Summary
Differential sperm konkurrenceevne blandt
Abstract
Konkurrencen mellem conspecifikt mænd for gøde æg er en af de mekanismer af seksuel selektion, dvs udvælgelse, der opererer på at maksimere antallet af vellykkede parring begivenheder snarere end på maksimering overlevelse og levedygtighed 1.. Sperm konkurrence repræsenterer konkurrence mellem mænd efter kopulerende med samme kvindelige 2, hvor sæd er tilfældige i tid og rum. Dette fænomen er blevet rapporteret i flere arter af planter og dyr 3.. For eksempel vildtfangede D. melanogaster hunner normalt indeholder sædceller 2-3 hanner 4.. Sæden opbevares i specialiserede organer med begrænset lagerkapacitet, hvilket kunne føre til den direkte konkurrence af sæd fra forskellige hanner 2,5.
Sammenligning sperm konkurrenceevne forskellige hanner af interesse (eksperimentelle mandlige typer) er blevet udført gennem kontrolleret dobbelt parring eksperits i laboratoriet 6,7. Kort fortalt er en enkelt kvinde udsat for to forskellige hanner i træk, et eksperimenterende han og en cross-parring henvises han. Den samme parring Ordningen er derefter fulgt ved hjælp af andre eksperimentelle mandlige typer og dermed letter den indirekte sammenligning af den konkurrencemæssige evne sæd gennem en fælles reference. Fraktionen af individer Hendes far de eksperimentelle og reference hanner er identificeret ved hjælp af markører, der tillader en at estimere sperm konkurrenceevne ved hjælp af simple matematiske udtryk 7,8. Desuden kan sperm konkurrenceevne estimeres i to forskellige scenarier afhængigt af, om den eksperimentelle mandlige er andet eller først at parre (angreb og forsvar assay henholdsvis) 9, som antages at være reflekterende af forskellige kompetence attributter.
Her beskriver vi en fremgangsmåde, der hjælper til at udspørge den rolle forskellige genetiske faktorer, der formodentlig ligger til grund than fænomenet sperm konkurrenceevne i D. melanogaster.
Introduction
Da Geoff Parker bemærkede forekomsten af sperm konkurrence på insekter og dets evolutionære konsekvenser 2, har en bølge af undersøgelser i Drosophila og andre arter har forsøgt at kaste lidt lys over dette fænomen på mange forskellige niveauer. Nogle eksempler på områder af interesse har været undersøgelse af dens variation i naturlige populationer 9,10, dens genetiske arkitektur og relevansen af underliggende genetiske faktorer 11-14, og dens rolle i kørsel coevolution mellem kønnene 15,16. I D. melanogaster hunner, den begrænsede kapacitet af de specialiserede sæd-storage organer, et par spermatheca og skelsættende beholder 6,17, bidrager til konkurrencen af sæd fra forskellige hanner. Ca. 1.500 sædceller overføres under parring til den kvindelige, men kun ~ 500 kan rummes i de nævnte organer 18,19. I laboratoriet kontrolleret dobbelt-parring erfamenter, der involverer en reference mandlig og en eller flere hanner af interesse er blevet flittigt brugt til evaluering sperm konkurrenceevne 7,8.
Sperm konkurrenceevne anslås som andelen af efterkommere far er den eksperimentelle hanhund i double-parring eksperimenter over den samlede afkom, dvs fra både eksperimenterende og reference-hanner. Sperm konkurrenceevne, omfatter to elementer, der hver især vurderet i en separat analyse. I overtrædelsen analysen, evne til den eksperimentelle mandlige sædceller til at fortrænge sæd fra den første mandlige dvs henvisningen mandlige, vurderet er. Omvendt i forsvaret assay, evne til den eksperimentelle mandlige sædceller modstå forskydning eller for at reducere befrugtning succes henvisningen mandlige sædceller bliver vurderet. Afhængigt af hvilken type assay, forsvar og angreb, er sæd konkurrenceevnen estimeret gennem scorerne P 1 eller P 2, hhv. P1 og P 2 kan kun antage værdier mellem 0 og 1. Mellemliggende værdier normalt fortolkes som indirekte bevis af sædceller blanding, hvilket tyder på en fysiologisk scenario med direkte sperm konkurrence. Efter samme rationale, kan ekstreme værdier tolkes som bevis for en stærk differentieret sperm konkurrenceevne. Tidlige undersøgelser viste, at P 2 i D. melanogaster er over 0,8 stigende som den forløbne tid mellem de to parringer forlænger 7.. Denne samme eksperimentelle design er blevet anvendt i andre Drosophila arter, P 2 er den almindeligt anvendte statistik i undersøgelser for at evaluere sperm konkurrenceevne 20.. For de fleste arter er P 2 værdierne for de testede stammer højere end 0,6 21.. Ikke desto mindre kan flere andre mekanismer ikke er relateret til den direkte konkurrence mellem sæd fra forskellige hanner giver identiske scores (se diskussionen).
