Summary
Arasında Diferansiyel sperm rekabet yeteneği
Abstract
Ova Gübreleme conspecific erkekler arasında rekabet cinsel seleksiyon mekanizmalarıyla biri değil, en üst düzeye hayatta kalma ve canlılığı 1 daha başarılı çiftleşme olay sayısı maksimize çalışan yani seçimidir. Sperm rekabeti kendi sperm zaman ve mekan içinde tesadüfi olduğu aynı kadın 2, çiftleşme sonrası erkek arasındaki rekabet temsil eder. Bu olgu, bitki ve hayvan 3 birden fazla tür bildirilmiştir. Örneğin, vahşi yakalanmış D. melanogaster kadın genellikle 2-3 erkek 4 sperm içerir. Sperm farklı erkek 2,5 gelen sperm doğrudan rekabet unsuru doğurabilecek sınırlı depolama kapasitesi ile özel organlarda depolanır.
Farklı ilgi erkek (deneysel erkek türleri) sperm rekabet yeteneği karşılaştıran kontrollü çift çiftleşme deneysel ile yapılmıştırlaboratuvar 6,7 olarak ts. Kısaca, tek bir kadın arka arkaya iki farklı erkek, bir deneysel erkek ve bir çapraz çiftleşme referans erkek maruz kalmaktadır. Aynı çiftleşme düzeni daha sonra bu nedenle ortak bir referans yoluyla sperm rekabet yeteneği dolaylı karşılaştırma kolaylaştıran diğer deneysel erkek türleri ile takip edilmektedir. Deney ve referans erkekler tarafından babası bireylerin kısmını basit bir matematiksel ifadeler 7,8 kullanarak sperm rekabet yeteneği tahmin sağlar işaretleri kullanılarak tanımlanır. Buna ek olarak, sperm rekabet yeteneği deneysel erkek farklı yeterlilik özelliklerini yansıtıcı olduğu varsayılır arkadaşı (sırasıyla suç ve savunma testi,) 9, ikinci ya da ilk olmasına bağlı olarak iki farklı senaryolarda tahmin edilebilir.
Burada, kabul görmüş t altında yatan farklı genetik faktörlerin rolü sorgulamak için yardımcı olan bir yaklaşım tarifD. sperm rekabet yeteneği o fenomen melanogaster.
Introduction
Geoff Parker böcekler ve evrimsel etkileri 2 sperm rekabet yaygınlığı kaydetti yana, Drosophila ve diğer türlerde çalışmalar büyük bir artış çok farklı düzeylerde bu olay biraz ışık tutmak için çalıştık. Ilgi alanları bazı örnekler doğal nüfus 9,10, genetik mimarisi ve genetik faktörler 11-14 altta yatan önemi ve cinsiyetler 15,16 arasında birlikte evrim sürüş rolünü kendi varyasyon ve diğer detaylar olmuştur. D. melanogaster kadın, özel sperm depolama organların sınırlı kapasitesi, sperm kesesi ve seminal priz 6,17 bir çift, farklı erkeklerden sperm rekabete katkıda bulunmaktadır. Yaklaşık 1.500 sperm söz konusu organların 18,19 konaklayabilir kadın ama sadece ~ 500 için çiftleşme sırasında aktarılır. Laboratuar, kontrollü çift çiftleşme deneysel olarakBir referans erkek ve ilgilenilen bir veya daha fazla erkek içeren ments yaygın sperm rekabet yeteneği 7,8 değerlendirmek için kullanılmıştır.
Sperm rekabet yeteneği toplam soyu üzerinde çift çiftleşme deneylerde deneysel erkek tarafından çocuğu döl oranı olarak tahmin, yani bu deneysel ve referans erkeklerde hem de. Edilir Sperm rekabet yeteneği, iki bileşen ayrı bir deneyde değerlendirilen her biri oluşur. Hücum deneyde, birinci erkek gelen sperm yerinden için deneysel erkek sperm yeteneği, referans erkek yani değerlendirilir. Tersine, savunma deneyde, Deney erkek sperm yeteneği yerinden karşı veya referans erkek sperm dölleme oranı azaltmak için değerlendirilir. Tahlil, savunma ya da suç türüne bağlı olarak, sperm rekabet yeteneği puanları P 1 ve P 2, sırasıyla ile tahmin edilmektedir. P1 ve P 2 0 ile 1 arasında değerler sadece alabilir. Ara değerler genellikle doğrudan sperm rekabet içeren fizyolojik bir senaryo göstermektedir sperm karıştırma, dolaylı kanıt olarak yorumlanır. Aynı mantığı ardından, uç değerler güçlü diferansiyel sperm rekabet yeteneği delil olarak yorumlanabilir. İlk çalışmalar göstermiştir ki D P 2 melanogaster 7 uzatır iki çiftleşme arasında geçen süre olarak artan 0.8 bitti. Bu aynı deney tasarımı diğer Drosophila türlerinde kullanılmıştır, P 2 sperm rekabet yeteneği 20 değerlendirmek için çalışmalarda yaygın olarak kullanılan istatistik olmaktan. Çoğu tür için, test edilen suşların p 2 değerleri 0.6 21 daha yüksektir. Bununla birlikte, farklı erkeklerin sperm arasındaki doğrudan rekabet ilgisiz birçok mekanizma aynı puanları (Tartışma) verebilir.
