Summary
Дифференциальный спермы конкурентоспособности среди
Abstract
Конкуренция между конспецифичный мужчин для удобрения яйцеклетки является одним из механизмов полового отбора, т.е. выбор, который работает на максимизации количества успешных событий спаривание, а не на максимизацию выживание и жизнеспособность 1. Конкуренции спермы представляет конкуренция между мужчинами после совокупляется с тем же сука 2, в котором их спермой носят случайный характер во времени и пространстве. Это явление было сообщено в нескольких видов растений и животных 3. Например, пойманных D. MELANOGASTER самки обычно содержат сперму от 2-3 кобелей 4. Сперма хранится в специализированных органов с ограниченным объемом памяти, которая может привести к прямой конкуренции спермы от разных самцов 2,5.
Сравнение спермы конкурентоспособности разных самцов интереса (экспериментальные типы мужчин) была выполнена через контролируемом двойном спаривания экспериментальныеTS в лаборатории 6,7. Короче говоря, одна женщина подвергается воздействию двух разных самцов последовательно, одна экспериментальная мужчина и одна поперечная спаривания ссылкой мужчины. Та же схема спаривания затем следует использовать другие экспериментальные мужской типов облегчая тем самым косвенное сравнение конкурентоспособности их спермы через общий ссылки. Доля лиц, родившихся от экспериментальных и справочных мужчины идентифицируется с использованием маркеров, которая позволяет оценить конкурентоспособность спермы с помощью простых математических выражений 7,8. Кроме того, сперма конкурентоспособность может быть оценена в двух различных сценариев в зависимости от того экспериментальных самец второй или первый помощник (нападения и защиты анализа, соответственно) 9, в которой предполагается, что отражает различные атрибуты компетенции.
Здесь мы описываем подход, который помогает допросить роль различных генетических факторов, которые лежат в основе предположительно тОн явление спермы конкурентоспособности в D. MELANOGASTER.
Introduction
Так как Джефф Паркер отметил распространенность конкуренции спермы у насекомых и ее эволюционные последствия 2, всплеск исследований у дрозофилы и других видов пытались пролить свет на это явление на многих различных уровнях. Некоторые примеры областей, представляющих интерес был обзор его изменения в природных популяциях 9,10, его генетической архитектуры и значимости генетических факторов, лежащих в основе 11-14, и ее роль в продвижении коэволюции между полами 15,16. У D. MELANOGASTER женщин, ограниченных возможностей специализированных спермы хранения органов, пара сперматекой и семеприемником 6,17, способствует конкуренции спермы от разных самцов. Примерно 1500 сперму передаются во время спаривания, чтобы женщины, но только ~ 500 могут быть размещены в указанных органах 18,19. В лаборатории, контролируемом двойном спаривания экспериментных с участием мужской ссылки и одного или более самцов интерес широко используются для оценки спермы конкурентоспособность 7,8.
Сперма конкурентоспособность оценивается как доля потомства хряков экспериментальных мужчиной в двойном спаривания эксперименты над общей потомства, то есть как с экспериментальной, и справочные мужчины. Сперма конкурентоспособность включает два компонента, каждый из которых оценивали в отдельном тесте. В нарушение анализа, способность экспериментальной мужской спермы сместить спермы из первых мужчин, т.е. опорный мужчин, оценивается. С другой стороны, в оборонной анализа, способность экспериментальной мужской спермы сопротивляться смещению или уменьшить оплодотворения успех спермы мужской ссылкой оценивается. В зависимости от типа анализа, обороны или правонарушение, сперма конкурентоспособность оценивается путем оценки P 1 или P 2 соответственно. P1 и Р 2 может принимать значения от 0 до 1. Промежуточные значения, которые обычно трактуются как косвенное свидетельство смешивания спермы, что предполагает физиологические сценария с прямой конкуренции спермы. Следуя той же обоснование, экстремальные значения можно интерпретировать как доказательство сильных дифференциальных спермы конкурентоспособность. Ранние исследования показали, что P 2 в D. MELANOGASTER составляет более 0,8 растет, так как время, прошедшее между двумя вязки удлиняет 7. Этот же эксперимента были использованы в других видов Drosophila, Р 2 является широко используется статистический в исследования для оценки спермы конкурентоспособность 20. Для большинства видов, P 2 значений штаммов выше 0,6 21. Тем не менее, ряд других механизмов, не связанных с прямой конкуренции между спермой разных самцов могут давать одинаковые оценки (см. обсуждение).