Distinguishing afkom far er den første eller anden hanner er mulig ved hjælp af let identificerbare markører. I tidlige studier blev en af hannerne bestrålet ved subletale doser, for eksempel røntgenstråler, således at stort set alle æg befrugtet af bestrålet sæd undladt at udklække 7.. Efterfølgende har mutationer ændrer øje pigmentering eller vingeform været de mest almindeligt anvendte markører. Eksempler på førstnævnte er mutationerne legemsvægt (brun) 9 cn (cinnober) 22 og w (hvid) 23, mens mutation CY (Curly) 24 svarer til den anden type fænotyper, og nogle af disse mutationer er blevet kombineret i samme individ, fx cn kropsvægt. I mindre grad har allozymes 25 og mikrosatellitter 26,27 med kendte arv mønstre også blevet brugt.
Det eksperimentelle design til at teste for forskelle isperm konkurrenceevne beskrives her følger det væsentlige, at i Clark et al. 9.. Resultaterne af disse eksperimenter giver information udelukkende om forskellen faderskabet til de eksperimentelle mandlige typer under kontrol. Analyser, der også tage højde for post-befrugtning forskelle i fitness 14,28 og sæd visualiseringsteknikker 24 muliggøre forskelle i P 1 (eller P 2) score fortolkes således, at forskelle i sædceller kompetence.
Figur 1 skitserer rationale for både overtrædelse og de forsvarsmekanismer assays. For at illustrere logistikken af processen, en lovovertrædelse eksperiment udført i D. melanogaster 14 vil blive forklaret i detaljer. Denne særlige handling assay blev anvendt til at teste for en målelig effekt af multigenfamilie Sperm-specifik dynein mellemliggende kæde (SDIC) på sæd konkurrenceevne. Alle medlemmets denne multigenfamilie bor i tandem på X-kromosomet. Knockout hanner blev genereret ved at slette SDIC klynge. Fordi den slettede segment omfattede også essentielle gen korte vinge (SW) og formålet med studiet var at evaluere relevansen af SDIC har mænd bærer SDIC-sw deletion reddet af en transgen kopi af sw (symboliseret som P {SW} , der også gennemført en mini-hvid reportergen) på kromosom 2.. Øjenfarve blev anvendt som en synlig markør for faderskab identifikation. Alle fluer var i en hvid mutant baggrund med undtagelse af dem fra stammen Oregon-R, som blev anvendt som reference-hanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Små eksperimenter bør udføres for at blive fortrolig med hele proceduren.
1.. Indsamling Virgin Hunner og Naive Mænd
Den simpleste version af den skitserede eksperiment består af fire typer af indledende kors, som involverer følgende kombination af voksne: a) w 1118 enkeltpersoner med henblik på at indsamle jomfruelige hunner, b) Oregon-R enkeltpersoner med henblik på at indsamle naive referencepunkter hanner c ) P {SW} homozygote hanner og jomfruelige hunner fra en styreledning der bærer vildtype organisering af SDIC for at indsamle naive eksperimentelle mænd (type I), og d) P {SW} homozygote hanner og SDIC-sw-sletning -bærende jomfruelige hunner for at indsamle naive eksperimentelle hanner, som bærer SDIC-sw-mangel (Type II).