Dbirinci ya da ikinci erkek tarafından çocuğu istinguishing soyu kolayca tanımlanabilir markerlerin kullanımı ile mümkündür. Erken çalışmalarda, erkeklerin birinin öldürücü dozlarda ışınlanmış edildi, örneğin, X-ışınları gibi ışınlanmış sperm tarafından döllenmiş hemen hemen tüm ova 7 yumurtadan için başarısız olduğunu. Daha sonra, göz pigmentasyon veya kanat şeklini değiştiren mutasyonlar en yaygın olarak kullanılan belirteçler olmuştur. Eski örnekleri mutasyonlar BW (kahverengi) 9, CN (zencefil) 22 ve W (beyaz) 23 fenotipleri ikinci tip mutasyon Cy (Kıvrımlı) 24 tekabül ederken, bu mutasyonların bazıları birleştirilmiştir Aynı kişi, örneğin cn bw. Daha az ölçüde, allozimler 25 ve bilinen kalıtım desenleri ile Mikrosatellitlerin 26,27 da kullanılmıştır.
Farklılıkları test etmek için deney tasarımıSperm rekabet yeteneği, Clark ve ark, esasen burada aşağıda açıklandığı. 9. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar sadece inceleme altında deneysel erkek tiplerinin ayırıcı babalık hakkında bilgi vermek. Ayrıca spor 14,28 ve sperm görselleştirme teknikleri 24 sonrası döllenme farklılıkları hesaba katmak Tahliller P 1 farklılıklar (veya P 2) puanları sperm yeterlilik farklılıklar olarak yorumlanabilir sağlar.
Şekil 1 suç ve savunma deneyleri hem de mantığı özetliyor. Sürecin lojistik göstermek için, bir suç deney D. gerçekleştirilen melanogaster 14 ayrıntılı olarak açıklanacaktır. Bu özel suç test sperm rekabet yeteneği multigen aile Sperm özel dynein ara zinciri (Sdic) ölçülebilir bir etkisi test etmek için kullanılmıştır. Tüm üyeBu multigen ailenin s X kromozomu üzerinde tandem bulunur. Nakavt erkek Sdic küme silerek oluşturulmuştur. Silinen bölümü de temel gen kısa kanat (sw) dahil ve çalışmanın amacı Sdic bir alaka değerlendirmek olduğu için, Sdic-sw silme taşıyan erkek (P {sw} olarak sembolize sw bir transgenik kopyasını tarafından kurtarıldı , ayrıca kromozom 2 bir mini-beyaz muhabiri gen) yapılan hangi. Göz rengi babalık tanımlanması için görünür bir marker olarak kullanılmıştır. Tüm referans sinekler erkek olarak kullanılmıştır suşu Oregon-R, o dışında beyaz bir mutant arka edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Küçük ölçekli deneyler tüm prosedürü aşina olmak için yapılmalıdır.
1. Virgin Kadın ve naif Erkekler Toplama
B) Oregon-R bireyler naif referans erkek toplamak amacıyla, c a) w 1.118 kişi bakire kadın toplamak için: belirtilen deney en basit sürümü yetişkinlerin aşağıdaki kombinasyonu içeren ilk haç dört tip, oluşur ) P {sw} homozigot erkek ve bakire kadın naif deneysel erkek (Tip I) toplamak için Sdic en vahşi tip organizasyon taşıyan bir kontrol hattı ve d) P {sw} homozigot erkek ve Sdic-sw-silme -taşıyan Sdic-sw eksikliği (Tip II) taşıyan saf deneysel erkek toplamak için bakire kadın.
