Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تقييم الاختلافات في القدرة التنافسية في الحيوانات المنوية Published: August 22, 2013 doi: 10.3791/50547
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine

Summary

الفرق الحيوانات المنوية القدرة التنافسية بين

Abstract

المنافسة بين الذكور مناوع لتخصيب البويضات هي واحدة من آليات الانتقاء الجنسي، أي التحديد التي تعمل على تعظيم عدد من الأحداث التزاوج الناجح بدلا من البقاء على قيد الحياة على تعظيم وقدرتها على البقاء 1. المنافسة الحيوانات المنوية يمثل التنافس بين الذكور بعد التزاوج مع نفس الأنثى 2، التي هي من قبيل الصدفة السائل المنوي لديهم في الزمان والمكان. تم الإبلاغ عن هذه الظاهرة في أنواع متعددة من النباتات والحيوانات 3. على سبيل المثال، المصادة D. تحتوي على الإناث البطن عادة الحيوانات المنوية 2-3 الذكور 4. يتم تخزين الحيوانات المنوية في الهيئات المتخصصة مع قدرة تخزين محدودة، والتي قد تؤدي إلى منافسة مباشرة من الحيوانات المنوية من الذكور 2،5 مختلفة.

مقارنة القدرة التنافسية الحيوانات المنوية من الذكور مختلفة من الاهتمام (أنواع الذكور التجريبية) قد أنجز من خلال رقابة التجربه انقر نقرا مزدوجا التزاوجTS في المختبر 6،7. لفترة وجيزة، تتعرض امرأة واحدة لاثنين من الذكور مختلفة على التوالي، ذكر تجريبية واحدة واحدة عبر التزاوج إشارة الذكور. ثم يتبع نظام التزاوج نفسه باستخدام أنواع أخرى ذكر التجريبية مما يسهل المقارنة غير المباشرة من القدرة التنافسية للالسائل المنوي لديهم من خلال مرجعية مشتركة. يتم التعرف على جزء صغير من الأفراد يولدون من التجريبية والمرجعية الذكور باستخدام علامات، الذي يسمح احد لتقدير القدرة التنافسية الحيوانات المنوية باستخدام تعبيرات حسابية بسيطة 7،8. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تقدير القدرة التنافسية الحيوانات المنوية في اثنين من سيناريوهات مختلفة اعتمادا على ما إذا كان الذكور التجريبية هو الثاني أو الأول لزميله (جريمة وفحص الدفاع، على التوالي) 9، والذي يفترض أن يكون معبرا من سمات اختصاص مختلفة.

هنا، نحن تصف النهج الذي يساعد على استجواب دور العوامل الجينية المختلفة التي تكمن وراء مزعومة رانه ظاهرة القدرة التنافسية الحيوانات المنوية في D. البطن.

Introduction

منذ احظت جيف باركر انتشار المنافسة الحيوانات المنوية في الحشرات وآثارها التطوري 2، وقد حاول موجة من الدراسات في ذبابة الفاكهة وغيرها من الأنواع لتسليط بعض الضوء على هذه الظاهرة في العديد من المستويات المختلفة. وكانت بعض الأمثلة من المجالات ذات الاهتمام المسح من التباين في العشائر الطبيعية 9،10، هندسته المعمارية الجينية وأهمية العوامل الوراثية الكامنة وراء 11-14، ودورها في دفع عجلة التطور المشترك بين الجنسين 15،16. في D. البطن الإناث، والقدرة المحدودة للأجهزة تخزين الحيوانات المنوية المتخصصة، وزوج من spermatheca وعاء المنوي 6،17، ويساهم في المنافسة من الحيوانات المنوية من الذكور مختلفة. يتم نقل ما يقرب من 1،500 الحيوانات المنوية أثناء التزاوج إلى أنثى ولكن فقط ~ 500 يمكن استيعابها في الأجهزة المذكورة 18،19. في المختبر، التي تسيطر عليها نقرا مزدوجا التزاوج التجاربالإدلاء بالبيانات التي تنطوي على ذكر مرجع واحد أو أكثر من الذكور من الفائدة التي استخدمت على نطاق واسع لتقييم القدرة التنافسية الحيوانات المنوية 7،8.