- Oprette flere hætteglas, der indeholder 8-10 hunner og 5 hanner hver. Lad hunnerne til at læggeæg og overføre de voksne til at nye hætteglas hver 3-5 dage. Brug flasker frem hætteglas om nødvendigt og altid bruge friske fødevarer. Det nødvendige antal hætteglas vil afhænge af antallet af eksperimentelle mandlige typer under undersøgelsen og antallet af personer skønnes at være nødvendige for at påvise forskelle (tabel 1). Mere end 10 kvinder pr hætteglas kan resultere i over-crowding under larve vækst, hvilket kan forårsage variationer i frugtbarhed afkommet. Opbevar hætteglas ved 25 ° C i en temperatur-kontrolleret kammer.
- Begynde at indsamle jomfruelige hunner og naive mænd på dage 11 th og 12 th efter opsætning de indledende kors. Venteperioden varierer efter temperatur lavere temperaturer resulterer i længere udviklingsmæssige tid forsinke samling af individer. En anden faktor, der påvirker timing at eclosion er den type medie. Nærende mad, såsom cornmeal-gær-medium 29, forsikrer ordentlig udvikling af den voksnereproduktive system, som letter parring. Saml-sammensat flyver hver 4-6 time. Ved indsamling, bedøver fluer ved at indføre CO 2 ind i hætteglasset, skal du trykke fluerne ned, og sex dem under stereomikroskop (Figur 2). Placer de ønskede fluer i forskellige hætteglas efter køn og fænotype og mærke hætteglassene passende.
Note 1. Indsamling rutine starter i morgen ved at kassere de voksne, der opstod under den foregående aften. Saml jomfruelige hunner og hanner naive én eller to gange om dagen. Typisk, D. melanogaster hanner bliver kønsmodne 8 timer efter eclosion ved 25 ° C 30. Hvis fluer holdes under 12:12 timers lys / mørke cyklus er to toppe af eclosion forventet: i den første 1-2 timer efter lyset er tændt, og i løbet af 2 timer før lyset slukkes. Eclosion sker inden 24 timer efter puppe mørkere.
Note 2. Ikke mere end 10 kvinder shOuld sættes i samme hætteglasset for at forhindre over-crowding. Det begrænser også tabet af kvinder i den sag, de skal kasseres, fordi mindst en af dem ikke er jomfru.
Note 3.. For at indsamle det nødvendige antal af ubrugte hunner og naive mænd i en kort periode, kan følgende foranstaltninger. Opsæt 15-20 hætteglas w 1118 for forsøg med to typer af eksperimentelle mænd (tabel 1). Let drys overfladen af medierne og tilføje et par tørrede aktive gær piller for at lette æglægning. Overfør forældre mindst 4 gange på hinanden følgende dage. At øge den tilgængelige overflade til pupation i hvert hætteglas, indsætte multi-foldet papir (7 x 5 cm) under den 4. eller 5. dag efter forældrene overføres til en anden hætteglasset (figur 3). Hvis antallet af opstået voksne fra den indledende krydsninger ikke er nok, vente et par dage mere, og indsamle individueltals fra hætteglas oprettet på forskellige datoer. Planlæg at udføre forsøgene over flere dage i træk for at udjævne arbejdsbyrden.
2.. Dobbelt parring Eksperimenter
Figur 4 viser de vigtigste trin i dobbelt parring eksperimenter udført i 14.
- Om morgenen den dag 1, der blev oprettet den første parring. Oregon-R hanner er den første til at parre sig i lovovertrædelsen analysen.
- Ved hjælp af sug, der er nedsat hætteglas, der indeholder 4-05 Oktober dage gamle hvidøjet w 1118 jomfruelige hunner og 10 red-eyed Oregon-R naive hanner hver. To til tre hætteglas er oprettet dagligt i 5 dage i træk. Antallet af hætteglas, der skal oprettes kan variere afhængigt af antallet af tilgængelige individer. Lad fluerne at parre i 2 timer.