- 8-10 kadın, 5 erkek her içeren birden fazla şişe ayarlayın. Kadın yatıyordu izin veryumurta ve her 3-5 günde yeni şişelere yetişkin aktarın. Şişe yerine şişeleri gerekirse kullanın ve her zaman taze gıda kullanın. Gerekli şişeleri sayısı üzerinde çalışma yapılan deneysel erkek tiplerinin sayısı ve farklılıklar (Tablo 1) tespit etmek için gerekli olduğu tahmin edilen bireylerin sayısına bağlıdır. Flakon başına 10'dan fazla kadın döl doğurganlık değişim neden olabilir larva büyüme sırasında aşırı kalabalık neden olabilir. 25 ° C'de saklayın şişeleri sıcaklık kontrollü bir odaya C.
- Ilk haçlar kurduktan sonra gün 11 inci ve 12 inci bakire kadın ve naif erkek toplamaya başlar. Bekleme süresi sıcaklığına bağlı olarak değişir; düşük sıcaklıklarda sonucu uzun gelişimsel zamanda bireylerin toplama geciktirmek. Eclosion üzere zaman etkileyen bir başka faktör orta türüdür. Bu mısır unu-maya orta 29 gibi besleyici gıda, yetişkin düzgün gelişimi sağlarçiftleşme kolaylaştırır üreme sistemi,. Unmated toplayın her 4-6 saat uçar. Toplarken, şişenin içine CO2 getirerek sinekler uyutmak, sinekler dokunun ve seks stereomikroskop altında (Şekil 2). Seks ve uygun fenotip ve etiket şişeleri tarafından farklı şişeleri içine istenen sinekler yerleştirin.
Not 1. Koleksiyon rutin atarak önceki gece ortaya çıkan yetişkinler tarafından sabah başlar. Gün boyunca bir veya iki kez bakire kadın ve naif erkek toplayın. Tipik olarak, D. melanogaster erkek 25 ° C 30 eclosion sonra cinsel olgun 8 saat olmak. Sinekler 12:12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında kalırlarsa, eclosion iki tepe bekleniyor: ilk 1-2 saat boyunca ışık söner önce ışığı ve 2 saat boyunca açıldıktan sonra. Eclosion pupa kararır sonra 24 saat içinde ortaya çıkar.
Not 2. En fazla 10 kadın should aşırı kalabalık önlemek için aynı şişenin içine koymak. Bunlardan en az biri bakire olmadığı için bu aynı zamanda atılır olması durumunda kadın kaybını sınırlar.
Not 3. Kısa bir süre içinde bakire kadın ve naif erkek uygun sayıda toplamak için, aşağıdaki önlemleri kabul edilebilir. Deneysel erkeklerin iki tür (Tablo 1) ile ilgili deneyler 1118 w 15-20 şişeleri ayarlayın. Hafifçe medya yüzeyine serpin ve yumurtlama kolaylaştırmak için birkaç tane kuru aktif maya pelet ekleyin. Gün üst üste anne en az 4 kez aktarın. Anne başka bir flakon (Şekil 3) aktarılır sonra her şişe içinde pupa devresi için uygun olan yüzey artırmak için, 4. veya 5. gün boyunca çok katlanmış kağıt (7 x 5 cm) takın. Ilk haçlar ortaya yetişkin sayısına yeterli değilse, bir kaç gün daha bekleyin ve bireysel olmak toplamakflakonlarından als farklı tarihlerde kurdu. Iş yükünü dışarı bile birkaç gün üst üste üzerinde deneyler yürütmek planlıyoruz.
2. Çift çiftleşme Deneyler
Şekil 4 14 yapılan çift çiftleşme deneylerinde yer alan ana adımları gösterir.
- 1. Gün sabahı, ilk çiftleşme kurmak. Oregon-R erkeklerin suç tayininde arkadaşı için ilk olarak.
- Aspiratör kullanarak, 10 4-5-günlük-eski beyaz gözlü w 1.118 bakire kadın ve 10 kırmızı gözlü Oregon-R naif erkek her içeren flakon kurmak. İki üç şişeleri 5 gün boyunca günlük olarak ayarlanır. Ayarlanması için flakon sayısı mevcut bireylerin sayısına bağlı olarak değişebilir. Sinekler 2 saat dostum izin verin.
