Summary
Differential spermier konkurrensförmåga bland
Abstract
Konkurrensen bland conspecific män för gödsling av ägg är en av mekanismerna för sexuell selektion, dvs val som fungerar på att maximera antalet lyckade parning händelser snarare än på att maximera överlevnad och lönsamhet 1. Spermier konkurrensen utgör konkurrensen mellan hanar efter kopulera med samma kvinnliga 2, där deras spermier är sammanträffande i tid och rum. Detta fenomen har rapporterats i flera arter av växter och djur 3. Till exempel, vildfångade D. melanogaster honor brukar innehålla spermier 2-3 hanar 4. Spermierna lagras i speciella organ med begränsad lagringskapacitet, vilket kan leda till direkt konkurrens av spermier från olika hanar 2,5.
Jämföra spermier konkurrensförmågan hos olika hanar av intresse (experimentella manliga typer) har utförts genom kontrollerad dubbel-parning experiments i laboratoriet 6,7. Kortfattat, är en enda kvinna utsätts för två olika hanar i rad, en experimentell manlig och en cross-parning referens hane. Samma parning ordningen följs sedan med andra experimentella manliga typer därigenom underlättar indirekt jämförelse av konkurrensförmågan hos sin sperma genom en gemensam referens. Fraktionen av individer fathered vid de experimentella och referens hanar identifieras med hjälp av markörer, som tillåter en att uppskatta spermier konkurrenskraftig förmåga med hjälp av enkla matematiska uttryck 7,8. Dessutom kan spermier konkurrensförmåga beräknas i två olika scenarier beroende på om den experimentella manliga är andra eller första att para (offensiv och defensiv analys, respektive) 9, vilket antas vara reflekterande av olika kompetens attribut.
Här beskriver vi en metod som hjälper till att förhöra betydelsen av olika genetiska faktorer som förmodat bakom than fenomenet spermier konkurrenskraft i D. melanogaster.
Introduction
Eftersom Geoff Parker noterade förekomsten av spermier konkurrensen i insekter och dess evolutionära konsekvenser 2, har en våg av studier i Drosophila och andra arter som försökte sprida lite ljus över detta fenomen på många olika nivåer. Några exempel på områden av intresse har varit undersökningen av dess variation i naturliga populationer 9,10, dess genetiska arkitektur och relevans av underliggande genetiska faktorer 11-14, och dess roll i att driva samevolution mellan könen 15,16. I D. melanogaster honor, den begränsade kapaciteten hos de specialiserade sperm-lagring organ, ett par spermatheca och sädes behållaren 6,17, bidrar till att konkurrensen på spermier från olika hanar. Cirka 1.500 spermier överförs under parning till honan men bara ~ 500 kan inrymmas i de nämnda organen 18,19. I laboratoriet, kontrollerad dubbel-parning erfarenhetningar där en referens hane och en eller flera hanar av intresse har i stor utsträckning använts för att utvärdera spermier konkurrensförmåga 7,8.
Spermier konkurrensförmåga beräknas som andel av avkomman fallen efter den experimentella manliga i dubbel-parning experiment över den totala avkomman, dvs från både experimentella och män referens. Spermier konkurrensförmåga består av två delar, var och en av dem utvärderas i en separat analys. I brottet analys, förmågan hos experimentella manliga spermier att förskjuta spermier från den första manliga dvs referens manlig, utvärderas. Omvänt, i försvaret analysen, förmågan hos den experimentella manliga spermier motstå förskjutning eller för att minska gödslingen framgång referens manliga spermier utvärderas. Beroende på vilken typ av analys, försvar eller anfall, är spermier konkurrensförmåga uppskattats genom betygsättning P 1 eller P 2, respektive. P1 och P 2 kan endast anta värden mellan 0 och 1. Mellanliggande värden vanligen tolkas som ett indirekt bevis på spermier blandning, vilket antyder en fysiologisk scenario med direkt spermier konkurrens. Enligt samma logik, kan extrema värden tolkas som bevis för en stark differential spermier konkurrensförmåga. Tidiga studier visade att P 2 i D. melanogaster är över 0,8 ökar som den tid som förflutit mellan de två parningar förlänger 7. Samma experimentella designen har använts i andra Drosophila arter, P 2 är den vanligaste statistiken i studier för att utvärdera spermier konkurrensförmåga 20. För de flesta arter är P 2 värdena för de testade stammar högre än 0,6 21. Ändå kan flera andra mekanismer som saknar samband med den direkta konkurrensen mellan spermier av olika hanar ger samma poäng (se diskussion).