ويقدر قدرة تنافسية الحيوانات المنوية ونسبة ذرية انجب من الذكور التجريبية في التجارب نقرا مزدوجا التزاوج على ذرية المجموع، أي أن كلا من الذكور التجريبية والمرجعية. يتألف القدرة التنافسية الحيوانات المنوية عنصرين، كل واحد منهم تقييمها في فحص منفصلة. في مقايسة جريمة، وقدرة الحيوانات المنوية من الذكور التجريبية لتهجير الحيوانات المنوية من الرجال أولا، أي ذكر مرجع، يتم تقييمها. وعلى العكس، في مقايسة الدفاع، وقدرة الحيوانات المنوية من الذكور التجريبية لمقاومة النزوح أو للحد من نجاح الإخصاب من الحيوانات المنوية من الذكور المرجعية وتقييمها. اعتمادا على نوع من الفحص، والدفاع أو جريمة، ويقدر قدرة الحيوانات المنوية التنافسية من خلال عشرات P 1 أو P 2، على التوالي. P1 و P 2 لا يمكن إلا أن تأخذ القيم بين 0 و 1. عادة ما يتم تفسير القيم المتوسطة كدليل غير مباشر من الحيوانات المنوية الاختلاط، الذي يشير إلى وجود سيناريو الفسيولوجية التي تنطوي على منافسة الحيوانات المنوية مباشرة. باتباع نفس المنطق، يمكن تفسير القيم المتطرفة كدليل قوي لقدرة الحيوانات المنوية الفرق المنافسة. وأظهرت الدراسات المبكرة التي P 2 في D. البطن هو أكثر من 0.8 زيادة عن الوقت المنقضي بين اثنين من التزاوج يطيل 7. وقد استخدم نفس هذا التصميم التجريبي في ذبابة الفاكهة الأنواع الأخرى، P 2 يجري إحصاء التي يشيع استخدامها في دراسات لتقييم الحيوانات المنوية القدرة التنافسية 20. بالنسبة لمعظم الأنواع، وP القيم 2 من سلالات اختبار أعلى من 0.6 21. ومع ذلك، يمكن أن عدة آليات أخرى لا علاقة لها منافسة مباشرة بين الحيوانات المنوية من الذكور مختلفة يسفر عن عشرات متطابقة (انظر المناقشة).

Dذرية istinguishing انجب من الذكور الأول أو الثاني هو ممكن من خلال استخدام علامات يسهل التعرف عليها. في الدراسات في وقت مبكر، وكان المشع واحد من الذكور في جرعات شبه مميتة، على سبيل المثال، الأشعة السينية مثل أن جميع البويضات المخصبة بواسطة الحيوانات المنوية المشع فشل ليفقس 7. وفي وقت لاحق، كانت الطفرات تغيير تصبغ العين أو شكل الجناح علامات الأكثر استخداما. أمثلة من السابق هي طفرات من وزن الجسم (البني) 9، CN (الزنجفر) 22 و W (أبيض) 23، في حين أن الطفرات قبرصي (مجعد) 24 يتوافق مع نوع الثاني من الظواهر، وقد تم الجمع بين بعض هذه الطفرات في نفس الشخص، على سبيل المثال CN وزن الجسم. وإلى حد أقل، إنزيمات متغايرة جينيا 25 و 26،27 الصغرية مع أنماط الميراث معروفة استخدمت أيضا.

التصميم التجريبي لاختبار الفروق فيالقدرة التنافسية الحيوانات المنوية وصفها هنا يتبع أساسا أن من كلارك وآخرون. 9. النتائج المستمدة من هذه التجارب تعطي معلومات فقط حول أبوة الفرق من أنواع ذكر التجريبية تحت المجهر. المقايسات التي تجعل أيضا بدل عن الاختلافات بعد الإخصاب في اللياقة البدنية 14،28 وتقنيات التصور الحيوانات المنوية 24 تمكين الاختلافات في P 1 (أو P 2) يسجل أن تفسر على أنها اختلافات في اختصاص الحيوانات المنوية.

الشكل 1 يبين الأساس المنطقي لكل من الجرم والمقايسات الدفاع. لتوضيح اللوجستية للعملية، نفذت تجربة جريمة في D. البطن 14 سيتم شرحها بالتفصيل. وقد استخدم هذا الاختبار جريمة معينة لاختبار للحصول على تأثير يمكن قياسه من عائلة متعددة الجينات الحيوانات المنوية محددة سلسلة وسيطة داينين ​​(SDIC) على القدرة التنافسية الحيوانات المنوية. كل الأعضاءق من هذه العائلة متعددة الجينات الموجودة جنبا إلى جنب على الكروموسوم X. وقد تم توليد الذكور بالضربة القاضية بحذف الكتلة SDIC. لأن الجزء حذف شملت أيضا الجناح قصيرة الجينات الأساسية (SW) وكان الغرض من هذه الدراسة هو تقييم أهمية SDIC، تم انقاذ الذكور تحمل الحذف SDIC-SW بنسخة معدلة وراثيا من SW (يرمز كما P {SW} ، التي حملت أيضا مراسل الجين صغيرة بيضاء) على كروموسوم 2. وقد استخدم لون العينين كعلامة مرئية لتحديد الأبوة. كانت كل الذباب في خلفية متحولة الأبيض مع استثناء من تلك السلالة من ولاية أوريغون-R، والتي كانت تستخدم لذكور المرجعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يجب أن يتم تنفيذ التجارب على نطاق صغير لتصبح مألوفة مع الإجراء بأكمله.

1. جمع إناث والذكور العذراء السذاجة

أبسط نسخة من التجربة المذكورة تتكون من أربعة أنواع من الصلبان الأولية، التي تنطوي على التركيبة التالية من البالغين: أ) W الأفراد 1118 من أجل جمع الإناث عذراء؛ ب) الأفراد أوريغون-R من أجل جمع الذكور إشارة ساذجة؛ ج ) P {} SW الذكور والإناث متماثلة اللواقح عذراء من خط السيطرة الذي يحمل المنظمة من النوع البري من SDIC من أجل جمع الذكور التجريبية السذاجة (النوع الأول)، ود) P {} SW الذكور متماثلة اللواقح وSDIC-SW-الحذف التي تحمل الإناث العذراء من أجل جمع الذكور التجريبية الساذجة التي تحمل نقص SDIC-SW (النوع الثاني).