- Oregon-R erkek atın ve bir aspiratör (Şekil 5) kullanarak yeni bir şişenin içine her kadın yerleştirin. Seks kimlik birkaç görsel inceleme ile elde edilebilirmorfolojik farklılıklar (Şekil 2). Uygun her flakon Etiket ve 2 gün (bundan sonra "v1") için flakon kadın bırakın.
- 3. Gün, ikinci çiftleşme kurmak. Kurmak erkek ve çapraz Seçim deneysel erkek türlerinin herhangi yönelik herhangi bir potansiyel sapma en aza indirmek amacıyla rastgele yapılmalıdır.
- Işığı söner iki saat önce, bir aspiratör ile yeni bir şişenin içine tekrar kadın aktarın. Uygun yeni şişe etiket (bundan sonra "v2").
- V2 içine aynı genotip üç 5-6-günlük eski deneysel erkek tanıtmak.
- Her kadın için 2.2.1 ve 2.2.2 tekrarlayın.
- 4. Gün, sağ ışık iki saat önce aspiratör kullanarak (yani 2.2.1 sonra en fazla 12 saat), atın erkek açıktır.
- Gün 6, yeni bir şişenin içine tekrar her kadın aktarın. Uygun (bundan sonra "v3") yeni şişeleri etiketleyin.
- Gün 10, w 1.118 atmak
- V2 ve v3 yavrularıyla inceleyin. Kadın v2 kadın ilk başlatan ovipositing sonra Günü 17 örneğin v2 (veya v3), içine sonra ilk inceleme 13-15 gün sonra yapılır. Ikinci muayene 17 gün sonra tam olarak gerçekleştirilir. Bu süre aynı flakon ikinci bir nesil garanti güvenli bir üst temporal sınır teşkil etmektedir. Döl sayma sağlaması ve iki denetimler aşırı kalabalık önlemek.
- Gün 17, v1 incelemek ve mevcut kırmızı gözlü döl olmadığından emin olmak, buna göre şişe işareti değilse. Hiçbir döl referans ya da deneysel erkek görülmedi ile bu çiftleşme gösterir iken beyaz gözlü döl varlığı kadın ilk çiftleşme sırasında bakire olmadığını gösterir.
- Gün 17, v2 ilk muayene gerçekleştirin. Anestezisi CO 2 ile v2 döl ortaya çıkan ve göz rengi ve cinsiyete göre sıralayabilirsiniz. Ilk ve sn babası Kayıt döl numaralarıond erkek. Şekil 6, her bir birleşme düzeninin döl beklenen fenotipleri gösterir. Bu özel deneyde 14, sadece kadın döl açıkça referans ya da deneysel erkek tarafından çocuğu ve bu nedenle sadece kızları gelen bilgiler P 2 hesaplamak için kullanılabilir olarak atanabilir. Diğer işaretleri ile erkek yavru babalık açıkça atanabilir ise, her iki cinsten döl sayıları aşağı hesaplamalarda kullanılabilir. Döl atın ama ikinci muayene için v2 tutun.
- Gün 20, v2 yeni ortaya çıkan döl ile 2.5.2 olarak devam ve sonra şişe atın.
- Gün 20, ilk kez v3 ortaya döl kontrol ve adım 2.5.2 izleyin.
- Gün 23, v3 yeni ortaya çıkan döl ile 2.5.3 olarak devam edin.
Not 1: Birden fazla çiftleşme olabileceğini P puanları üzerindeki potansiyel şişirme etkisi (2.2.2 ve 2.2.3) nedeniyle, çiftleşme, belirli bir zaman çerçevesi ile sınırlı olabilir. Zaman çerçevesi kadın kullanılan erkek genotipi ile ilişkili remating frekansına bağlıdır. Birden fazla çiftleşme olasılığı özel gece 11 sırasında azalır.
Not 2: Bu ergin sinek sayısı düşüktür maya potansiyel büyümesi ile sorunlara neden olabilir, çünkü canlı maya pelet eklemeyin.
3. Veri Analizi
- Kaydedilen döl sayıları uygun bir istatistik paket (SAS Institute örneğin, JMP) veya ücretsiz web tabanlı araçlar (örneğin kolay görsel denetim ve verimli analizi için uygun düzenlenmelidir http://vassarstats.net/ ).
- Sperm rekabet yeteneği. V2 ve v3 gelen sayıları ekleyin. Hiç ya da çok sınırlı döl (örneğin <10) yol açmıştır erkek sineklerin, işlem sırasında ölen ya da sadece başarılı insemina vardıiki erkek biri tarafından ted olmayan bilgilendirici olarak kabul edilir ve herhangi bir alt istatistiksel analiz (2.5.1 ve Tablo 2) dışındadır. Her bilgilendirici kadın için P 2 puan hesaplayın.
