ♂ | w 1118 ♀ | ניסוי ♂ | OR-R ♂ |
| אני | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
| השני | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
טבלת מס '1. מספר האנשים הדרושים בניסויים כפול הזדווגות להשוואה בין שני סוגים ניסיוניים ממין זכר. OR-R, אורגון-R.
| ♀ | ||||||
| ניסויי ♂ סוג | ספירה ראשונית | אין הפריה מוצלחת עם התייחסות ♂ | אין הפריה מוצלחת עם ♂ הניסיונית | 1 בעייתי | (%) אינפורמטיבי | P 2 2 |
| Assay 1 | ||||||
| B +(סוג I) | 60 | 5 | 6 | 2 | 47 (78%) | 1.000 (1.000-0.987) |
| -(סוג II) | 55 | 1 | 7 | 5 | 42 (76%) | 0,986 (1.000-0.936) |
| Assay 2 | ||||||
| אני + (סוג I) | 74 | 9 | 7 | 15 | 43 (58%) | 1.000 (1.000-0.979) |
| דואר (סוג II) | 75 | 3 | 8 | 2 | 62 (83%) | 0,983 (1.000-0.927) |
טבלת 2. סיכום של ההשפעה של אירועים שונים על מספר הנקבות בשימוש במבחני עבירה שבוצע כדי לבחון את ההבדלים בין סוגים ניסיוניים ממין זכר. 1 נפטר, escaPED במהלך assay, או הוליד מספר הצאצאים מתחת ערך סף. 2 חציון (טווח רבעונים).
איור 1. עיצוב ניסיוני לעבירה ומבחנים הבטחוני. קוד הצבע המשמש עבור כל גנוטיפ מציין את צבע העיניים של הזבוב הבוגר. זכרים אורגון-R משמשים כנקודת התייחסות להשוואה בין בעקיפין את היכולת התחרותית של זרע שני זכרים ניסוי: אחד נושא את הצורה פראית הסוג של הגורם הגנטי במחקר (סוג I) ואחד שבו לפעולה התקינה של הגורם הגנטי כבר מוטרד (סוג II). אשכול SDIC, גורם הגנטי במקרה זה, נמצא על כרומוזום X ואילו transgene SW ממוקם על כרומוזום 2. הניסויים המתוארים הם חלק מאלה שבוצעו ב
איור 2. זיהוי מין בד melanogaster. () הגבי, (ב) לרוחב, ו (ג) צפה בגחון של 1 נקבות ישנות שעה (משמאל) וגברים (מימין) הרדימו עם CO 2 תחת stereomicroscope. איבר המין הגברי הוא באופן משמעותי יותר מאשר פיגמנט צלחת הנרתיק והוליד כתם כהה נראית לעין; זו היא הדמות אמינה ביותר לשימוש עבור זיהוי מין. כמו כן, שורש הרגל של הרגליים הקדמיות זכרים בעלי השוליים של זיפים כהים (מין מסרק) נעדרנקבה. (ד ') זיהוי מין אמין ומהיר של זבובים בוגרים על ידי עין בלתי מזוינת מומלץ מאוד בעת העברת אנשים לתוך צלוחיות באמצעות התקן ליניקה. בקרב אנשים מבוגרים, בטן גברית היא dorsally הרבה יותר כהה מזה של הנקבה. נשים הן בדרך כלל גדולות יותר ויש לי בטן חיוורת יותר מזכרים. צינור ההטלה הופכת את הבטן הנשית הצביעה.
איור 3. נייר רב מקופל משמש כדי להגדיל את השטח פנוי לשיטוט זחלים.