  1. إعداد قوارير متعددة تحتوي على 8-10 إناث و 5 ذكور لكل منهما. السماح للإناث لوضعالبيض ونقل أشخاص إلى قارورة جديدة كل 3-5 أيام. استخدام زجاجات بدلا من قوارير إذا لزم الأمر، ودائما استخدام المواد الغذائية الطازجة. وعدد من قوارير المطلوبة تعتمد على عدد من أنواع ذكر التجريبية قيد الدراسة وعدد من الأفراد يقدر أن يكون من الضروري كشف الفروق (الجدول 1). أكثر من 10 من الإناث في قارورة قد تؤدي إلى الإفراط في الازدحام خلال نمو اليرقات، والتي قد تسبب التباين في خصوبة النسل. قارورة مخزن عند 25 درجة مئوية في غرفة التحكم في درجة حرارته.
  2. البدء في جمع الإناث والذكور عذراء ساذجة في الأيام ال 11 و 12 ال بعد إعداد الصلبان الأولي. فترة الانتظار تتغير وفقا لدرجة الحرارة، وانخفاض درجات الحرارة في نتيجة قتا أطول التنموية تأخير مجموعة من الأفراد. وثمة عامل آخر يؤثر على توقيت لeclosion هو نوع من المتوسط. الطعام المغذي، مثل دقيق الذرة متوسطة-29 الخميرة، ويؤكد تطور السليم للبالغينالجهاز التناسلي، مما يسهل التزاوج. جمع unmated تطير كل 4-6 ساعة. عندما جمع، تخدير الذباب عن طريق إدخال CO 2 في قارورة، والاستفادة من الذباب إلى أسفل، والجنس منهم تحت stereomicroscope (الشكل 2). وضع الذباب المطلوب في قوارير مختلفة حسب الجنس والنمط الظاهري وتسمية قارورة بشكل مناسب.

ملاحظة 1. يبدأ روتين جمع في الصباح قبل التخلص من البالغين التي برزت خلال الليلة السابقة. جمع الإناث والذكور العذراء السذاجة مرة واحدة أو مرتين خلال النهار. عادة، D. الذكور البطن تصبح ناضجة جنسيا 8 ساعة بعد eclosion عند 25 ° C 30. إذا تمسك الذباب تحت 12:12 ساعة الضوء / الظلام دورات، ومن المتوقع قمتين من eclosion: خلال ساعة الأولى 1-2 بعد تشغيل الضوء على، وخلال ساعة 2 قبل تشغيل ضوء قبالة. يحدث في غضون 24 ساعة Eclosion بعد يظلم خادرة.

ملاحظة 2. لا يزيد عن 10 من الإناث SHتوضع ولد في نفس القارورة لمنع الإفراط في الازدحام. هذا يحد أيضا من فقدان للإناث في حالة لديهم ليتم التخلص منها لأن واحدا منهم على الاقل ليس العذراء.

ملاحظة 3. من أجل جمع العدد المناسب من الإناث والذكور عذراء ساذجة في فترة زمنية قصيرة، ويمكن اعتماد التدابير التالية. إعداد قنينة من 15-20 ث 1118 لإجراء التجارب التي تنطوي على نوعين من الذكور التجريبية (الجدول 1). رش بخفة على سطح وسائل الإعلام وإضافة بضع المجففة الكريات الخميرة نشطة لتسهيل وضع البيض. نقل الآباء على الأقل 4 مرات في أيام متتالية. لزيادة السطح المتاحة للالتشرنق في كل قارورة، إدراج ورقة متعددة مطوية (7 × 5 سم) خلال اليوم الخامس عشر 4 أو 5 بعد يتم تحويل الآباء إلى قارورة أخرى (الشكل 3). وإذا كان عدد البالغين خرجت من الصلبان الأولي لا يكفي، والانتظار لبضعة أيام وجمع األفرادALS من القنينات التي أقيمت في تواريخ مختلفة. خطة لتنفيذ التجارب على مدى عدة أيام متتالية حتى خارج عبء العمل.

2. تجارب نقرا مزدوجا التزاوج

ويبين الشكل 4 خطوات الرئيسية التي تشارك في التجارب نقرا مزدوجا التزاوج التي أجريت في 14.