Реопознавательные потомства хряков первого или второго мужчины можно с помощью легко узнаваемых маркеров. В начале исследования, одно из самцов облучали в сублетальных дозах, например, рентгеновские лучи таким образом, что практически все яйца оплодотворенные облученных спермиев не в люк 7. Впоследствии мутаций, изменяющих пигментации глаз или форму крыла были наиболее часто используемых маркеров. Примерами первого являются мутации м.т. (коричневый) 9, сп (киноварь) и 22 Вт (белый) 23, в то время как мутация Су (завитые) 24 соответствует второму типу фенотипы, некоторые из этих мутаций были объединены в же человек, например, CN BW. В меньшей степени, аллозимы 25 и микроспутников 26,27 с известной модели наследования были также использованы.
Схема эксперимента для проверки на различия всперма конкурентоспособности описанные здесь следует, что по существу Кларка и др.. 9. Результаты, полученные из этих экспериментов дают информацию только о дифференциальных отцовства экспериментальных типов мужчин в центре внимания. Анализы, которые также делают учет после оплодотворения различия в фитнес-14,28 и спермы методы визуализации 24 включите различия в P 1 (или P 2) забивает гол должно интерпретироваться как различия в сперме компетенции.
На рисунке 1 приводится обоснование как преступления и обороны анализов. Для иллюстрации логистику процесса, преступление эксперимента, проведенного в D. MELANOGASTER 14 будет объяснено более подробно. Данный анализ преступления был использован для тестирования для измеримого эффекта мультигенного семейства спермы конкретных динеин промежуточного звена (SDIC) на сперму конкурентоспособность. Все членыс этой мультигенные семьи проживают в тандеме на Х-хромосоме. Нокаут мужчины были получены путем удаления SDIC кластера. Поскольку удален сегмент также включены основного гена коротким крылом (SW) и цель исследования заключалась в оценке актуальности SDIC, самцами, несущими SDIC-SW удаления были спасены трансгенной копией SW (символизируется P {Ю} , которая также проводится мини-белого гена-репортера) на хромосоме 2. Цвет глаз был использован в качестве маркера для видимого отцовства идентификации. Все мухи в белом фоне мутант за исключением тех из штамма, Oregon-R, которые использовались в качестве ссылки мужчин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Небольших экспериментов должны быть выполнены, чтобы ознакомиться со всей процедурой.
1. Сбор Девы Женщины и наивные мужчины
Простейший вариант, изложенные эксперимент состоит из четырех типов начальных кресты, которые включают следующую комбинацию взрослых: а) W 1118 лиц и организаций в целях сбора девственной женщины, б) Oregon-R лиц и организаций в целях сбора наивных мужчин ссылки; C ) P {З} гомозиготных самцов и самок из девственница линии управления, который несет дикого типа организации SDIC для того, чтобы собирать наивных экспериментальных мужчин (тип I) и г) Р {З} гомозиготных самцов и SDIC-SW-удаление несущие Девы женщин с целью сбора экспериментальных наивные мужчины, которые несут SDIC-SW дефицита (тип II).