- Karşılaştırıldığında deneysel erkekler arasında P 2 değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı fark olup olmadığını test edin. Bu parametrik (örneğin Tukey HSD) veya P 2 değerleri dağılımının çarpıklık ve varyans ve ortalama arasındaki bağımlılık gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak non-parametrik (örneğin Çelik-Dwass) testleri kullanılarak yapılabilir. Açısal dönüşüm genellikle parametrik testi 31 kullanım öncesinde örneğin P 2 oranlarda uygulanır.
- Çiftleşme kur farkları (isteğe bağlı). Her deneysel erkek tipi için, iki kat evlendirilen kadın ve sadece ilk erkek (suçun tayininde referans erkek ve d deneysel erkek ile evlendirilen olanların sayısını hesaplamakefense tahlili). Bir iki kuyruklu Fisher testi (mevcut kullanarak http://www.langsrud.com/fisher.htm ), deneysel erkeklerin iki tür arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık olup olmadığını belirlemek.
- Cinsiyet oranı (isteğe bağlı). Her deneysel erkek için, beklenen 1:1 oranında her kadın sapma gelen döl olsun cinsiyet oranı belirlemek için ki-kare testi kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tablo 2 iki suç deney bazı belirgin özellikleri (Tahliller 1 ve 2) özetlemektedir hangi D. ve (sırasıyla, Tip I ve II) bir fonksiyonel Sdic yığılım melanogaster deneysel erkeklerde 14 karşılaştırılmıştır. Dikkate bazı çoğaltır karşılaşılan farklı olaylar aldıktan sonra, kadınların 58-83% bilgilendirici ve bu nedenle döl babalık sayıları P 2 hesaplamak için kullanılabilir olduğu tespit edildi. Parametrik olmayan test sonuçları, sağlam kümesi ile erkek (Tip I) 'in 14 ile karşılaştırıldığında Sdic küme (Tip II) olmaksızın erkekte bir düşük sperm rekabet yeteneği ile uyumluydu. Bu model yapılan suç analizleri karşısında tekrarlanabilir oldu. Benzer bir istatistiksel olarak anlamlı olmasa eğilimi (gösterilmemiştir) paralel olarak gerçekleştirilen savunma tahlillerinde bulunmuştur. Önemlisi, çiftleşme oranı farkları (adım 3.4) olmaması olasılığını dışladı kierkek genotip kadın remating davranışını 14. etkileyebilir.
| Hücum Testi | Savunma Testi | |||||
| Deneysel ♂ Tipi | w 1.118 ♀ | OR-R ♂ | ♂ deneysel | w 1.118 ♀ | ♂ deneysel | OR-R ♂ |
| Ben | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
| II | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
Tablo 1. Iki deneysel erkek türleri karşılaştırmak için çift çiftleşme deneylerde gerekli birey sayısı. OR-R, Oregon-R.
| ♀ | ||||||
| Deneysel ♂ Tipi | İlk Sayısı | Referans ile hiçbir başarılı gübreleme ♂ | Deneysel ♂ ile hiçbir başarılı gübreleme | Sorunlu 1 | Bilgilendirici (%) | P 2 2 |
| Deney 1 | ||||||
| B +(Tip I) | 60 | 5 | 6 | 2 | 47 (% 78) | 1.000 (1,000-0,987) |
| A-(tip II) | 55 | 1 | 7 | 5 | 42 (% 76) | 0,986 (1.000-0.936) |
| Deney 2 | ||||||
| I + (Tip I) | 74 | 9 | 7 | 15 | 43 (% 58) | 1.000 (1,000-0,979) |
| E-(tip II) | 75 | 3 | 8 | 2 | 62 (% 83) | 0,983 (1.000-0.927) |
Tablo 2'de. Suç tayinlerde kullanılan kadın sayısı farklı olayların etkisi özeti deneysel erkek türleri arasında farklılıklar test etmek için yapıldı. 1, esca öldütahlil sırasında ped, ya da bir eşik değerin altında yavru bir dizi yol açan. 2 Medyan (çeyrekler arası aralık).