- Kassér Oregon-R hanner og placere hver hun i et nyt hætteglas med en aspirator (fig. 5). Sex identifikation kan opnås ved visuel inspektion af et parmorfologiske forskelle (se figur 2). Mærk hvert hætteglas hensigtsmæssigt og lade hunnen i hætteglasset for 2 dage (herefter "v1").
- På dag 3, der blev oprettet den anden parring. Udvælgelse af hanner og cross oprettet bør udføres tilfældigt for at minimere enhver potentiel bias i retning af nogen af de eksperimentelle mandlige typer.
- To timer før lyset slukkes, overførsel atter hunnen ind i en ny hætteglasset med en emhætte. Mærk nyt hætteglas korrekt (herefter "v2").
- Indføre tre 5-6 dage gamle eksperimentelle hanner af samme genotype i v2.
- Gentag 2.2.1 og 2.2.2 for hver hun.
- På dag 4, er to timer lige før lyset tændt (dvs. ikke mere end 12 timer efter 2.2.1), kasseres mænd ved hjælp af emhætte.
- På dag 6, overfører hver hun igen ind i en anden nyt hætteglas. Mærk de nye hætteglas passende (herefter "v3").
- På dag 10, kassere w 1118
- Undersøg afkom i v2 og v3. Den første inspektion udføres efter 13-15 dage efter hunnen er indført i v2 (eller v3), fx på Dag 17 efter den kvindelige startede ovipositing i v2. Den anden eftersyn udføres nøjagtigt efter 17 dage. Denne tidsramme udgør en sikker øvre tidsmæssig grænse, der garanterer nogen anden generation i samme hætteglas. To inspektioner forhindre over-crowding samtidig lette afkom tælling.
- På dag 17, inspicere v1 og sikre, at der er røde-eyed afkom til stede, hvis ikke markere hætteglasset i overensstemmelse hermed. Tilstedeværelse af hvidøjet afkom indikerer, at hun ikke var jomfru på tidspunktet for den første parring, mens ingen afkom viser, at parring med referencen eller de eksperimentelle hanner ikke forekomme.
- På dag 17, skal du udføre den første inspektion af v2. Anesthetize opstod afkom i v2 med CO 2 og sortere dem efter øjenfarve og sex. Optag afkom numre far til den første og sekra-hanner. Figur 6 viser de forventede fænotyper hos afkommet af hver parring ordning. I dette særlige eksperiment 14 kan eneste kvindelige afkom entydigt tildeles som far ved reference eller de eksperimentelle hanner, og derfor kun oplysninger fra døtre kan bruges til at beregne P 2. Hvis man med andre markører faderskabet til mandlige afkom utvetydigt kan henføres kan afkom tæller for begge køn skal anvendes i downstream beregninger. Kassér afkom men holde v2 for anden inspektion.
- På dag 20, fortsætte som i 2.5.2 med nyopstået afkom i v2 og derefter kasseres hætteglasset.
- På dag 20, inspicere opstod afkom i v3 for første gang, og følg trin 2.5.2.
- På dag 23, fortsætte som i 2.5.3 med nyopstået afkom i v3.
Note 1: På grund af den potentielle oppustning effekt på P-scores, multipel parring kan have (2.2.2 og 2.2.3), parringkan begrænses til en bestemt tidsramme. Tidsrammen vil afhænge remating frekvens forbundet med genotypen af den kvindelige og brugte hanner. Sandsynligheden for multiple parring er specielt reduceres i natperioden 11.
Note 2: Må ikke tilføje levende gær piller da det kan forårsage problemer på grund potentiel overvækst af gær, når antallet af voksne fluer er lav.
3.. Dataanalyse
- Indspillede afkom tæller bør tilrettelægges hensigtsmæssigt for nem visuel inspektion og effektiv analyse med en passende statistisk pakke (f.eks JMP fra SAS Institute), eller gratis web-baserede værktøjer (fx http://vassarstats.net/ ).
- Sperm konkurrenceevne. Tilføj tæller fra v2 og v3. Kvindelige fluer, der har givet anledning til ingen eller meget begrænset afkom (f.eks <10), døde under proceduren, eller var kun held insemineringindikeret med en af de to mænd er betragtes som ikke-informativ og er udelukket fra enhver nedstrøms statistisk analyse (2.5.1 og tabel 2). Beregn P 2 score for hvert informativ hun.