- Настройка нескольких флаконов, содержащих 8-10 женщин и 5 мужчин каждый. Разрешить женщин, чтобы заложитьяйца и передать взрослым новые флаконы каждые 3-5 дней. Используйте бутылки, а не флаконы при необходимости и всегда использовать свежие продукты. Количество флаконов, будет зависеть от ряда экспериментальных мужской типов исследуемых и числа лиц, по оценкам, необходимы для определения различий (табл. 1). Более 10 женщин на одного флакона может привести к перенаселенности во время роста личинок, которые могут вызвать изменения в плодородии потомства. Хранить флаконов при температуре 25 ° С в камере с регулируемой температурой.
- Начните собирать девственной самки и наивные мужчины в дни 11-й и 12-й после установки начального кресты. Период ожидания изменяется в зависимости от температуры, ниже температуры приводят к развитию дольше время задержки совокупность индивидов. Другим фактором, влияющим на сроки вылупления это тип среды. Питательной пищи, такие как кукурузная мука-дрожжевой среде 29, обеспечивает правильное развитие взрослыхрепродуктивной системы, что облегчает спаривания. Сбор Разъединенные летит каждые 4-6 часа. При сборе, обезболить мух путем введения CO 2 во флакон, нажмите слетает, и секс их под стереомикроскоп (рис. 2). Поместите необходимое мух в различных флаконах по полу и фенотипа и этикетке флакона соответствующим образом.
Примечание 1. Регулярный сбор начинается утром путем отбрасывания взрослых, которые возникли в течение предыдущей ночи. Сбор девственной самки и наивные мужчины один или два раза в течение дня. Как правило, D. MELANOGASTER самцы становятся половозрелыми 8 часов после вылупления при 25 ° C 30. Если мух выдерживают в 12:12 ч света / темноты циклов, два пика вылупления ожидается: в первые 1-2 часов после того, как свет включен, и в течение 2 часов, прежде чем свет выключен. Eclosion происходит в течение 24 часов после того, как куколку темнеет.
Примечание 2. Не более 10 женщин SHУльд быть введены в том же флаконе для предотвращения чрезмерной скученности. Это также ограничивает потерей женщин в случае, если они должны быть отброшены, потому что по крайней мере один из них не является девственницей.
Примечание 3. Для того чтобы собрать необходимое количество женщин целинных и наивные мужчины в течение короткого периода времени, следующие меры могут быть приняты. Установка 15-20 флаконов ж 1118 для экспериментов с участием двух типов экспериментальных самцов (табл. 1). Слегка посыпать поверхность средствами массовой информации и добавить несколько сушеных дрожжей активных гранул для облегчения яйцекладки. Передача родителей по крайней мере 4 раза в последующие дни. Для увеличения свободного поверхность для окукливания в каждом флаконе, вставьте несколько сложенной бумаги (7 х 5 см) в течение 4-й или 5-й день после родителей передаются в другой флакон (рис. 3). Если количество появились взрослых от начального крестов не хватает, ждать еще несколько дней и собирают индивидуальноАЛС из флаконов созданы в разное время. Планируют провести эксперименты на протяжении нескольких дней подряд, чтобы выровнять нагрузку.
2. Дважды спаривания Эксперименты
На рисунке 4 показаны основные шаги в двойной игре спаривания эксперименты, проведенные в 14.
- Утром 1-го дня, создал первые спаривания. Oregon-R мужчин в первую очередь мат в преступлении анализа.
- Использование аспиратора, созданы 10 флаконов, содержащих 4-5-дневных белоглазых W 1118 целинных и женщин 10 красными глазами Oregon-R наивных мужчин каждый. От двух до трех флаконов создана в день в течение 5 дней подряд. Количество флаконов, которая будет создана могут отличаться в зависимости от количества доступных физических лиц. Разрешить мухи спариваются в течение 2 часов.
- Откажитесь Oregon-R мужчин и разместить каждую самку в новый флакон использованием аспиратора (рис. 5). Пол идентификации может быть достигнуто путем визуального осмотра несколькоморфологические различия (рис. 2). На каждом флаконе надлежащим образом и оставляют женщин во флаконе в течение 2 дней (в дальнейшем «V1»).