Şekil 1. Suç ve savunma deneyleri için deneysel tasarım. Her genotip için kullanılan renk kodu yetişkin sineğin göz rengi gösterir. İncelenen genetik faktörünün yabani tip formu (Tip I) taşıyan bir ve genetik faktör işlevselliğini edilmiş olup, burada bir: Oregon R erkek iki deney erkeklerin dolaylı sperm rekabet yeteneği karşılaştırmak için bir referans olarak kullanılmasını (Tip II) tedirgin. GB transgen kromozom 2 üzerinde yer almaktadır ise Sdic küme, bu durumda genetik faktör, X kromozomu üzerinde yer almaktadır. Tasvir edilen deneylerde yapılan bu parçasıdır
Şekil 2. D. Sex kimlik melanogaster. (A) Sırt, (B) yan ve 1 saat eski kadın (solda) ve stereomicroscope altında CO2 ile anestezi erkek (sağda) (C) ventral görünümü. Erkek genital belirgin bir karanlık nokta sebebiyet veren vajinal plaka çok daha fazla pigment, bu cinsiyet tayini için kullanılacak en güvenilir karakterdir. Ayrıca, erkek ön ayakları en tarsus karanlık bir saçak içinde (seks tarak) yok kıllar sahipaspiratör kullanarak şişeleri içine bireylerin aktarırken kadın. (D) çıplak gözle eski sinek Güvenilir ve hızlı cinsiyet kimlik şiddetle tavsiye edilir. Yaşlılarda, erkek karın kadın daha dorsal çok koyu. Dişiler genellikle daha büyük ve erkeklerden daha bir soluk karın var. Yumurtlama borusu kadın karın işaret yapar.
Şekil 3,. Larvaları dolaşıp için uygun olan yüzey artırmak için kullanılır Çok katlanmış kağıt.
Şekil 4. D. sperm yeteneği rekabetçi tahlil farklılıklara deney ana hatları Vir kullanılarak 2 saat boyunca melanogaster. Kütle çiftleşme cin w 1.118 kadın ve Oregon-R erkeklerde 5 gün boyunca her gün başlatılır. Her kitle çiftleşme, bir kez sona, 12-14 kadın tek ampuller (v1) ayrı ayrı aspire edilmelidir. İki gün sonra, her kadın aynı genotip üç deneysel erkek ile birlikte yeni bir flakon (v2) aktarılır. Bu kişiler gece arkadaşı için izin verilir. Dişiler için 2 gün oviposit izin kadınlar ise ~ 12 saat sonra atılır. Daha sonra, kadın daha oviposit izin yeni bir flakon (V3) aktarılır ve son olarak 3 gün sonra atılır. Kadın v2 ve v3, deneysel ve referans erkekler tarafından babası döl hem de oviposit başladı on üç on beş ve 17 gün sonra uygun işaretleri kullanılarak tanımlanır ve kaydedilir. V2 ve V3 yavrularıyla iki kez kontrol edildikten sonra, şişeler atılır. Aşağı ok, atılan bireyler, göz sembolü, şişe denetim. 9 uyarlanmıştır.d/50547/50547fig4large.jpg "target =" _blank "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 5,. Esnek aspiratör. Kehribar lateks tüp gelen Montajlı, bir 1 ml tek mouthpart olarak sinek ve başka bir işleyişi almak için ucu mezun. Tüp içine emilir sinekler önlemek için, ince örgü kumaş için tüp kavşakta sinek alma ucu korumak için kullanılır.
6 Şekil. Suçun testinin döl Beklenen fenotipleri. Sol ve sağ, sırasıyla sperm rekabet kontrol yeteneği ve knock-out erkek değerlendirmek geçer. Parentals ve f hem de döl için genotip ve göz rengiathers gösterilmiştir. Çünkü bu tahlilde kullanılan özel genetik markerler arasında, sadece dişi soyu p 1 (ya da p 2) değerleri (ayrıntılar için metne bakınız) hesaplamak için kullanılabilir; deney erkek çocuğu tarafından erkek soyu parçası beyaz gözlü, . referans erkek erkek döl gelen bu nedenle fenotipik ayırt edilemez Df, eksikliği; P {sw}, transgen,. beyaz genin w 1.118 mutant alel büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz genetik olarak farklı göreli katkısı farklılıkları değerlendirmek için deneysel tasarım nitelendirdiler D. kontrollü çift çiftleşme deneyler 7,8 olarak döl için melanogaster erkek. Bu sperm rekabet yeteneği etkilemek için ve benzer bir prosedür savunma testi (Şekil 1) için de geçerlidir rağmen suçun testi içinde gösterildiği olmuştur hipotezi bir genetik faktör bağlamında yapılmıştır. Bu deneysel tasarım gibi kadın genotip 32'nin etkisi olarak babalık başarı diğer yönleri test etmek için modifiye edilebilir. Dahil edilebilir değişiklikler bir örnek kadın ve ikinci erkek arasındaki birleşme konusundaki doğrudan izlenmesidir. Ayrıca, deneysel erkek türleri göreli performans erkek ve dişi kullanılan test genotip bağlıdır ve bu nedenle diğer senaryolar için tahmin edilemez dikkat etmek de önemlidirfarklı test erkek ve kadın 10,32,33 ilgili.