איור 4. קווי מתאר של הניסוי להבדלים ביכולת התחרותית assay זרע בד הזדווגות המונית. melanogaster במשך שעה 2 באמצעות vir נקבות 1118 w ג'ין וזכרי אורגון-R הם יזמו בכל יום במשך 5 ימים. בכל הזדווגות המונית, הופסקו פעם אחת, 12-14 נקבות יש aspirated בנפרד לתוך צלוחיות נפרדות (V1). יומיים לאחר מכן, כל נקבה מועברת לתוך בקבוקון חדש (V2) יחד עם שלושה גברים ניסיוניים של אותו גנוטיפ. אנשים אלו אפשרו להזדווג בן לילה. זכרים שהושלכו לאחר ~ 12 שעות ואילו נקבות מותר oviposit למשך 2 ימים. כתוצאה מכך, נקבות מועברות לתוך צלוחיות חדשות (v3), אפשרו לoviposit שוב, ולבסוף נזרקו לאחר 3 ימים. שלושה עשר עד חמישה עשר ו -17 ימים אחרי הנקבות התחילו oviposit בשניהם v2 ו v3, הולידו צאצאים על ידי הניסוי והתייחסות לזכרים מזוהים באמצעות סמנים מתאימים והקליט. לאחר progenies בV2 V3 ונבדקים פעמיים, את הבקבוקונים מבוטלים. חץ כלפי מטה, אנשים שהושלכו; סמל העין, בדיקת בקבוקון. מעובד מתוך 9.d/50547/50547fig4large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 5. aspirator הגמיש. הורכב מצינור לטקס ענבר, אחד מ"ל 1 סיים את לימודי עצה לקבלת זבובים ותפקוד אחר כמו mouthpart חד פעמית. כדי למנוע זבובים נשאבו לתוך הצינור, משמש בד רשת קנס לגונן-קבלת זבוב הקצה בצומת לצינור.
איור 6. פנוטיפים צפויים בצאצאים של assay העבירה. שמאלה וימינה, חוצים על מנת להעריך את היכולת התחרותית הזרע של שליטה ועקום את הזכרים בהתאמה. גנוטיפ וצבע עיניים לparentals וצאצאים של שניהם Fathers מוצג. בגלל הסמנים הגנטיים מסוימים המשמשים assay זה, רק נקבת הצאצאים יכולים לשמש לחישוב 1 P (או P 2) ציונים (ראה טקסט לפרטים), כאשר חלק מצאצאי הזכרים הוליד על ידי הזכר הניסיוני הוא לבן ועיניים . לכן אין להבחין phenotypically מצאצאי הזכרים של זכר התייחסות DF, מחסור, P {} SW, transgene;. אלל מוטנטי 1118 W של הגן הלבן לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו תאר את עיצוב הניסיון להעריך הבדלים בתרומה היחסית של גנטי מובחן ד זכרים melanogaster לצאצאים בניסויים כפול 7,8 הזדווגות מבוקרות. זה נעשה בהקשר של גורם גנטי שערנו להשפיע על יכולת התחרותית זרע וזה כבר מאויר בתוך assay העבירה למרות שהליך דומה חל על assay ההגנה (איור 1). ניתן לשנות עיצוב ניסיון זה כדי לבדוק היבטים אחרים של הצלחה אבהות כגון השפעה של נקבת גנוטיפ 32. דוגמה לשינויים שיכול להיות משולבים היא הניטור הישיר של הזדווגות בין הנקבה והזכר השני. יתר על כן, חשוב גם לציין כי את הביצועים היחסי של סוגים ניסיוני גברים תלויים בגנוטיפ של בוחן הזכר ונקבה בשימוש, ולכן לא ניתן להסיק לתרחישים אחריםמעורב זכרים ונקבות שונים בודקים 10,32,33.