- На 3 день создана вторая спаривания. Выбор мужчин и поперечных создан следует проводить при случайном чтобы свести к минимуму любые потенциальные уклон в сторону любого из экспериментальных мужской типов.
- За два часа до выключения света, перенос заново женского в новый флакон с аспиратором. Маркировку нового флакона соответствующим (далее "V2").
- Введем три 5-6-дневных экспериментальных самцов того же генотипа в v2.
- Повторите 2.2.1 и 2.2.2 для каждой женщины.
- На 4-й день, два часа прямо перед свет включен (то есть не более 12 ч после 2.2.1), отбросить мужчин с помощью аспиратора.
- На 6 день передачи каждая самка снова в другой новый флакон. Маркировку нового флакона соответствующим (далее "V3").
- На 10 день, отказаться от W 1118
- Изучите потомства в V2 и V3. Первый осмотр проводится после 13-15 дней после женского вводится в v2 (или V3), например, на 17 день после того, как женщина впервые начал откладывающих яйца в v2. Вторая проверка проводится ровно через 17 дней. Эти сроки создает безопасный верхний временной границе, что гарантирует отсутствие второго поколения в том же флаконе. Инспекциями второго предотвращения перенаселенности, облегчая потомства счета.
- На 17 день, проверять v1 и убедиться, что есть красные глаза потомства настоящее время; если не метка флакон соответственно. Наличие белоглазых потомства указывается, что женщинам не было девственной во время начального спаривания пока нет потомства не указывает, что спаривание со ссылкой или экспериментальной мужчины не произошло.
- На 17 день, выполните первый инспекция v2. Anesthetize появилось потомство в v2 с CO 2 и сортировать их по цвету глаз и сексе. Запись потомство номера родившихся от первого и вторОНД мужчин. На рисунке 6 показан ожидаемый фенотипов в потомстве каждого спаривания схеме. В данном эксперименте 14, только женский потомство может быть однозначно назначается в качестве желаемого путем ссылки или экспериментальных мужчин и, следовательно, только информация от дочери могут быть использованы для вычисления P 2. Если с другими маркерами отцовства мужское потомство может быть однозначно назначен, считается потомство обоих полов могут быть использованы в последующих расчетах. Откажитесь от потомства, но держать v2 для второй проверки.
- На 20 день, дальше как в 2.5.2 с вновь возникшим в потомстве v2, а затем отказаться от флакона.
- На 20 день, осмотрите потомство появилось в версии 3 в первый раз и следовать шаг 2.5.2.
- В День 23, действуйте в п. 2.5.3 с вновь возникшим в потомстве v3.
Примечание 1: В связи с потенциальной раздувания влияние на оценки P, что несколько спаривания может иметь (2.2.2 и 2.2.3), спариваниеможет быть ограничена конкретного периода времени. Сроки будут зависеть от remating частота, связанная с генотипом самки и мужчины использовали. Вероятность спаривания несколько специально уменьшена в ночное время 11.
Примечание 2: Не следует добавлять живые дрожжи гранул, поскольку это может вызвать проблемы из-за возможного чрезмерного роста дрожжей, когда количество взрослых мух является низким.
3. Анализ данных
- Записанные рассчитывает потомства должна быть организована соответствующим образом для легкого визуального осмотра и эффективный анализ с подходящей статистического пакета (например, JMP от SAS Institute) или бесплатный веб-инструменты (например http://vassarstats.net/ ).
- Сперма конкурентоспособность. Добавить насчитывает от V2 и V3. Женский мух, которые породили нет или очень ограниченное потомство (например, <10), умер во время процедуры, или были только успешно inseminaTed одним из двух самцов рассматриваются как неинформативные и исключаются из любой вниз по течению статистический анализ (2.5.1 и таблица 2). Вычислить P 2 балла за каждое информативно женщины.