- Teste, om der er statistisk signifikante forskelle i P 2 værdier blandt de eksperimentelle forhold hanner. Dette kan gøres ved hjælp parametrisk (f.eks Tukey s HSD) eller ikke-parametrisk (f.eks Steel-Dwass) forsøg, afhængigt af flere faktorer, herunder skævhed i fordelingen af P 2 værdier, og afhængigheden mellem variansen og middelværdien. Den vinkel transformation er almindeligt anvendt til proportioner såsom P 2 forud for anvendelse af parametriske tests 31.
- Parring sats forskelle (valgfrit). For hver eksperimentel mandlig type beregne antallet af dobbelt parrede hunner og dem, der kun er parret med den første mandlige (reference hanhund i lovovertrædelsen analysen og den eksperimentelle mandlige i defense assay). Ved hjælp af en to-halet Fishers eksakte test (tilgængelig på http://www.langsrud.com/fisher.htm ), afgøre, om der er statistisk signifikante forskelle mellem de to typer af eksperimentelle hanner.
- Sex ratio (ekstraudstyr). For hver eksperimentel mand, bruge den chi-square test for at afgøre, om kønsfordelingen i afkommet fra hver hun afviger fra den forventede 1:1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 2 sammenfatter nogle væsentlige træk ved to lovovertrædelse eksperimenter (Analyser 1 og 2), hvor D. melanogaster eksperimentelle mænd med og uden (type I og II, henholdsvis) en funktionel SDIC klynge sammenlignes 14.. Efter at have taget hensyn til de forskellige hændelser stødt med nogle gentagelser, blev der 58-83% af hunnerne fundet at være informativ og derfor faderskab tællinger af deres afkom kunne anvendes til beregning af P 2. Resultaterne af ikke-parametriske tests var i overensstemmelse med et lavere sperm konkurrencedygtig evne hos mænd uden SDIC klynge (type II) sammenlignet med mænd med intakt klynge (type I) 14. Dette mønster var reproducerbar tværs lovovertrædelsen udførte analyser. En lignende, men ikke statistisk signifikant tendens blev fundet i forsvar analyser udført parallelt (ikke vist). Vigtigere er det, fravær af parring rentesatsforskelle (trin 3.4) udelukket muligheden for, atden mandlige genotype kan påvirke kvindelige remating opførsel 14..
| Offense Assay | Defense Assay | |||||
| Eksperimentel ♂ Type | w 1118 ♀ | ELLER-R ♂ | Eksperimentel ♂ | w 1118 ♀ | Eksperimentel ♂ | ELLER-R ♂ |
| Jeg | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
| II | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
Tabel 1. Antallet af krævede personer i dobbelt-parring forsøg til sammenligning af to eksperimentelle mandlige typer. ELLER-R, Oregon-R.
| ♀ | ||||||
| Eksperimentel ♂ Type | Initial Count | Ingen vellykket befrugtning med henvisning ♂ | Ingen vellykket befrugtning med eksperimentel ♂ | Problematisk 1 | Informativ (%) | P 2 2 |
| Assay 1 | ||||||
| B +(Type I) | 60 | 5 | 6 | 2 | 47 (78%) | 1,000 (1.000-0.987) |
| A-(type II) | 55 | 1 | 7 | 5 | 42 (76%) | 0,986 (1.000-0.936) |
| Assay 2 | ||||||
| I + (type I) | 74 | 9 | 7 | 15 | 43 (58%) | 1,000 (1.000-0.979) |
| E-(type II) | 75 | 3 | 8 | 2 | 62 (83%) | 0,983 (1.000-0.927) |
Tabel 2. Sammenfatning af virkningerne af forskellige begivenheder på antallet af hunner, der anvendes i lovovertrædelse assays udført for at teste forskelle mellem eksperimentelle mandlige typer. 1. Død, escaped under analysen, eller giver anledning til en række afkom under en tærskelværdi. 2 Median (Kvartilafstand).