  1. في صباح يوم 1، إعداد التزاوج الأول. الذكور أوريغون-R هي أول لزميله في مقايسة جريمة.
    1. باستخدام الشافطة، إعداد قارورة تحتوي على 10 أبيض العينين ث الإناث عذراء 1118 4-5 يوما و 10 أحمر العينين أوريغون-R الذكور السذاجة لكل منهما. يتم تعيين اثنين إلى ثلاثة قوارير تصل يوميا لمدة 5 أيام متتالية. قد تختلف عدد القنينات التي ستنشأ اعتمادا على عدد من الأفراد المتاحة. السماح للذباب لزميله لمدة 2 ساعة.
    2. تجاهل الذكور أوريغون-R وتضع كل أنثى في قارورة جديدة باستخدام الشافطة (الشكل 5). لا يمكن أن يتحقق تحديد الجنس عن طريق التفتيش البصري من عدد قليل منالاختلافات المورفولوجية (الشكل 2). تسمية كل قارورة بشكل مناسب وترك الأنثى في قارورة لمدة 2 يوم (الآخرة "V1").
  2. في يوم 3، وإعداد التزاوج الثاني. يجب أن يتم تنفيذ مجموعة من الذكور وعبر إعداد عشوائيا من أجل تقليل أي تحيز محتمل تجاه أي من أنواع ذكر التجريبية.
    1. قبل ساعتين من تشغيل ضوء قبالة، ونقل مرة أخرى الأنثى إلى قارورة جديدة مع الشافطة. تسمية القارورة الجديدة بشكل مناسب (الآخرة "V2").
    2. أعرض ثلاثة ذكور التجريبية 5-6 أيام من العمر من نفس النمط الجيني إلى V2.
    3. كرر 2.2.1 و 2.2.2 لكل أنثى.
    4. في يوم 4، ساعتين الحق قبل ضوء في وضع التشغيل (أي ما لا يزيد عن 12 ساعة بعد 2.2.1)، وتجاهل الذكور باستخدام الشافطة.
  3. في يوم 6، ونقل كل أنثى مرة أخرى إلى قارورة أخرى جديدة. تسمية قارورة جديدة بشكل مناسب (الآخرة "V3").
  4. في يوم 10، وتجاهل 1118 ث
  5. دراسة السلالات في V2 و v3. يتم تنفيذ عملية التفتيش الأولى بعد 13-15 يوما بعد أن يتم إدخال الأنثى في V2 (أو V3)، على سبيل المثال في يوم 17 بعد أول امرأة في ovipositing بدأت في V2. يتم تنفيذ عملية التفتيش الثانية بالضبط بعد 17 يوما. هذا الإطار الزمني يشكل الحدود الزمانية العلوي آمن يضمن أي الجيل الثاني في نفس القارورة. عمليتي تفتيش منع الإفراط في الازدحام مع تسهيل العد ذرية.
    1. في يوم 17، وفحص V1 وضمان عدم وجود ذرية أحمر العينين الحاضر، وإذا كان لا علامة القارورة وفقا لذلك. جود ذرية بيضاء العينين يشير إلى أن الإناث لم يكن عذراء في وقت التزاوج الأولي في حين لا ذرية يشير إلى أن التزاوج مع الإشارة أو الذكور التجريبية لم يحدث.
    2. في يوم 17، نفذ أول عملية تفتيش من V2. ظهرت تخدير ذرية في V2 مع CO 2 وفرزها حسب اللون العين والجنس. أرقام ذرية سجل أنجب من الأولى والثانيةالذكور أندو. الشكل 6 يبين الظواهر المتوقعة في ذرية من كل مخطط التزاوج. في هذه التجربة 14 خاصة، فقط ذرية الإناث يمكن تعيين بشكل لا لبس فيه كما انجب من الإشارة أو الذكور التجريبية، وبالتالي فقط على المعلومات من بنات يمكن استخدامها لحساب P 2. إذا مع علامات أخرى في أبوة ذرية من الذكور يمكن تعيين بشكل لا لبس فيه، التهم ذرية من كلا الجنسين يمكن استخدامها في العمليات الحسابية المصب. تجاهل ذرية ولكن يبقى V2 للتفتيش الثاني.
    3. في يوم 20، والمضي قدما كما هو الحال في 2.5.2 مع السلاله ظهرت حديثا في V2 ثم تجاهل القارورة.
    4. في يوم 20، وفحص ذرية ظهرت في V3 للمرة الأولى واتبع الخطوة 2.5.2.
    5. في يوم 23، والمضي قدما كما هو الحال في 2.5.3 مع السلاله ظهرت حديثا في V3.

ملاحظة 1: ونظرا لتأثير محتمل على تضخيم عشرات P أن التزاوج متعددة قد يكون (2.2.2 و 2.2.3)، التزاوجيمكن أن تقتصر على فترة زمنية معينة. والإطار الزمني تعتمد على تردد remating المرتبطة النمط الجيني للإناث والذكور المستخدمة. يتم تقليل احتمال التزاوج متعددة خصيصا من مرة خلال الليل 11.

ملاحظة 2: لا تقم بإضافة حبيبات الخميرة الحية لأن هذا قد يسبب مشاكل بسبب فرط المحتملة من الخميرة عندما يكون عدد الذباب الكبار منخفضة.