- Проверьте, есть ли статистически значимых различий в значениях P 2 среди мужчин по сравнению экспериментальных. Это может быть сделано с использованием параметрических (например HSD Тьюки) или непараметрические (например, сталь-Dwass) тестов в зависимости от нескольких факторов, включая асимметрии распределения значений P 2 и зависимость между дисперсией и средним. Углового преобразования обычно применяется к пропорции, такие как P 2 до использования тестов параметрического 31.
- Спаривание курсовой разницы (опция). Для каждой экспериментальной мужской тип, рассчитать количество вдвойне повязана женщин и те, которые только повязана с первым мужчиной (ссылка мужчин в совершении преступления и анализа экспериментальных мужчиной в Defense анализа). Используя двусторонний точный критерий Фишера (продается в http://www.langsrud.com/fisher.htm ), определить, есть ли статистически значимые различия между этими двумя типами экспериментальных мужчины.
- Соотношение полов (опционально). Для каждой экспериментальной мужчин, используйте критерий хи-квадрат, чтобы определить, является ли соотношение полов в потомстве от каждой самки отклоняется от ожидаемого соотношении 1:1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В таблице 2 приведены некоторые характерные черты двух экспериментах преступления (Анализы 1 и 2), в котором Д. MELANOGASTER экспериментальных мужчин с и без (тип I и II, соответственно) SDIC функциональных кластеров сравниваются 14. Приняв во внимание различным уровням столкнулись с некоторыми повторяет, 58-83% женщин были обнаружены быть информативным и поэтому рассчитывает на отцовство их потомства могут быть использованы для расчета P 2. Результаты непараметрических тестов были совместимы с более низкой конкурентоспособности спермы у мужчин без SDIC кластер (тип II) по сравнению с мужчинами с интактным кластера (тип I) 14. Эта картина была воспроизводимые через тесты, выполненные преступления. Похожие, но не статистически значимый тренд был найден в обороне анализы выполняются параллельно (не показано). Важно отметить, что отсутствие спаривания курсовых разниц (шаг 3.4) исключил возможность того, чтомужской генотип может повлиять на женскую remating поведения 14.
| Нападение анализа | Анализ обороны | |||||
| Экспериментальные ♂ Тип | W 1118 ♀ | OR-R ♂ | Экспериментальная ♂ | W 1118 ♀ | Экспериментальная ♂ | OR-R ♂ |
| Я | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
| II | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
Таблица 1. Необходимое число лиц и организаций в двойном спаривания эксперименты для сравнения двух экспериментальных типов мужчин. OR-R, Oregon-R.
| ♀ | ||||||
| Экспериментальные ♂ Тип | Начальное значение счетчика | Нет успешного оплодотворения со ссылкой ♂ | Нет успешного оплодотворения с экспериментальными ♂ | Проблемные 1 | Информационные (%) | P 2 2 |
| Анализ 1 | ||||||
| B +(Тип I) | 60 | 5 | 6 | 2 | 47 (78%) | 1,000 (1.000-0.987) |
| A-(тип II) | 55 | 1 | 7 | 5 | 42 (76%) | 0,986 (1.000-0.936) |
| Анализ 2 | ||||||
| I + (тип I) | 74 | 9 | 7 | 15 | 43 (58%) | 1,000 (1.000-0.979) |
| E-(тип II) | 75 | 3 | 8 | 2 | 62 (83%) | 0,983 (1.000-0.927) |
Таблица 2. Краткое описание влияния различных событий на число женщин использовали в нападении тестов, выполненных для проверки различий между экспериментальной мужской типов. 1 Умер, ЭСХАпед во время теста, или что приводит к число потомства ниже порогового значения. 2 Медиана (вероятное отклонение).