Distinguishing avkomma fallen efter den första eller andra hanar är möjligt genom användning av lätt identifierbara markörer. I tidiga studier, var en av de män bestrålas vid subletala doser av till exempel röntgen så att nästan alla ägg befruktas av bestrålade spermier misslyckades att kläckas 7. Därefter har mutationer förändrar ögat pigmentering eller vingform varit de mest använda markörerna. Exempel på den förra är mutationerna bw (brun) 9, cn (cinnober) 22 och w (vit) 23, medan mutationen Cy (Curly) 24 motsvarar den andra typen av fenotyper, några av dessa mutationer har kombinerats i samma individ, t.ex. cn bw. I mindre utsträckning har allozymes 25 och mikrosatelliter 26,27 med kända nedärvningsmönster också använts.
Den experimentella designen för att testa för skillnader ispermier konkurrensförmåga beskrivs här följer i huvudsak det av Clark et al. 9. Resultaten från dessa experiment ger upplysningar endast om skillnaden faderskap av de experimentella manliga typerna under lupp. Analyser som också ta hänsyn till efter gödsling skillnader i fitness 14,28 och spermier visualiseringstekniker 24 möjliggör skillnader i P 1 (eller P 2) poäng tolkas som skillnader i spermier kompetens.
Figur 1 visar den logiska grunden för både brottet och analyserna försvar. För att illustrera logistiken i processen, som ett brott experiment i D. melanogaster 14 kommer att förklaras i detalj. Denna speciella brott analys användes för att testa för en mätbar effekt av multigenfamiljen Sperm-specifik dynein mellanliggande kedjan (sdic) på sperma konkurrensförmåga. Allt medlems av denna multigenfamilj bor i tandem på X-kromosomen. Knockout hanar genererades genom att ta bort sdic klustret. Eftersom den borttagna segment ingår även den essentiella genen korta vinge (SW) och syftet med studien var att utvärdera relevansen av sdic, var män bär sdic-sw deletion räddades av en transgen kopia av sw (symboliserad som P {sw} , som också tog en mini-vit reportergen) på kromosom 2. Ögonfärg användes som en synlig markör för faderskap identifiering. Alla flugor var i en vit mutant bakgrund med undantag för dem från stammen Oregon-R, som användes som referens hanar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Småskaliga experiment bör utföras för att bekanta sig med hela förfarandet.
Ett. Samla Virgin Kvinnor och naiva Hanar
Den enklaste versionen av den skisserade experimentet består av fyra typer av initiala kors, vilket innebär följande kombination vuxna: A) w 1118 individer i syfte att samla in jungfruliga hondjur, b) Oregon-R individer i syfte att samla naiva referens hanar, c ) P {sw} homozygota hanar och jungfruliga honor från en styrledning som bär vild-typ organisation av sdic för att samla naiva experimentella hanar (typ I), och d) P {sw} homozygota hanar och sdic-sw-deletion -bärande jungfruliga honor för att samla naiva experimentella hanar som bär sdic-sw brist (typ II).
- Ställ in flera flaskor innehållande 8-10 honor och fem hanar vardera. Låt honorna att läggaägg och överföra de vuxna till nya flaskor var 3-5 dagar. Använd flaskor i stället för flaskor vid behov och alltid använda färska livsmedel. Antalet krävs injektionsflaskor beror på antalet experimentella manliga typer som studeras och antalet individer beräknas vara nödvändiga för att upptäcka skillnader (tabell 1). Mer än 10 honor per flaska kan leda till trängsel under larver tillväxt, vilket kan orsaka variationer i fertilitet hos avkomman. Förvara flaskor vid 25 ° C i en temperatur-kontrollerad kammare.
- Börja samla jungfruliga honor och naiva män på dag 11: e och 12: e efter att du installerat de ursprungliga korsen. Väntetiden varierar beroende på temperatur, lägre temperaturer resulterar i längre utvecklande tid försenar samling individer. En annan faktor som påverkar tidpunkten för eclosion är den typ av medium. Näringsrik mat, såsom majsmjöl-jäst mediet 29, försäkrar god utveckling av den vuxnareproduktiva systemet, vilket underlättar parning. Samla oparad flyger varje 4-6 tim. Vid insamling, söva flugor genom att införa CO2 i flaskan, knacka flugorna ner, och kön dem under stereomikroskop (Figur 2). Placera önskad flugor i olika flaskor efter kön och fenotyp och etikett flaskorna lämpligt.
Not 1. Insamling rutin börjar på morgonen genom att kasta de vuxna som dök upp under den föregående natten. Samla jungfruliga honor och naiva män en eller två gånger under dagen. Typiskt D. melanogaster hanar blir könsmogna 8 tim efter eclosion vid 25 ° C 30. Om flugor hålls under 12:12 h ljus / mörker cykler, är två toppar eclosion väntat: under första 1-2 h efter ljuset slås på, och under 2 tim innan lampan släcks. Eclosion inträffar inom 24 h efter puppa mörknar.
Not 2. Inte mer än 10 honor should sättas i samma flaska för att förhindra överbeläggning. Detta begränsar också förlusten av kvinnorna i fall de måste kasseras eftersom minst en av dem är inte oskuld.
Not 3. För att samla in rätt antal jungfruliga honor och naiva män i en kort tid, kan följande åtgärder vidtas. Ställ upp 15-20 flaskor w 1118 för experiment med två typer av experimentella män (tabell 1). Lätt strö på ytan av media och tillsätt några torkade aktiv jäst pellets för att underlätta äggläggning. Överför föräldrar minst fyra gånger på varandra följande dagar. För att öka den tillgängliga ytan för pupation i varje flaska, infoga flera vikta papper (7 x 5 cm) under 4: e eller 5: e dagen efter det att föräldrarna överförs till en annan flaska (Figur 3). Om antalet framkommit vuxna från den ursprungliga korsningar räcker inte, vänta några dagar och samla individuelltals från flaskor som inrättats vid olika datum. Plan för att utföra experimenten under flera på varandra följande dagar för att jämna ut arbetsbelastningen.
2. Dubbelklicka parning Experiment
Figur 4 visar de viktigaste stegen i dubbel-parning experiment utförda i 14.
- På morgonen dag 1, inrättades den första parningen. De Oregon-R-hanar är den första att para i brottet analysen.
- Med hjälp av sugen, inrättat injektionsflaskor innehållande 4-5 oktober-dagar gamla vita-eyed w 1118 jungfruliga hondjur och 10 rödögd Oregon-R naiva hanar vardera. Två till tre flaskor sätts upp dagligen under 5 på varandra följande dagar. Det antal flaskor som skall inrättas kan variera beroende på antalet tillgängliga personer. Låt flugorna att para under 2 timmar.
- Kasta Oregon-R hanar och placera varje hona i en ny flaska med en sug (Figur 5). Sex identifiering kan åstadkommas genom visuell inspektion av ett fåtalmorfologiska skillnader (Figur 2). Märk varje flaska lämpligt och lämnar honan kvar i flaskan för 2 dagar (hädanefter "v1").
- Dag 3 Ställ in den andra parningen. Val av män och kors inrättats bör utföras slumpmässigt för att minimera eventuella fördomar mot någon av de experimentella manliga typerna.
- Två timmar innan ljuset stängs av, överföra igen honan till en ny injektionsflaska med en sug. Märk den nya flaskan lämpligt (hädanefter "v2").
- Införa tre 5-6-dagar gamla experimentella hanar av samma genotyp i v2.
- Upprepa 2.2.1 och 2.2.2 för varje hona.
- Dag 4, är två timmar precis innan ljuset slås på (dvs. inte mer än 12 timmar efter 2.2.1), kassera hanar med hjälp av sugen.
- På dag 6, överföra varje hona igen i en annan ny flaska. Märk de nya flaskorna lämpligt (hädanefter "v3").
- På dag 10, kassera w 1118
- Undersök avkommorna i v2 och v3. Den första inspektionen sker efter 13-15 dagar efter honan införs i v2 (eller v3), t.ex. på dag 17 efter den kvinnliga började först ovipositing i v2. Den andra kontrollen utförs exakt efter 17 dagar. Denna tidsram utgör en säker övre temporal gräns som garanterar inga andra generationen i samma flaska. Två inspektioner förhindra trängsel samtidigt underlätta avkomma räkning.
- På dag 17, inspektera v1 och se till att det finns rödögd avkomma närvarande, om inte märka flaskan därefter. Förekomst av white-eyed avkomma visar att kvinnliga var inte oskuld vid tiden för första parning medan ingen avkomma visar att parning med referens eller de experimentella hanar uteblev.
- På dag 17, utför den första besiktning av v2. Bedöva dök avkomma i v2 med CO 2 och sortera dem efter ögonfärg och kön. Rekord avkomma nummer avlade av den första och sekOND hanar. Figur 6 visar de förväntade fenotyper i avkomman av varje parning system. I detta speciella experiment 14, kan endast kvinnliga avkomma entydigt tilldelas som far genom hänvisning eller de experimentella män och därför bara informationen från döttrarna kan användas för att beräkna P 2. Om med andra markörer faderskapet av manliga avkomma entydigt kan tilldelas, kan avkomma räknas av båda könen kan användas i senare beräkningar. Släng avkomma men håll v2 för andra inspektion.
- På dag 20, fortsätt som i 2.5.2 med nykläckta avkomman i v2 och sedan kasta flaskan.
- På dag 20, inspektera framkom avkomman i v3 för första gången och följ steg 2.5.2.
- På dag 23, fortsätt som i 2.5.3 med nykläckta avkomma i v3.
Anmärkning 1: På grund av risken blåsa effekt på P-poäng som flera parning kan ha (2.2.2 och 2.2.3), parningkan begränsas till en viss tidsram. Tidsramen kommer att bero på remating frekvensen associerad med genotypen av den kvinnliga och begagnade hanar. Sannolikheten för multipla parning är speciellt minskas nattetid 11.
Anmärkning 2: Lägg inte till levande jäst pellets eftersom detta kan orsaka problem på grund av potentiell överväxt av jästsvamp när antalet vuxna flugor är låg.
Tre. Data Analysis
- Inspelade avkomma räknas bör organiseras på lämpligt sätt för enkel visuell inspektion och effektiv analys med en lämplig statistisk paket (t.ex. JMP från SAS Institute) eller gratis webbaserade verktyg (t.ex. http://vassarstats.net/ ).
- Spermier konkurrensförmåga. Lägg räknas från v2 och v3. Kvinnliga flugor som har gett upphov till ingen eller mycket begränsad avkomma (t.ex. <10), död under förfarandet, eller bara var framgångsrikt inseminationTed genom en av de två män betraktas som icke-informativ och undantas från alla efterföljande statistisk analys (2.5.1 och tabell 2). Beräkna P 2 poäng för varje informativ hona.
- Testa om det finns statistiskt signifikanta skillnader i P 2 värden bland de jämförda experimentella hanar. Detta kan göras med hjälp av parametriska (t.ex. Tukeys HSD) eller icke-parametriska (t.ex. stål-Dwass) prov, beroende på flera faktorer, inklusive skevheten i fördelningen av P 2-värden och beroendet mellan variansen och medelvärdet. Vinkelläget transformationen allmänt tillämpas på proportioner såsom P 2 före användning av parametriska tester 31.
- Parning differenser (tillval). För varje experimentell manlig typ, beräkna antalet dubbelt parade honor och de som bara parat med den första manliga (hänvisningen hane i brottet analysen och den experimentella manliga i defense analys). Använda ett tvåsidigt Fishers exakta test (tillgänglig på http://www.langsrud.com/fisher.htm ), avgöra om det finns statistiskt signifikanta skillnader mellan de två typerna av experimentella hanar.
- Sex ratio (tillval). För varje experimentell hane, använd chi-kvadrat-test för att avgöra om könsfördelningen i avkomman från varje hona avviker från det förväntade förhållandet 1:1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 2 sammanfattar några framträdande dragen i två brott experiment (Analyser 1 och 2) där D. melanogaster experimentella män med och utan (typ I och II, respektive) en funktionell sdic kluster jämförs 14. Efter att ha tagit hänsyn till olika incidenter påträffas med några replikat, var 58-83% av honorna befunnits vara informativ och därför faderskap räknar av deras avkomma skulle kunna användas för att beräkna P 2. Resultat av icke-parametriska tester överensstämde med en lägre spermier konkurrensförmåga hos män utan sdic klustret (Type II) jämfört med män med intakt klustret (typ I) 14. Detta mönster var reproducerbar över utförda brott analyser. En liknande men inte statistiskt signifikant trend hittades i försvaret analyser utförda parallellt (ej visad). Viktigt härskade frånvaro av skillnader passande ränta (steg 3.4) utesluta attden manliga genotyp kan påverka kvinnliga remating beteende 14.
| Attack Assay | Defense Assay | |||||
| Experimentell ♂ Typ | w 1118 ♀ | OR-R ♂ | Experimentellt ♂ | w 1118 ♀ | Experimentellt ♂ | OR-R ♂ |
| Jag | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
| II | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
Tabell 1. Antal personer som krävs i dubbel-parning experiment för att jämföra två experimentella manliga typer. OR-R, Oregon-R.
| ♀ | ||||||
| Experimentell ♂ Typ | Initial Count | Ingen lyckad befruktning med hänvisning ♂ | Ingen lyckad befruktning med experimentell ♂ | Problematiska en | Informativ (%) | P 2 2 |
| Analys 1 | ||||||
| B +(Typ I) | 60 | 5 | 6 | 2 | 47 (78%) | 1,000 (1,000-0,987) |
| A-(Typ II) | 55 | 1 | 7 | 5 | 42 (76%) | 0,986 (1,000-0,936) |
| Analys 2 | ||||||
| I + (typ I) | 74 | 9 | 7 | 15 | 43 (58%) | 1,000 (1,000-0,979) |
| E-(Typ II) | 75 | 3 | 8 | 2 | 62 (83%) | 0,983 (1,000-0,927) |
Tabell 2. Sammanfattning av effekterna av olika händelser på antalet honor som används vid brott tester som utförts för att testa skillnader mellan experimentella manliga typer. 1 Död, escaped under analysen, eller ger upphov till ett antal avkommor under ett tröskelvärde. 2 Median (interkvartiltintervall).
Figur 1. Experimentell design för brottet och analyser försvar. Färgkoden för varje genotyp betecknar ögonfärg den vuxna flugan. Oregon-R hanar används som en referens för att jämföra indirekt spermierna konkurrensförmåga två experimentella hanar: en som bär den vilda typen av genetisk faktor som studeras (typ I) och en där funktionaliteten hos den genetiska faktorn har varit perturbed (typ II). Den sdic klustret, den genetiska faktorn i detta fall, är belägen på X-kromosomen medan sw transgen ligger på kromosom 2. De avbildade experiment är en del av de som utförs i
Figur 2. Sex identifiering i D. melanogaster. (A) Rygg, (B) lateral, och (C) ventrala utsikt över en timme gamla honor (vänster) och män (höger) sövda med CO 2 under stereomikroskop. Den manliga könsorganet är betydligt mer pigmenterad än den vaginala plattan ger upphov till en skenbar mörk fläck, detta är den mest tillförlitliga tecknet ska användas för könsbestämning. Även hasled av de manliga frambenen besitter en frans av mörk borst (kön kam) saknas ikvinnliga. (D) Pålitlig och snabb kön identifiering av äldre flugor med blotta ögat rekommenderas vid överföring individer i flaskor med aspiratorer. I äldre vuxna, är manliga buken dorsalt mycket mörkare än den kvinnliga. Honorna är oftast större och har en blekare buken än hanarna. Den gadd gör den kvinnliga buken pekade.
Figur 3. Multi-vikta papper som används för att öka den tillgängliga ytan för vandrande larver.
Figur 4. Disposition av försöket för att analysera skillnader i spermier konkurrensförmåga i D. melanogaster. Mass parning under 2 timmar med hjälp av vir gin w 1118 honor och Oregon-R hanar initieras varje dag i 5 dagar. I varje mass parning, gång avslutas måste 12-14 honor sugas separat i enskilda flaskor (v1). Två dagar senare, varje hona överförs till en ny ampull (v2) tillsammans med tre experimentella hanar av samma genotyp. Dessa personer får para sig över natten. Hanar kastas efter ~ 12 h medan honor tillåts oviposit i 2 dagar. Därefter honor överföras till nya flaskor (v3), tilläts oviposit igen, och slutligen kastas efter 3 dagar. Tretton till femton och 17 dagar efter honorna började oviposit både v2 och v3, avkomma avlade av den experimentella och män referens identifieras med hjälp av lämpliga markörer och registreras. Efter avkommorna i v2 och v3 inspekteras två gånger, är flaskorna kasseras. Nedåtgående pil, kasserade individer, ögonsymbolen flaskan inspektion. Anpassad från 9.d/50547/50547fig4large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 5. Flexibel sug. Monterad från bärnsten latex slang, doserad en 1 ml tips för att ta emot flugor och annat fungerar som disponibel mouthpart. För att förhindra att flugor att sugas in i röret, är finmaskigt tyg används för att skydda den fly-mottagande spets vid korsningen till röret.
Figur 6. Förväntade fenotyper i avkomman av brottet analysen. Vänster och höger, korsar att utvärdera spermier konkurrensförmåga kontroll och knock-out hanar resp. Genotyp och ögonfärg för parentals och avkomma av både fathers visas. På grund av de särskilda genetiska markörer som används i denna analys, kan endast den kvinnliga avkomman ska användas för beräkning av P 1 (eller P 2) poäng (se text för detaljer), en del av den manliga avkomman fallen efter den experimentella manliga är vit-eyed och . därför fenotypiskt omöjlig att skilja från den manliga avkomman av hänvisningen manliga Df, brist, P {sw}, transgen,. w 1118 mutant allel av den vita genen Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit den experimentella designen för att bedöma skillnader i den relativa betydelsen av genetiskt distinkta D. melanogaster hanar till avkomman i kontrollerade dubbel-parning experiment 7,8. Detta har skett inom ramen för en genetisk faktor hypotes att påverka spermier konkurrensförmåga och det har visats inom brottet analysen även om ett liknande förfarande gäller för försvaret analysen (Figur 1). Denna experimentell design kan modifieras för att testa andra aspekter av faderskap framgång såsom inverkan av kvinnliga genotyp 32. Ett exempel på de förändringar som kan införlivas är den direkta övervakningen av parning mellan den kvinnliga och den andra manliga. Vidare är det också viktigt att notera att den relativa prestandan av de experimentella manliga typerna är beroende av genotypen i testaren manliga och kvinnliga används och därför kan inte extrapoleras till andra scenarierinvolverar olika testare hanar och honor 10,32,33.
Eftersom insamlingen av de nödvändiga individer (Virgin honor och naiva män) och poängsättning av avkomman är arbetsintensiva, bör antalet distinkta experimentella manliga typer som skall utvärderas justeras beroende på antal väl utbildad personal tillgänglig. Experimenten beskrivs här kan lätt hanteras av en person under sex veckor. I själva verket kan upp till fem experimentella manliga typer utvärderas parallellt. Den enda ytterligare åtgärd som skall antas är att förlänga antalet dagar inrätta ursprungliga massan parningar och samla de nödvändiga individer för dem.
I vår erfarenhet, är utgångspunkten antalet använda honor (60-70) nog att rymma minskning av antal prov utan att kompromissa våra statistisk power att upptäcka skillnader mellan experimentella manliga typer (tabell 2). Minskningen i antal Informative kvinnor kan bero på olika faktorer, till exempel brist på bevis för dubbla parning eller för tidig död. Icke desto mindre kommer antalet honor som behövs för varje experimentell manlig typ för att uppnå lämplig statistisk variera beroende på storleken på effekten av den genetiska faktorn som studeras. En pilot experiment är mycket lämpligt för att uppskatta den lämplig nivå för replikation.
Statistiska skillnader i P 1 (eller P 2) poäng indikerar variationen i manlig befruktning effektivitet trots att de inte informerar om de bakomliggande mekanismer som bidrar till sådana skillnader. Detta beror på flera variabler som kan påverka spermier konkurrensförmåga (utförligt granskas i 20 och 34). Sperm attribut som storlek, antal och motilitet kan inverka på konkurrensen av spermier direkt 35. Dessutom kan andra mekanismer relaterade inte direkt spermiekonkurrens can också bidra till skillnader i P 1 och P 2 värden. Exempelvis kan första manliga spermier företrädesvis avlägsnas, flyttas eller spolas ut före eller under parningen med den andra manliga 19,20. Detta kan ske genom mekanisk stimulering, exempelvis under parning och via molekyler som finns i sädesvätskan av den andra manliga, vilket kommer att påverka första manliga spermier negativt 19,36. Därför måste kompletterande analyser som utvärderar effekten av dessa ytterligare indirekta mekanismer göras, helst före den dubbel-parning experiment som beskrivs här. Exempel på dessa analyser är sådana test för skillnader i zygoten livskraft (t.ex. larver överlevnad) och ägg kläckningsförmåga (en proxy för framgångsrik ägg befruktning) 28,37, vilket i slutändan resulterar i skillnader i avkomma nummer.
Sperm avbildningstekniker kan också vara mycket informativ 19,24,28. I huvudsak, en of hanarna modifieras genetiskt så att spermierna är märkt med en fluorescerande fusionsprotein (t.ex. att av hänvisningen hane med ett grönt fluorescerande protein) hjälper dynamik övervakning spermier i de kvinnliga reproduktionsorganen. Denna metod tillsammans med ytterligare färgning med 4 ',6-diamidino-2-phenyllindole (DAPI) användes för att direkt identifiera spermier från den första och andra män i dissekerade sädes kärl av D. melanogaster honor 24,28. I en studie 24, fanns skillnader i spermier i god överensstämmelse med skillnader i P 2 värden som stöder uppfattningen att dessa skillnader i manliga faderskap var reflekterande av sanna skillnader i spermier konkurrensförmåga och inte av indirekta mekanismer.
Senare förbättringar har uppnåtts genom att generera transgena stammar som uttryckte gröna och röda fluorescerande taggar sammansmälta med sperma-specifika proteiner 19. Dessa improvemföräldrar har låtit forskare att övervaka spermier av två direkt konkurrerande manliga spermier med en aldrig tidigare skådad grad av upplösning. Sammanfattningsvis föreslog utförandet av dubbel-parning experiment och ytterligare analyser som de som bidrar till att begränsa den typ av eventuella skillnader i P 1 eller P 2 poäng hittats bland experimentella manliga typer, vilket öppnar möjligheten att dissekera genetik grundval av naturligt förekommande variation i sperma konkurrensförmåga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna tackar NSF (MCB-1.157.876) för finansiering. Vi vill också tacka Alberto Civetta, John Roote, och två anonyma referees för sina synpunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber latex tubing | VWR | 62996-473 | 1/4 inch ID, 1/6 inch Wall |
| 1 ml graduated XL filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed |
| Parafilm | Sigma | P-7793 | |
| Mesh Fabric | Thin and smooth | ||
| Stereomicroscope | Leica | S6D | |
| CO2 Tank | Airgas | CD-50 | Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available |
| FlyStuff Foot Valve, complete system | Genesee Scientific | 59-121C | Not necessary if FlyNap is used |
| Plastic vials | Genesee Scientific | 32-109 | Come with carboard trays that can be reused for holding vials |
| Cotton balls | Fisher Scientific | AS-212 | |
| Active dry yeast | Red Star | Found in general grocery store | |
| Sharpie markers | Different colors may be used for marking different genotypes |
References
- Darwin, C. The descent of man and selection in relation to sex. , John Murray. (1871).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).
- Birkhead, T. R., Møller, A. P. Sperm competition and sexual selection. , Academic Press. (1998).
- Jones, B., Clark, A. G. Bayesian sperm competition estimates. Genetics. 163, 1193-1199 (2003).
- Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster. Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).
- Jonsson, U. B. Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster. Genetics. 47, 1719-1736 (1962).
- Boorman, E., Parker, G. A. Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status. Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).
- Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C. Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. Smith, R. L. , Academic Press. 372-427 (1984).
- Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster. Genetics. 139, 189-201 (1995).
- Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. Female x male interactions in Drosophila sperm competition. Science. 283, 217-220 (1999).
- Civetta, A., Clark, A. G. Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila. Genet. Res. 75, 143-151 (2000).
- Greenspan, L., Clark, A. G. Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster. Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).
- Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).
- Yeh, S. D., et al. Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).
- Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila. Evolution. 53, 1804-1822 (1999).
- Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A. Ejaculate-female coevolution in Drosophila mojavensis. Proc. Biol. Sci. 270, 1507-1512 (2003).
- Nonidez, J. F. The internal phenomenon of reproduction in Drosophila. Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).
- Miller, G. T., Pitnick, S. Sperm-female coevolution in Drosophila. Science. 298, 1230-1233 (2002).
- Manier, M. K., et al. Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster. Science. 328, 354-357 (2010).
- Simmons, L., Siva-Jothy, M. Sperm competition and sexual selection. Birkhead, T. R., Møller, A. P. , Academic Press. 826 (1998).
- Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila. Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).
- Markow, T. A. A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei. Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).
- Barbadilla, A., Quezada-Díaz, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance. Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).
- Civetta, A. Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila. Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).
- Turner, M. E., Anderson, W. W. Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes. Evolution. 38, 983-995 (1984).
- Harshman, L. G., Clark, A. G. Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila. Evolution. , 1334-1341 (1998).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).
- Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation. Nature. 400, 449-452 (1999).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , CSHL. (1997).
- Sokal, R. R., Rohlf, F. J. Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , 3d, Freeman, W.H. (1994).
- Clark, A. G., Begun, D. J. Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila. Genetics. 149, 1487-1493 (1998).
- Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A. Nontransitivity of sperm precedence in Drosophila. Evolution. 54, 1030-1035 (2000).
- Wigby, S., Chapman, T. Sperm competition. Curr. Biol. 14, 100-102 (2004).
- Pizzari, T., Parker, G. A. Sperm biology: an evolutionary perspective. Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. , Academic Press. 674 (2008).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction. Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).
- Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).