Gerekli kişiler (bakire kadın ve naif erkek) ve döl puanlama toplanması emek yoğun olduğu için, değerlendirilmek üzere farklı deneysel erkek tiplerinin sayısı mevcut iyi eğitimli personel sayısına göre ayarlanmalıdır. Burada özetlenen Deneyler kolayca altı hafta boyunca bir kişi tarafından ele alınabilir. Aslında, en fazla beş deneysel erkek tipi paralel olarak değerlendirilebilir. Kabul edilecek tek ek bir önlem gün ilk kitle çiftleşmelerin kurma ve onlar için gerekli bireylerin toplama sayısı uzatmak için.
Bizim tecrübelerimize göre, kullanılan kadınların başlangıç numarasını (60-70) deneysel erkek tipleri (Tablo 2) arasındaki farklılıkları tespit etmek için bizim istatistiksel güç ödün vermeden örneklem büyüklüğü azalma karşılamak için yeterlidir. I sayısındaki azalmanformative kadın farklı faktörler, çift çiftleşme ya da erken ölüm kanıt örnek olmaması için neden olabilir. Bununla birlikte, yeterli istatistiksel gücü elde etmek için her bir deney Erkek tipi için gerekli kadın sayısında genetik faktör çalışma kapsamında etkisinin büyüklüğü bağlı olarak değişecektir. Bir pilot deneme çoğaltma uygun düzeyini tahmin etmek için son derece tavsiye edilir.
Bu tür farklılıkları katkıda altta yatan mekanizmalar hakkında bilgi olmamasına rağmen P 1 istatistiksel olarak farklılık (veya P 2) puanları erkek döllenme verimliliği değişim göstermektedir. Bu sperm rekabet yeteneği (yaygın 20 ve 34 olarak yorumlanan) etkileyebilecek birden çok değişken kaynaklanmaktadır. Boyutu, sayısı ve hareketliliği gibi sperm özelliklerini doğrudan 35 sperm rekabet etkileyebilir. Buna ek olarak, başka mekanizmalar doğrudan sperm rekabet CA ile ilgili değildirn da P 1 veya P 2 değerleri farklılıklara yol açmaktadır. Örneğin, ilk erkek sperm tercihen, kaldırıldı yeniden konumlandırılmış, ya da daha önce ya da ikinci erkek 19,20 ile çiftleşme sırasında yıkanabilir. Bu cinsel birleşme sırasında ve negatif 19,36 ilk erkek sperm etkileyecek ikinci erkek meni, mevcut moleküller ile, örneğin, mekanik uyarma ile oluşabilir. Bu nedenle, bu ek dolaylı mekanizmaların etkisini değerlendirmek tamamlayıcı testler ideal önce burada açıklanan çift çiftleşme deneme, yapılmalıdır. Bu testlerin Örnek zigot canlılığı farklılıkları (örneğin larva hayatta kalma) ve sonuçta döl sayısı farklılıklar neden yumurta kuluçka (başarılı yumurta döllenme için bir proxy) Berabere 28,37, için bu test ediyoruz.
Sperm görüntüleme teknikleri de 19,24,28 derece bilgilendirici olabilir. Esasen, bir of erkek sperm dişi üreme sisteminde izleme sperm dinamikleri yardımcı bir floresan füzyon proteini (örn., bir yeşil floresan protein, referans erkek o) ile etiketlenir, genetik olarak bu tip modifiye edilir. 4 kullanılarak daha fazla boyama ile birlikte bu yaklaşım ',6-diamidino-2-phenyllindole (DAPI), doğrudan D. parçalara seminal kaplar içinde, birinci ve ikinci erkek sperm sayımı kullanılarak tespit edilmiştir melanogaster kadın 24,28. Bir çalışmada 24, sperm sayısı farklılıklar erkek babalık bu farklılıklar dolaylı mekanizmaların sperm rekabet yeteneği değil, gerçek farklılıkların yansıtıcı olduğu fikrini destekleyen P 2 değerleri farklılıklar ile iyi bir uyum vardı.