Рисунок 1. Экспериментальный дизайн для нападения и защиты анализов. Цвета код, используемый для каждого генотипа обозначает цвет глаз взрослой мухи. Орегон-R самцы использовали в качестве эталона для сравнения косвенно спермы конкурентоспособность двух экспериментальных мужчин: один несущий форме дикого типа генетического фактора при исследовании (тип I) и в котором функциональность генетический фактор был возмущенных (тип II). SDIC кластер, генетический фактор в данном случае, расположен на Х-хромосоме, в то время как SW трансген находится на хромосоме 2. Эксперименты изображен являются частью те, которые выполняются в
Рисунок 2. Секс идентификации в D. MELANOGASTER. (A) спинного, (B) боковая, и (С) вентральный вид 1 час летних женщин (слева) и мужчин (справа) анестезию CO 2 под стереомикроскопа. Мужских гениталий является значительно более, чем пигментированные вагинальной пластинки порождает очевидный темное пятно, это самая надежная символ, используемый для определения пола. Кроме того, лапки передних ног мужчины обладают краю темной щетиной (пол гребень) отсутствует вженщины. (D) Надежное и быстрое гендерной идентификации старых мух невооруженным глазом рекомендуется при передаче лиц во флаконы использованием аспираторы. У пожилых людей, мужчина сверху живота гораздо темнее, чем у женщины. Самки обычно крупнее и имеют более бледный живот, чем мужчины. Яйцеклада делает женского живота указал.
Рисунок 3. Multi-сложенной бумаги, используемые для увеличения доступной поверхности для странствующих личинок.
Рисунок 4. Схема эксперимента для анализа различий в сперме конкурентоспособности в D. MELANOGASTER. Массовая спаривания в течение 2 часов использования Вир джина W 1118 женщин и Орегон-R мужчин начинаются каждый день в течение 5 дней. В каждой массы спаривания, при завершении, 12-14 женщин должны быть атмосферный раздельно в отдельных флаконах (v1). Через два дня каждую самку переносили в новый флакон (v2) с трех экспериментальных самцов одинаковым генотипом. Эти люди имеют право спариваться в течение ночи. Самцы выбрасывают после ~ 12 часов в то время как самки откладывают яйца позволено в течение 2 дней. Впоследствии, самки переносят в новую флаконы (v3), позволил откладывают яйца снова, и, наконец, выбрасывают после 3 дней. Тринадцать до пятнадцати и 17 дней после женщин начали откладывать яйца в обоих v2 и v3, потомство родившихся от экспериментальных и справочных мужчин идентифицированы с использованием соответствующих маркеров и записан. После потомства в v2 и v3 проверяется дважды, флаконы, отбрасываются. Стрелку вниз, отбрасываются физических лиц; символу глаза флаконе инспекции. Взято из 9.d/50547/50547fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 5. Гибкая аспиратором. Собран из труб янтаря латекса, одна 1 мл градуированный чаевые для получения мух и другой функционирования как одноразовые Ротовой. Чтобы предотвратить мух втягиваться в трубку, тонкая сетчатая ткань используется, чтобы оградить лету получения чаевых в переходе к трубе.
Рисунок 6. Ожидаемые фенотипов в потомстве преступления анализа. Влево и вправо, пересекает оценить спермы конкурентоспособности контроля и нокаут мужчин соответственно. Генотип и цветом глаз и для родительского потомства как Fathers показаны. Из-за особенностей генетические маркеры, используемые в этом анализе только самка потомство может быть использована для вычисления P 1 (или P 2) оценки (см. текст); часть мужского потомства желаемого экспериментальными самец белоглазых и . поэтому фенотипически неотличимы от мужского потомства ссылкой мужчин Д.Ф., дефицитом; P {Ю}, трансгенов;. W 1118 мутантный аллель гена белого Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали эксперимента для оценки различий в относительном вкладе генетически различных D. MELANOGASTER мужчин к потомству в контролируемом двойном спаривания эксперименты 7,8. Это было сделано в контексте генетического фактора предположили влиять на сперму конкурентоспособности и было показано в анализе преступлений, хотя аналогичная процедура применяется к обороне анализа (рис. 1). Этот экспериментальный конструкция может быть изменена, чтобы проверить другие аспекты авторство успехом такие как влияние женского генотипа 32. Пример модификации, которые могут быть включены в непосредственный контроль спаривания между охватывающей и вторым мужчины. Кроме того, важно также отметить, что относительные показатели экспериментальных мужской типов зависит от генотипа тестер мужской и женской использованы и поэтому не могут быть экстраполированы на другие сценариис участием различных мужчин и женщин тестер 10,32,33.