3. تحليل البيانات

  1. وينبغي تنظيم التهم ذرية سجلت مناسب للتفتيش البصرية سهل والتحليل كفاءة مع الحزمة الإحصائية المناسبة (مثل أحزاب اللقاء المشترك من معهد SAS) أو أدوات مجانية على شبكة الإنترنت (على سبيل المثال http://vassarstats.net/ ).
  2. القدرة التنافسية الحيوانات المنوية. أضف التهم من V2 و v3. الذباب الإناث التي أدت إلى ما لا أو محدودة جدا ذرية (على سبيل المثال <10)، توفي أثناء إجراء، أو كانت بنجاح إلا inseminaتعتبر تيد من قبل واحدة من الذكور اثنان على أنها غير مفيدة ومستثناة من أي تحليل إحصائي المصب (2.5.1 والجدول 2). حساب P 2 درجة لكل أنثى بالمعلومات.
  3. اختبار ما إذا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية في القيم P 2 بين الذكور التجريبية مقارنة. ويمكن القيام بذلك باستخدام حدودي (HSD مثل توكي) أو غير المعلمية الاختبارات (مثل الصلب Dwass) اعتمادا على عدة عوامل بما في ذلك عن أي انحراف في توزيع القيم P 2 والتبعية بين التباين والمتوسط. يتم تطبيق التحول الزاوي عادة إلى أبعاد مثل P 2 قبل استخدام الاختبارات المعلمية 31.
  4. الاختلافات معدل التزاوج (اختياري). لكل نوع من الذكور التجريبية، وحساب عدد الإناث تزاوج على نحو مضاعف، وتلك التي تزاوج فقط مع ذكر الأول (ذكر مرجع في مقايسة الجرم وذكر التجريبية في دefense مقايسة). باستخدام اختبار ثنائي الطرف فيشر الدقيق (متوفر في http://www.langsrud.com/fisher.htm )، وتحديد ما إذا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين هذين النوعين من الذكور التجريبية.
  5. نسبة الجنس (اختياري). لكل من الذكور التجريبية، استخدم اختبار خي مربع لتحديد ما إذا كانت النسبة بين الجنسين في ذرية من كل ينحرف أنثى من نسبة 1:1 المتوقعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يلخص الجدول 2 بعض السمات البارزة لتجربتين جريمة (فحوصات 1 و 2) التي D. تتم مقارنة البطن الذكور التجريبية مع وبدون (النوع الأول والثاني، على التوالي) كتلة SDIC الوظيفية 14. بعد الأخذ في الاعتبار حالات مختلفة واجهتها مع بعض مكررات، تم العثور على 58-83٪ من الإناث أن تكون مفيدة، وبالتالي فإن التهم الأبوة من ذريتها يمكن أن تستخدم لحساب P 2. كانت نتائج الاختبارات غير المعلمية متسقة مع انخفاض القدرة التنافسية الحيوانات المنوية في الذكور دون الكتلة SDIC (النوع الثاني) بالمقارنة مع الذكور مع الكتلة سليمة (النوع الأول) 14. وكان هذا النمط استنساخه عبر المقايسات جريمة يؤدونها. تم العثور على اتجاه مماثل ولكن ليس ذات دلالة إحصائية في المقايسات الدفاع يقوم بالتوازي (لا يظهر). الأهم من ذلك، استبعد عدم وجود خلافات معدل التزاوج (الخطوة 3.4) من احتمال أنالنمط الجيني الذكور يمكن أن تؤثر على سلوك الإناث remating 14.

الفحص جريمة الفحص الدفاع
التجريبية ♂ نوع ث 1118 ♀ OR-R ♂ التجريبية ♂ ث 1118 ♀ التجريبية ♂ OR-R ♂
أنا 60-70 60-70 180-210 60-70 60-70 180-210
II 60-70 60-70 180-210 60-70 60-70 180-210

الجدول 1. عدد الأفراد المطلوب في التجارب نقرا مزدوجا التزاوج لمقارنة نوعين من الذكور التجريبية. OR-R، أوريغون-R.

♀
التجريبية ♂ نوع عدد أولي لا إخصاب ناجحة مع الإشارة ♂ لا إخصاب ناجحة مع التجريبية ♂ إشكالية 1 الإعلامية (٪) P 2 2
مقايسة 1
B +(النوع الأول) 60 5 6 2 47 (78٪) 1،000 (1.000-0.987)
A-(النوع الثاني) 55 1 7 5 42 (76٪) 0،986 (1.000-0.936)
مقايسة 2
أنا + (النوع الأول) 74 9 7 15 43 (58٪) 1،000 (1.000-0.979)
E-(النوع الثاني) 75 3 8 2 62 (83٪) 0،983 (1.000-0.927)

الجدول 2. ملخص لتأثير الأحداث المختلفة على عدد الإناث المقايسات المستخدمة في جريمة يؤديها لاختبار الفروق بين أنواع الذكور التجريبية. 1 مات، اسكاPED خلال الفحص، أو مما أدى إلى عدد من ذرية أقل من قيمة العتبة. 2 متوسط ​​(المدى الربيعي).