מאז האוסף של הפרטים הנדרשים (נקבות וזכרי בתולה נאיביים) והניקוד של הצאצאים הם עבודה אינטנסיבית, במספר סוגי גברים ניסיוניים שונים כדי להיות מוערכים צריך להיות מותאם בהתאם למספר אנשים מאומנים היטב זמינים. ניתן לטפל בניסויים שתוארו כאן בקלות על ידי אדם אחד על פני שישה שבועות. למעשה, עד חמישה סוגים ניסיוניים גבריים יכולים להיות מוערכים במקביל. צעד נוסף רק כדי להיות מאומצים הוא להאריך את מספר ימי הקמת הזדווגויות המוניות ראשוניות ואיסוף הפרטים הנדרשים עבורם.
מניסיוננו, מספר ההתחלה של נקבות בשימוש (60-70) הוא מספיק כדי להכיל את הירידה בגודל מדגם מבלי להתפשר על העצמה הסטטיסטית שלנו כדי לזהות הבדלים בין סוגי הגברים ניסיוניים (טבלה 2). הקיטון במספר שלי בנקבות nformative יכולות לנבוע מגורמים שונים, לדוגמא חוסר ראיות של הזדווגות כפולה או מוות בטרם עת. עם זאת, מספר נשים זקוקים לכל סוג זכר ניסיוני על מנת להשיג כוח סטטיסטי נאות ישתנה בהתאם לעוצמת ההשפעה של הגורם הגנטי במחקר. ניסוי פיילוט רצוי מאוד על מנת להעריך את הרמה המתאימה של שכפול.
הבדלים סטטיסטיים ב1 P (או P 2) מצביעים על עשרות וריאציה ביעילות הפריה זכר למרות שהם לא יודיעו על המנגנונים התורמים להבדלים כאלה. זאת בשל משתנים רבים שיכולים להשפיע על יכולת התחרותית זרע (סקר בהרחבה ב20 ו -34). תכונות זרע כמו גודל, מספר ותנועתיות יכולות להשפיע על התחרות של הזרע ישירות 35. בנוסף, מנגנונים אחרים שאינה קשורים לתחרות ישירה הזרע can גם לתרום להבדלים בערכי P 1 או P 2. לדוגמה, בזרע גברי הראשון ניתן להסיר באופן מועדף, מיקומו, או סמוק החוצה לפני או במהלך ההזדווגות עם הזכר השני 19,20. זה יכול להתרחש על ידי גירוי מכאני, למשל, במהלך הזדווגות ובאמצעות מולקולות הנמצאות בנוזל הזרע של הגבר השני, שישפיע לרעה על זרע גברי ראשון 19,36. לכן, מבחני משלימים שלהעריך את ההשפעה של המנגנונים עקיפים נוספים האלה חייבים להתבצע, באופן אידיאלי לפני הניסוי כפול ההזדווגות שתואר כאן. דוגמה למבחנים הם אלו בדיקות להבדלים ביכולת קיום הזיגוטה (הישרדות הזחל לדוגמה) וhatchability ביצה (פרוקסי להפריית ביצית מוצלחת) 28,37, שסופו של דבר לגרום להבדלים במספר צאצאים.
טכניקות הדמיה זרע יכולות להיות גם מאוד אינפורמטיבי 19,24,28. בעיקרו של דבר, אחד oF הזכרים הוא שונה כגון גנטי שהזרע הוא תווית עם חלבון היתוך ניאון (למשל זה של ההתייחסות גברית עם חלבון פלואורסצנטי ירוק) עוזר דינמיקת זרע ניטור במערכת הרבייה הנשית. גישה זו בשילוב עם צביעה נוספת באמצעות 4 ',6-diamidino-2-phenyllindole (DAPI) שימש כדי לזהות ישירות ספירת זרע מהזכרים הראשונים והשני בקיבול זרע גזור של ד melanogaster נשים 24,28. במחקר אחד 24, הבדלים בספירת הזרע היו בהסכם טוב עם הבדלים בערכי P 2 תומכים ברעיון כי אותם ההבדלים באבהות גברית, משקפים הבדלים אמיתיים ביכולת ולא זרע תחרותי של מנגנונים עקיפים.
חידודים שלאחר מכן הושגו על ידי יצירת זנים מהונדסים שהביעו תגי ניאון ירוקים ואדומים התמזגו לחלבוני זרע ספציפיים 19. improvem אלהמציג אפשרו לחוקרים לעקוב אחר הזרע של זרע שניים מתחרה ישירות הגברי עם תואר חסר תקדים של החלטה. לסיכום, ביצוע ניסויים כפול הזדווגות ומבחנים נוספים כמו אלה שהציעו לעזור כדי לצמצם את טבעו של כל הבדלים בציוני P 1 או 2 P נמצאו בין סוגי גברים ניסיוניים, הפותח את האפשרות לנתח את הגנטיקה של הבסיס באופן טבעי וריאציה ביכולת התחרותית זרע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מודים NSF (MCB-1,157,876) למימון. אנו מודים גם אלברטו Civetta, ג'ון Roote, ושני שופטים אלמונים על הערותיהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber latex tubing | VWR | 62996-473 | 1/4 inch ID, 1/6 inch Wall |
| 1 ml graduated XL filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed |
| Parafilm | Sigma | P-7793 | |
| Mesh Fabric | Thin and smooth | ||
| Stereomicroscope | Leica | S6D | |
| CO2 Tank | Airgas | CD-50 | Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available |
| FlyStuff Foot Valve, complete system | Genesee Scientific | 59-121C | Not necessary if FlyNap is used |
| Plastic vials | Genesee Scientific | 32-109 | Come with carboard trays that can be reused for holding vials |
| Cotton balls | Fisher Scientific | AS-212 | |
| Active dry yeast | Red Star | Found in general grocery store | |
| Sharpie markers | Different colors may be used for marking different genotypes |
References
- Darwin, C. The descent of man and selection in relation to sex. , John Murray. (1871).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).
- Birkhead, T. R., Møller, A. P. Sperm competition and sexual selection. , Academic Press. (1998).
- Jones, B., Clark, A. G.
- Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster. Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).
- Jonsson, U. B. Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster. Genetics. 47, 1719-1736 (1962).
- Boorman, E., Parker, G. A. Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status. Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).
- Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C. Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. Smith, R. L. , Academic Press. 372-427 (1984).
- Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster. Genetics. 139, 189-201 (1995).
- Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. Female x male interactions in Drosophila sperm competition. Science. 283, 217-220 (1999).
- Civetta, A., Clark, A. G. Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila. Genet. Res. 75, 143-151 (2000).
- Greenspan, L., Clark, A. G. Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster. Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).
- Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).
- Yeh, S. D., et al. Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).
- Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila. Evolution. 53, 1804-1822 (1999).
- Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A.
- Nonidez, J. F. The internal phenomenon of reproduction in Drosophila. Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).
- Miller, G. T., Pitnick, S.
- Manier, M. K., et al. Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster. Science. 328, 354-357 (2010).
- Simmons, L., Siva-Jothy, M. Sperm competition and sexual selection. Birkhead, T. R., Møller, A. P. , Academic Press. 826 (1998).
- Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila. Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).
- Markow, T. A. A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei. Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).
- Barbadilla, A., Quezada-Díaz, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance. Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).
- Civetta, A. Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila. Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).
- Turner, M. E., Anderson, W. W. Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes. Evolution. 38, 983-995 (1984).
- Harshman, L. G., Clark, A. G. Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila. Evolution. , 1334-1341 (1998).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).
- Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation. Nature. 400, 449-452 (1999).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , CSHL. (1997).
- Sokal, R. R., Rohlf, F. J. Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , 3d, Freeman, W.H. (1994).
- Clark, A. G., Begun, D. J. Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila. Genetics. 149, 1487-1493 (1998).
- Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A.
- Wigby, S., Chapman, T.
- Pizzari, T., Parker, G. A. Sperm biology: an evolutionary perspective. Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. , Academic Press. 674 (2008).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction. Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).
- Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).