Так как сбор необходимой лиц (Virgin женщин и наивные мужчины) и забил потомства являются трудоемкими, число различных типов экспериментальных мужской оценки должен быть скорректирована в зависимости от числа хорошо обученный персонал. Эксперименты, изложенные здесь, могут быть легко обработаны одним человеком в течение шести недель. В самом деле, до пяти экспериментальных типы мужчин могут быть оценены параллельно. Только дополнительные меры должны быть приняты является продление количество дней создании начального вязки массы и сбора необходимых физических лиц на них.
По нашему опыту, начиная число женщин использовали (60-70) достаточно для удовлетворения потребностей снижение размера выборки без ущерба для нашей статистики выявить различия между экспериментальной мужской типов (табл. 2). Уменьшение количества яnformative женщины могут возникнуть в результате различных факторов, например отсутствия доказательств двойной спаривания или преждевременной смерти. Тем не менее, число женщин, необходимых для каждой экспериментальной мужскому типу, чтобы достичь адекватной статистической мощности будет изменяться в зависимости от величины эффекта генетического фактора при исследовании. Пилотный эксперимент очень желательно, чтобы оценить соответствующий уровень репликации.
Статистические различия в P 1 (или P 2) оценки указывают изменение в мужской эффективности оплодотворения, хотя они даже не сообщают о лежащей в основе механизмов, способствующих такого различия. Это связано с несколькими переменными, которые могут повлиять на сперму конкурентоспособности (всесторонне проанализированы в 20 и 34). Сперма атрибуты, как размер, количество и подвижность могут влиять на конкуренцию спермы непосредственно 35. Кроме того, другие механизмы, не связанные с прямой конкуренции спермы приблизительноN также способствуют различия в P 1 или P 2 значения. Например, первый мужской спермы может быть преимущественно удалены, перемещены или промыть до или во время спаривания со вторым мужской 19,20. Это может произойти при механическом раздражении, например, во время спаривания и через молекулы, присутствующие в семенной жидкости второго мужчин, которые будут влиять на первом мужской спермы негативно 19,36. Таким образом, дополнительные анализы, которые позволяют оценить влияние этих дополнительных косвенных механизмов должны быть выполнены, в идеале до двойного брачного эксперимента, описанного здесь. Пример этих анализов кто проходит тестирование на различия в жизнеспособность зиготы (например, выживаемость личинок) и яйца выводимость (прокси для успешного оплодотворения яйцеклетки) 28,37, что в конечном итоге привести к различиям в потомстве числа.
Методы визуализации спермы также может быть весьма информативным 19,24,28. По сути, одна ое мужчин генетически модифицирован таким образом, что сперма меченных флуоресцентными слитого белка (например, у эталона мужской с зеленого флуоресцентного белка) помогает динамика мониторинга сперматозоидов в женских половых путей. Такой подход в сочетании с дальнейшей окрашивания с использованием 4 ',6-диамидино-2-phenyllindole (DAPI) был использован для выявления мест сперматозоидов из первой и второй мужчина в расчлененных семеприемников Д. MELANOGASTER женщин 24,28. В одном исследовании 24, различия в сперматозоиды находятся в хорошем соответствии с различиями в значениях P 2 подтверждая мнение, что эти различия в мужской отцовства были отражать истинные различия в сперме конкурентоспособности, а не косвенных механизмов.
Последующие усовершенствования были достигнуты путем создания трансгенных линий, которые экспрессируют зеленый и красный флуоресцентных меток, слитый с спермы-специфических белков 19. Эти improvemEnts позволили исследователям следить за сперму из двух непосредственно конкурирующих мужской спермы с беспрецедентной степенью разрешения. В заключение, исполнение двойного спаривания экспериментов и дополнительных анализов, как те, предложил помочь, чтобы сузить характер любых различий в P 1 или P 2 показали, что средство среди экспериментальных типов мужчин, что открывает возможность для того чтобы рассечь основы генетики естественные изменения в сперме конкурентоспособность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы благодарят NSF (MCB-1157876) для финансирования. Мы также благодарим Альберто Чиветты, Джон Roote, и два анонимных рецензентов за их комментарии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber latex tubing | VWR | 62996-473 | 1/4 inch ID, 1/6 inch Wall |
| 1 ml graduated XL filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed |
| Parafilm | Sigma | P-7793 | |
| Mesh Fabric | Thin and smooth | ||
| Stereomicroscope | Leica | S6D | |
| CO2 Tank | Airgas | CD-50 | Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available |
| FlyStuff Foot Valve, complete system | Genesee Scientific | 59-121C | Not necessary if FlyNap is used |
| Plastic vials | Genesee Scientific | 32-109 | Come with carboard trays that can be reused for holding vials |
| Cotton balls | Fisher Scientific | AS-212 | |
| Active dry yeast | Red Star | Found in general grocery store | |
| Sharpie markers | Different colors may be used for marking different genotypes |
References
- Darwin, C. The descent of man and selection in relation to sex. , John Murray. (1871).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).
- Birkhead, T. R., Møller, A. P. Sperm competition and sexual selection. , Academic Press. (1998).
- Jones, B., Clark, A. G. Bayesian sperm competition estimates. Genetics. 163, 1193-1199 (2003).
- Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster. Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).
- Jonsson, U. B. Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster. Genetics. 47, 1719-1736 (1962).
- Boorman, E., Parker, G. A. Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status. Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).
- Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C. Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. Smith, R. L. , Academic Press. 372-427 (1984).
- Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster. Genetics. 139, 189-201 (1995).
- Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. Female x male interactions in Drosophila sperm competition. Science. 283, 217-220 (1999).
- Civetta, A., Clark, A. G. Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila. Genet. Res. 75, 143-151 (2000).
- Greenspan, L., Clark, A. G. Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster. Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).
- Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).
- Yeh, S. D., et al. Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).
- Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila. Evolution. 53, 1804-1822 (1999).
- Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A. Ejaculate-female coevolution in Drosophila mojavensis. Proc. Biol. Sci. 270, 1507-1512 (2003).
- Nonidez, J. F. The internal phenomenon of reproduction in Drosophila. Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).
- Miller, G. T., Pitnick, S. Sperm-female coevolution in Drosophila. Science. 298, 1230-1233 (2002).
- Manier, M. K., et al. Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster. Science. 328, 354-357 (2010).
- Simmons, L., Siva-Jothy, M. Sperm competition and sexual selection. Birkhead, T. R., Møller, A. P. , Academic Press. 826 (1998).
- Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila. Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).
- Markow, T. A. A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei. Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).
- Barbadilla, A., Quezada-Díaz, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance. Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).
- Civetta, A. Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila. Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).
- Turner, M. E., Anderson, W. W. Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes. Evolution. 38, 983-995 (1984).
- Harshman, L. G., Clark, A. G. Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila. Evolution. , 1334-1341 (1998).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).
- Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation. Nature. 400, 449-452 (1999).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , CSHL. (1997).
- Sokal, R. R., Rohlf, F. J. Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , 3d, Freeman, W.H. (1994).
- Clark, A. G., Begun, D. J. Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila. Genetics. 149, 1487-1493 (1998).
- Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A. Nontransitivity of sperm precedence in Drosophila. Evolution. 54, 1030-1035 (2000).
- Wigby, S., Chapman, T. Sperm competition. Curr. Biol. 14, 100-102 (2004).
- Pizzari, T., Parker, G. A. Sperm biology: an evolutionary perspective. Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. , Academic Press. 674 (2008).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction. Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).
- Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).