الشكل 1
الشكل 1. التصميم التجريبي للجريمة والمقايسات الدفاع. رمز اللون المستخدم لكل الوراثي يدل على لون العين على ذبابة الكبار. وتستخدم الذكور أوريغون-R كمرجع للمقارنة بشكل غير مباشر على القدرة التنافسية الحيوانات المنوية من اثنين من الذكور التجريبية: واحد يحمل شكل من النوع البري من العامل الوراثي قيد الدراسة (النوع الأول) وواحدة في التي كانت وظيفة العامل الوراثي قلق (النوع الثاني). يقع الكتلة SDIC، العامل الوراثي في هذه الحالة، على كروموسوم X بينما SW التحوير يقع على الكروموسوم 2. التجارب يصور هي جزء من تلك التي أجريت في مدافع (SDIC، SW)، بما في ذلك نقص الأسرة متعددة الجينات SDIC وSW الجينات المجاورة. Y، Y كروموسوم؛ P {} SW، التحوير؛ ث 1118 أليل متحولة من الجين الأبيض.

الشكل 2
الشكل 2. تحديد الجنس في D. البطن. (A) الظهرية، (B) الوحشي، و (C) عرض بطني من 1 ساعة الإناث القديمة (يسار) والذكور (يمين) تخدير مع CO 2 تحت stereomicroscope. الأعضاء التناسلية الذكرية هو إلى حد كبير أكثر المصطبغة من لوحة المهبل مما أدى إلى بقعة مظلمة واضحة، وهذا هو الحرف الأكثر موثوقية لاستخدامها ل[سإكسينغ. أيضا، في طرسوس من اليدين ذكر تمتلك هامش الظلام شعيرات (الجنس مشط) غائبة فيأنثى. (D) موثوقة وسريعة تحديد نوع الجنس من الذباب كبار السن بالعين المجردة ينصح بشدة عند نقل الأفراد إلى قارورة باستخدام المضخة. في البالغين الأكبر سنا، البطن ذكر هو ظهريا أكثر قتامة بكثير من الأنثى. الإناث عادة ما تكون أكبر ويكون البطن ونا من الذكور. على حامل البيض يجعل أشار البطن الإناث.

الشكل (3)
الشكل (3). ورقة مطوية متعددة تستخدم لزيادة السطح المتاحة للتجول اليرقات.

الشكل 4
الشكل 4. الخطوط العريضة للتجربة لفحص الفروق في القدرة التنافسية في الحيوانات المنوية D. البطن. التزاوج قداس لمدة 2 ساعة باستخدام فير وبدأ الجن ث الإناث 1118 والذكور ولاية أوريغون-R كل يوم لمدة 5 أيام. في كل التزاوج الشامل، وبمجرد إنهاء، يجب أن يستنشق 12-14 الإناث بشكل منفصل في قارورة الفردية (V1). بعد ذلك بيومين، يتم نقل كل أنثى في قارورة جديدة (V2) جنبا إلى جنب مع ثلاثة ذكور التجريبية من نفس النمط الجيني. ويسمح هؤلاء الأفراد للتزاوج بين عشية وضحاها. يتم تجاهل الذكور بعد ~ 12 ساعة في حين يتم السماح للإناث oviposit لمدة 2 ايام. بعد ذلك، يتم نقل الإناث في قوارير جديدة (V3)، يسمح للoviposit مرة أخرى، وأخيرا التخلص منها بعد 3 أيام. بعد ثلاثة عشر إلى خمسة عشر و 17 يوما بدأت الإناث إلى oviposit في كل V2 و v3، ذرية أنجب من الذكور التجريبية والمرجعية يتم تحديدها باستخدام علامات مناسبة وتسجيلها. بعد أن يتم فحص السلالات في V2 V3 ومرتين، يتم تجاهل قارورة. سهم الهبوط، والأفراد التخلص منها؛ رمز العين، والتفتيش القارورة. مقتبس من 9.d/50547/50547fig4large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

الرقم 5
الشكل 5. الشافطة مرنة. تجميعها من العنبر أنابيب المطاط، وتخرج واحدة 1 مل إبعاد الذباب عن تلقي وعمل آخر كما mouthpart القابل للتصرف. لمنع الذباب للانجرار في أنبوب، ويستخدم غرامة شبكة نسيج لحماية الطيران تلقي معلومات سرية على مفترق الطرق إلى الأنبوب.

الشكل (6)
الشكل (6). الظواهر المتوقعة في ذرية للمقايسة جريمة. اليسار واليمين، والصلبان لتقييم القدرة التنافسية الحيوانات المنوية من الذكور السيطرة وخروج المغلوب على التوالي. التركيب الوراثي ولون العين parentals وآله من كل جمعةوتظهر athers. بسبب علامات وراثية معينة المستخدمة في هذا الاختبار، فقط على سلالة الإناث يمكن استخدامها لحساب P 1 (أو P 2) عشرات (انظر النص للحصول على التفاصيل)؛ جزء من ذرية الذكور انجب من الذكور التجريبية هو أبيض العينين و وبالتالي لا يمكن تمييزها ظاهريا من ذرية الذكور من الذكور إشارة DF، نقص؛ P {} SW، التحوير؛ ث أليل متحولة 1118 من الجين الأبيض انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصفناها التصميم التجريبي لتقييم الاختلافات في المساهمة النسبية متميزة وراثيا D. الذكور البطن إلى ذرية في التجارب التي تسيطر عليها نقرا مزدوجا التزاوج 7،8. وقد تم ذلك في سياق العامل الوراثي الافتراض للتأثير على القدرة التنافسية الحيوانات المنوية، وقد تم توضيح ذلك في غضون الفحص جريمة على الرغم من إجراء مماثل ينطبق على فحص الدفاع (الشكل 1). هذا التصميم التجريبي يمكن تعديلها لاختبار الجوانب الأخرى من نجاح الأبوة مثل تأثير التركيب الوراثي الإناث 32. مثال على التعديلات التي يمكن إدراجها هو الرصد المباشر من الجماع بين الإناث والذكور الثانية. علاوة على ذلك، فمن المهم أيضا أن نلاحظ أن الأداء النسبي لأنواع الذكور التجريبية تعتمد على التركيب الوراثي للاختبار من الذكور والإناث المستخدمة، وبالتالي لا يمكن استقراء لسيناريوهات أخرىتشمل الذكور والإناث اختبار مختلف 10،32،33.