Figur 1. Eksperimentel design til angreb og forsvar assays. Farvekoden anvendes til hver genotype betegner øjenfarve af den voksne flue. Oregon-R hanner anvendes som reference til sammenligning indirekte sperm konkurrenceevne af to eksperimentelle hanner: en bærer vildtype-form af den genetiske faktor under undersøgelse (type I), og én, hvor funktionaliteten af den genetiske faktor har været perturbed (type II). Den SDIC klynge, den genetiske faktor i dette tilfælde er placeret på X-kromosomet, mens sw transgenet er placeret på kromosom 2.. De afbildede eksperimenter er en del af dem, der udføres i
Figur 2. Sex identifikation i D. melanogaster. (A) Dorsal, (B) lateral og (C) ventral visning af 1 time gamle kvinder (venstre) og hanner (til højre) bedøvet med CO 2 under stereomikroskop. Den mandlige kønsorganer er væsentligt mere pigmenteret end vaginal plade giver anledning til en tilsyneladende mørk plet, det er den mest pålidelige karakter til brug for kønsbestemmelse. Også haseled af de mandlige forbenene besidder en bræmme af mørke børster (sex kam) fraværende ihun. (D) Pålidelig og hurtig køn identifikation af ældre fluer med blotte øje er stærkt anbefales, når der overføres individer i hætteglas med aspiratorer. I ældre voksne, er han mave dorsalt meget mørkere end hun. Hunnerne er som regel større og har en blegere maven end hannerne. Den ovipositor gør den kvindelige maven pegede.
Figur 3. Multi-foldet papir, der anvendes til at øge den tilgængelige overflade for vandrer larver.
Figur 4.. Outline af eksperimentet til assay forskelle i sperm konkurrenceevne i D. melanogaster. Mass parring i 2 timer ved hjælp af vir gin w 1118 hunner og Oregon-R hanner indledes hver dag i 5 dage. I hver masse parring, når bringes til 12-14 hunner suges separat i individuelle hætteglas (v1). To dage senere, hver hun overføres til et nyt hætteglas (v2) sammen med tre eksperimentelle hanner af samme genotype. Disse personer får lov til at parre natten. Hanner kasseres efter ~ 12 timer, mens hunnerne lov til at lægge æg i 2 dage. Efterfølgende hunner overføres til nye hætteglas (v3), får lov at lægge æg igen, og endelig kasseres efter 3 dage. Tretten til femten og 17 dage efter hunnerne begyndte at lægge æg i både V2 og V3 afkom far af eksperimentelle og reference-hanner er identificeret ved hjælp af passende markører og registreres. Efter descendenter i v2 og v3 kontrolleres to gange, er hætteglassene kasseres. Nedadgående pil, kasserede mennesker; eye symbol, hætteglas inspektion. Tilpasset fra 9..d/50547/50547fig4large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Figur 5. Fleksibel emhætte. Samlet fra rav latex slange, gradueret én 1 ml tip til at modtage fluer og andet fungerer som engangsemballage mouthpart. At forhindre fluer bliver suget ind i røret, er finmasket stof at afskærme flue-modtagende spids i krydset til røret.
Figur 6.. Forventede fænotyper hos afkommet af lovovertrædelsen analysen. Venstre og højre, krydser at vurdere sperm konkurrenceevne kontrol og knock-out mænd hhv. Genotype og øjenfarve for parentals og afkom af både fathers vises. På grund af de særlige genetiske markører, der anvendes i dette assay, kan kun den kvindelige afkom skal bruges til beregning af P 1 (eller P 2) score (se teksten for detaljer) del af den mandlige afkom far er den eksperimentelle mandlige er hvid-eyed og . derfor fænotypisk skelnes fra den mandlige efterkommere af henvisningen mandlige Df, mangel; P {SW}, transgen;. w 1118 mutant allel af det hvide gen Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet den eksperimentelle design til at vurdere forskelle i relative bidrag genetisk forskellige D. melanogaster hanner til afkommet i kontrollerede dobbelt parring eksperimenter 7,8. Dette er sket i forbindelse med en genetisk faktor hypotese at påvirke sperm konkurrenceevne og det er blevet illustreret i overtrædelsen assay selvom en lignende procedure gælder for forsvaret assay (figur 1). Denne eksperimentelle design kan modificeres til at teste andre aspekter af faderskab succes såsom påvirkning af den kvindelige genotype 32.. Et eksempel på de ændringer, der kan integreres er den direkte overvågning af samleje mellem den kvindelige og den anden han. Endvidere er det også vigtigt at bemærke, at den relative ydeevne af de eksperimentelle mandlige typer er afhængig af genotypen af testeren mandlige og kvindelige brugt og derfor ikke kan ekstrapoleres til andre scenarierinvolverer forskellige tester hanner og hunner 10,32,33.