Sonraki iyileştirmeler sperm-spesifik proteinlerin 19 erimiş yeşil ve kırmızı floresan etiketleri ifade transgenik suşları üreterek elde edilmiştir. Bu improvemveliler araştırmacılar çözünürlük eşi görülmemiş bir derecesi ile iki doğrudan rakip erkek sperm sperm izlemek için izin vermiş. Sonuç olarak, çift çiftleşme deneyler ve olanlar gibi ek testlerin yürütülmesi genetik olarak incelemek için olasılığı açılır deneysel erkek türleri, arasında bulunan P 1 veya P 2 puan herhangi bir farklılığın niteliği daraltmak için yardımcı önerdi doğal olarak sperm rekabet yeteneği değişim meydana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar finansman için (MCB-1.157.876) NSF teşekkür ederim. Biz de onların yorumlar için Alberto Civetta, John roote ve iki anonim hakem teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber latex tubing | VWR | 62996-473 | 1/4 inch ID, 1/6 inch Wall |
| 1 ml graduated XL filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed |
| Parafilm | Sigma | P-7793 | |
| Mesh Fabric | Thin and smooth | ||
| Stereomicroscope | Leica | S6D | |
| CO2 Tank | Airgas | CD-50 | Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available |
| FlyStuff Foot Valve, complete system | Genesee Scientific | 59-121C | Not necessary if FlyNap is used |
| Plastic vials | Genesee Scientific | 32-109 | Come with carboard trays that can be reused for holding vials |
| Cotton balls | Fisher Scientific | AS-212 | |
| Active dry yeast | Red Star | Found in general grocery store | |
| Sharpie markers | Different colors may be used for marking different genotypes |
References
- Darwin, C. The descent of man and selection in relation to sex. , John Murray. (1871).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).
- Birkhead, T. R., Møller, A. P. Sperm competition and sexual selection. , Academic Press. (1998).
- Jones, B., Clark, A. G. Bayesian sperm competition estimates. Genetics. 163, 1193-1199 (2003).
- Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster. Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).
- Jonsson, U. B. Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster. Genetics. 47, 1719-1736 (1962).
- Boorman, E., Parker, G. A. Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status. Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).
- Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C. Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. Smith, R. L. , Academic Press. 372-427 (1984).
- Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster. Genetics. 139, 189-201 (1995).
- Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. Female x male interactions in Drosophila sperm competition. Science. 283, 217-220 (1999).
- Civetta, A., Clark, A. G. Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila. Genet. Res. 75, 143-151 (2000).
- Greenspan, L., Clark, A. G. Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster. Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).
- Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).
- Yeh, S. D., et al. Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).
- Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila. Evolution. 53, 1804-1822 (1999).
- Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A. Ejaculate-female coevolution in Drosophila mojavensis. Proc. Biol. Sci. 270, 1507-1512 (2003).
- Nonidez, J. F. The internal phenomenon of reproduction in Drosophila. Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).
- Miller, G. T., Pitnick, S. Sperm-female coevolution in Drosophila. Science. 298, 1230-1233 (2002).
- Manier, M. K., et al. Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster. Science. 328, 354-357 (2010).
- Simmons, L., Siva-Jothy, M. Sperm competition and sexual selection. Birkhead, T. R., Møller, A. P. , Academic Press. 826 (1998).
- Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila. Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).
- Markow, T. A. A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei. Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).
- Barbadilla, A., Quezada-Díaz, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance. Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).
- Civetta, A. Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila. Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).
- Turner, M. E., Anderson, W. W. Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes. Evolution. 38, 983-995 (1984).
- Harshman, L. G., Clark, A. G. Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila. Evolution. , 1334-1341 (1998).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).
- Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation. Nature. 400, 449-452 (1999).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , CSHL. (1997).
- Sokal, R. R., Rohlf, F. J. Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , 3d, Freeman, W.H. (1994).
- Clark, A. G., Begun, D. J. Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila. Genetics. 149, 1487-1493 (1998).
- Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A. Nontransitivity of sperm precedence in Drosophila. Evolution. 54, 1030-1035 (2000).
- Wigby, S., Chapman, T. Sperm competition. Curr. Biol. 14, 100-102 (2004).
- Pizzari, T., Parker, G. A. Sperm biology: an evolutionary perspective. Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. , Academic Press. 674 (2008).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction. Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).
- Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).