منذ جمع من الأفراد المطلوبة (الإناث والذكور عذراء ساذجة) والتهديف من ذرية هي كثيفة العمالة، ينبغي تعديل عدد من أنواع مختلفة من الذكور التجريبية التي سيتم تقييمها وفقا لعدد من الموظفين المدربين تدريبا جيدا المتاحة. التجارب المذكورة هنا يمكن التعامل معها بسهولة من قبل شخص واحد أكثر من ستة أسابيع. في الواقع، يمكن تقييم ما يصل إلى خمسة أنواع الذكور التجريبية في نفس الوقت. التدبير إضافية إلا أن المعتمد هو لإطالة عدد أيام إقامة التزاوج الكتلة الأولية وجمع الأفراد اللازمة لها.

في تجربتنا، ورقم البداية من الإناث المستخدمة (60-70) ما يكفي لاستيعاب الانخفاض في حجم عينة من دون المساومة على قوة إحصائية جهدنا لكشف الفروق بين أنواع الذكور التجريبية (الجدول 2). انخفاض في عدد من أنايمكن الإناث nformative تنجم عن عوامل مختلفة، على سبيل المثال عدم وجود أدلة من التزاوج مزدوجة أو الوفاة المبكرة. ومع ذلك، فإن عدد الإناث اللازمة لكل نوع من الذكور التجريبية من أجل تحقيق قوة إحصائية كافية تختلف تبعا لحجم تأثير العامل الوراثي قيد الدراسة. تجربة رائدة من المستحسن للغاية من أجل تقدير مستوى مناسب من النسخ المتماثل.

فروق ذات دلالة إحصائية في P 1 (أو P 2) عشرات تشير إلى التباين في كفاءة التسميد الذكور على الرغم من أنها لا تبلغ عن الآليات الأساسية التي تسهم في مثل هذه الاختلافات. ومن المقرر أن المتغيرات المتعددة التي يمكن أن تؤثر على القدرة التنافسية الحيوانات المنوية (مراجعة على نطاق واسع في 20 و 34) هذا. يمكن أن سمات مثل حجم الحيوانات المنوية وعددها والحركة تؤثر على المنافسة من الحيوانات المنوية 35 مباشرة. وبالإضافة إلى ذلك، آليات أخرى لا علاقة للمنافسة الحيوانات المنوية مباشرة CAن تسهم أيضا في الاختلافات في P 1 أو P القيم 2. على سبيل المثال، أول الحيوان المنوي يمكن إزالتها بشكل تفضيلي، أعادت، أو يخرجوا قبل أو أثناء التزاوج مع الذكور 19،20 ثانية. يمكن أن يحدث هذا عن طريق التحفيز الميكانيكي، على سبيل المثال، أثناء الجماع وعبر الجزيئات الموجودة في السائل المنوي للذكر الثانية، الأمر الذي سيؤثر سلبا على الحيوانات المنوية الذكرية الأولى 19،36. ولذلك، يجب إجراء فحوصات تكميلية أن تقييم أثر هذه الآليات غير المباشرة الإضافية، قبل مثالي لتجربة مزدوجة التزاوج هو موضح هنا. مثال على هذه المقايسات هي تلك الاختبارات للاختلافات في قابلية البيضة الملقحة (مثل بقاء اليرقات) ونسبة الفقس البيض (وكيل لنجاح الإخصاب البيض) 28،37، والتي تؤدي في نهاية المطاف الاختلافات في عدد ذرية.

يمكن أن تقنيات التصوير الحيوانات المنوية أيضا أن تكون غنية بالمعلومات 19،24،28. أساسا، واحد سو يتم تعديل هذه الذكور وراثيا أن الحيوانات المنوية هو المسمى مع بروتين الانصهار فلوري (على سبيل المثال أن من ذكر المرجعية مع بروتين الفلورية الخضراء) يساعد رصد ديناميات الحيوانات المنوية في الجهاز التناسلي للأنثى. وقد استخدم هذا النهج جنبا إلى جنب مع مزيد من تلطيخ باستخدام 4 '،6-diamidino-2-phenyllindole (دابي) لتحديد عدد الحيوانات المنوية مباشرة من الذكور الأولى والثانية في أوعية المنوي تشريح من D. الإناث 24،28 البطن. في دراسة واحدة 24، وكانت الفروق في عدد الحيوانات المنوية في اتفاق جيد مع وجود اختلافات في القيم P 2 يدعم فكرة أن تلك الاختلافات في أبوة الذكور كانت تعكس الاختلافات الحقيقية في القدرة التنافسية الحيوانات المنوية وليس من الآليات غير المباشرة.