Da indsamlingen af de krævede individer (jomfruelige hunner og naive mænd) og score på afkommet er arbejdskrævende, bør antallet af distinkte eksperimentelle mandlige typer at blive evalueret justeres efter antallet af veluddannet personale til rådighed. Forsøgene, der er skitseret her, kan nemt håndteres af én person over seks uger. I virkeligheden kunne op til fem eksperimentelle mandlige typer evalueres parallelt. Den eneste ekstra foranstaltning, der skal vedtages, er at forlænge det antal dage, oprette oprindelige masse parringer og indsamle de nødvendige personer for dem.
Det er vores erfaring, er udgangspunktet antallet af anvendte hunner (60-70) nok til at rumme reduktion i prøvestørrelse uden at kompromittere vores statistiske styrke til at opdage forskelle mellem de eksperimentelle mandlige typer (tabel 2). Faldet i antallet af Informative hunner kan skyldes forskellige faktorer, for eksempel mangel på beviser for dobbelt parring eller tidlig død. Alligevel vil antallet af hunner er nødvendige for hver eksperimentel mandlig type for at opnå tilstrækkelig statistisk styrke variere efter størrelsen af effekten af den genetiske faktor under undersøgelse. Et pilotforsøg er meget tilrådeligt for at beregne den passende niveau af replikation.
Statistiske forskelle i P 1 (eller P 2) scorer indikerer variation i mandlige gødskningseffektiviteten selv om de ikke informere om de underliggende mekanismer bidrager til sådanne forskelle. Dette skyldes flere variabler, som kan påvirke sædcellerne konkurrenceevne (grundigt gennemgået i 20 og 34). Sperm egenskaber som størrelse, antal og motilitet kan få indflydelse på konkurrencen af sædcellerne direkte 35.. Hertil kommer, ikke andre mekanismer relateret til direkte sperm konkurrence can også bidrage til forskelle i P 1 eller P 2 værdier. For eksempel kan første mandlige sædceller fortrinsvis blive fjernet, flyttes eller skylles ud før eller under parring med den anden hankat 19,20. Dette kan ske ved mekanisk stimulering, for eksempel under samleje og via molekyler til stede i sædvæsken af den anden hankat, som vil påvirke første mandlige sædceller negativt 19,36. Derfor skal komplementære assays, der evaluerer virkningen af disse yderligere indirekte mekanismer skal udføres, ideelt set før dobbelt parring eksperiment beskrevet her. Eksempel på disse analyser er dem test for forskelle i zygote levedygtighed (f.eks larvernes overlevelse) og æg udklækningsprocenten (en proxy for vellykket æg befrugtning) 28,37, som i sidste ende føre til forskelle i afkommet nummer.
Sperm imaging teknikker kan også være yderst informativ 19,24,28. Væsentlige, en of hannerne er modificeret genetisk, således at sædcellerne er mærket med et fluorescerende fusionsprotein (fx at af henvisningen han med et grønt fluorescerende protein) at hjælpe overvågning sædceller dynamik i den kvindelige reproduktive tarmkanalen. Denne fremgangsmåde kombineret med yderligere farvning under anvendelse af 4 ',6-diamidino-2-phenyllindole (DAPI) blev anvendt til direkte at identificere spermietallet fra den første og anden hanner i dissekerede skelsættende beholdere i D. melanogaster hunner 24,28. I en undersøgelse 24, var forskelle i spermietallet i god overensstemmelse med forskelle i P 2 værdier understøtter forestillingen om, at disse forskelle i mænds faderskab var reflekterende af virkelige forskelle i sædceller konkurrenceevne og ikke af indirekte mekanismer.
Efterfølgende forbedringer er opnået ved at generere transgene stammer, som udtrykte grønne og røde fluorescerende mærker fusioneret til sæd-specifikke proteiner 19. Disse improvemforældre har tilladt forskere at overvåge sperm af de to direkte konkurrerende mandlige sædceller med en hidtil uset grad af opløsning. Som konklusion foreslog udførelsen af dobbelt-parring eksperimenter og yderligere analyser som dem hjælpe med at indsnævre arten af eventuelle forskelle i P 1 eller P 2 scoringer findes blandt eksperimentelle mandlige typer, som åbner mulighed for at dissekere genetik grundlag af naturligt forekommende variation i sperm konkurrenceevne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne takker NSF (MCB-1.157.876) til finansiering. Vi takker også Alberto Civetta, John Roote og to anonyme dommere for deres kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber latex tubing | VWR | 62996-473 | 1/4 inch ID, 1/6 inch Wall |
| 1 ml graduated XL filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed |
| Parafilm | Sigma | P-7793 | |
| Mesh Fabric | Thin and smooth | ||
| Stereomicroscope | Leica | S6D | |
| CO2 Tank | Airgas | CD-50 | Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available |
| FlyStuff Foot Valve, complete system | Genesee Scientific | 59-121C | Not necessary if FlyNap is used |
| Plastic vials | Genesee Scientific | 32-109 | Come with carboard trays that can be reused for holding vials |
| Cotton balls | Fisher Scientific | AS-212 | |
| Active dry yeast | Red Star | Found in general grocery store | |
| Sharpie markers | Different colors may be used for marking different genotypes |
References
- Darwin, C. The descent of man and selection in relation to sex. , John Murray. (1871).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).
- Birkhead, T. R., Møller, A. P. Sperm competition and sexual selection. , Academic Press. (1998).
- Jones, B., Clark, A. G.
- Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster. Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).
- Jonsson, U. B. Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster. Genetics. 47, 1719-1736 (1962).
- Boorman, E., Parker, G. A. Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status. Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).
- Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C. Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. Smith, R. L. , Academic Press. 372-427 (1984).
- Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster. Genetics. 139, 189-201 (1995).
- Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. Female x male interactions in Drosophila sperm competition. Science. 283, 217-220 (1999).
- Civetta, A., Clark, A. G. Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila. Genet. Res. 75, 143-151 (2000).
- Greenspan, L., Clark, A. G. Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster. Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).
- Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).
- Yeh, S. D., et al. Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).
- Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila. Evolution. 53, 1804-1822 (1999).
- Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A.
- Nonidez, J. F. The internal phenomenon of reproduction in Drosophila. Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).
- Miller, G. T., Pitnick, S.
- Manier, M. K., et al. Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster. Science. 328, 354-357 (2010).
- Simmons, L., Siva-Jothy, M. Sperm competition and sexual selection. Birkhead, T. R., Møller, A. P. , Academic Press. 826 (1998).
- Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila. Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).
- Markow, T. A. A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei. Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).
- Barbadilla, A., Quezada-Díaz, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance. Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).
- Civetta, A. Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila. Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).
- Turner, M. E., Anderson, W. W. Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes. Evolution. 38, 983-995 (1984).
- Harshman, L. G., Clark, A. G. Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila. Evolution. , 1334-1341 (1998).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).
- Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation. Nature. 400, 449-452 (1999).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , CSHL. (1997).
- Sokal, R. R., Rohlf, F. J. Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , 3d, Freeman, W.H. (1994).
- Clark, A. G., Begun, D. J. Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila. Genetics. 149, 1487-1493 (1998).
- Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A.
- Wigby, S., Chapman, T.
- Pizzari, T., Parker, G. A. Sperm biology: an evolutionary perspective. Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. , Academic Press. 674 (2008).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction. Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).
- Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).