وقد تم تحقيق تحسينات لاحقة عن طريق توليد سلالات معدلة وراثيا أن أعرب به نيون الأخضر والأحمر تنصهر للبروتينات الحيوانات المنوية الخاصة 19. هذه improvemوقد سمح الوالدان الباحثين لرصد الحيوانات المنوية من المتنافسين مباشرة الحيوان المنوي مع درجة غير مسبوقة من القرار. وفي الختام، اقترح تنفيذ التجارب نقرا مزدوجا التزاوج والمقايسات إضافية مثل تلك التي تساعد على تضييق طبيعة أي اختلافات في P 1 أو P 2 عشرات جدت بين أنواع الذكور التجريبية، والذي يفتح إمكانية لتشريح أساس الوراثة من تحدث بشكل طبيعي التباين في القدرة التنافسية الحيوانات المنوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

المؤلفان بالشكر NSF (MCB-1157876) للحصول على التمويل. كما نشكر البرتو سيفتا، جون Roote، واثنين من الحكام المجهولين على تعليقاتهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber latex tubing VWR 62996-473 1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips USA Scientific 1126-7810 Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm Sigma P-7793
Mesh Fabric Thin and smooth
Stereomicroscope Leica S6D
CO2 Tank Airgas CD-50 Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system Genesee Scientific 59-121C Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials Genesee Scientific 32-109 Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls Fisher Scientific AS-212
Active dry yeast Red Star Found in general grocery store
Sharpie markers Different colors may be used for marking different genotypes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Darwin, C. The descent of man and selection in relation to sex. , John Murray. (1871).
  2. Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).
  3. Birkhead, T. R., Møller, A. P. Sperm competition and sexual selection. , Academic Press. (1998).
  4. Jones, B., Clark, A. G. Bayesian sperm competition estimates. Genetics. 163, 1193-1199 (2003).
  5. Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster. Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).
  6. Jonsson, U. B. Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster. Genetics. 47, 1719-1736 (1962).
  7. Boorman, E., Parker, G. A. Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status. Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).
  8. Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C. Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. Smith, R. L. , Academic Press. 372-427 (1984).
  9. Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster. Genetics. 139, 189-201 (1995).
  10. Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. Female x male interactions in Drosophila sperm competition. Science. 283, 217-220 (1999).
  11. Civetta, A., Clark, A. G. Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila. Genet. Res. 75, 143-151 (2000).
  12. Greenspan, L., Clark, A. G. Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster. Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).
  13. Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).
  14. Yeh, S. D., et al. Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).
  15. Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila. Evolution. 53, 1804-1822 (1999).
  16. Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A. Ejaculate-female coevolution in Drosophila mojavensis. Proc. Biol. Sci. 270, 1507-1512 (2003).
  17. Nonidez, J. F. The internal phenomenon of reproduction in Drosophila. Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).
  18. Miller, G. T., Pitnick, S. Sperm-female coevolution in Drosophila. Science. 298, 1230-1233 (2002).
  19. Manier, M. K., et al. Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster. Science. 328, 354-357 (2010).
  20. Simmons, L., Siva-Jothy, M. Sperm competition and sexual selection. Birkhead, T. R., Møller, A. P. , Academic Press. 826 (1998).
  21. Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila. Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).
  22. Markow, T. A. A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei. Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).
  23. Barbadilla, A., Quezada-Díaz, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance. Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).
  24. Civetta, A. Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila. Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).
  25. Turner, M. E., Anderson, W. W. Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes. Evolution. 38, 983-995 (1984).
  26. Harshman, L. G., Clark, A. G. Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila. Evolution. , 1334-1341 (1998).
  27. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).
  28. Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation. Nature. 400, 449-452 (1999).
  29. Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  30. Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , CSHL. (1997).
  31. Sokal, R. R., Rohlf, F. J. Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , 3d, Freeman, W.H. (1994).
  32. Clark, A. G., Begun, D. J. Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila. Genetics. 149, 1487-1493 (1998).
  33. Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A. Nontransitivity of sperm precedence in Drosophila. Evolution. 54, 1030-1035 (2000).
  34. Wigby, S., Chapman, T. Sperm competition. Curr. Biol. 14, 100-102 (2004).
  35. Pizzari, T., Parker, G. A. Sperm biology: an evolutionary perspective. Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. , Academic Press. 674 (2008).
  36. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction. Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).
  37. Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 78، علم الأحياء الجزيئي، علم الأحياء الخلوي، علم الوراثة، الكيمياء الحيوية، المني،
تقييم الاختلافات في القدرة التنافسية في الحيوانات المنوية<em&gt; ذبابة الفاكهة</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yeh, S. D., Chan, C., Ranz, J. M.… More

Yeh, S. D., Chan, C., Ranz, J. M. Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila. J. Vis. Exp. (78), e50547, doi:10.3791/50547 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter