Summary
Nous décrivons ici une méthode générale pour le dépistage aléatoire de la matrice de microseed. Cette technique est illustrée à augmenter de manière significative le taux de dépistage des expériences de cristallisation de protéines de succès, de réduire le besoin pour l'optimisation, et de fournir un approvisionnement fiable de cristaux pour la collecte des données et expériences ligand-trempage.
Abstract
Aléatoire de dépistage de la matrice de microseed (RMM) est une technique de cristallisation de protéines dans lequel des cristaux de semences sont ajoutés aux écrans aléatoires. En augmentant la probabilité que les cristaux se développer dans la zone métastable du diagramme de phases d'une protéine, fils de cristallisation supplémentaires sont souvent obtenus, la qualité des cristaux obtenus peut être augmentée, et une bonne alimentation des cristaux pour les expériences de collecte de données et de trempage est fourni. Nous décrivons ici une méthode générale pour RMM qui peuvent être appliquées soit à goutte assis ou suspendus expériences de diffusion de vapeur à goutte, établis à la main ou à l'aide de la robotique de manipulation des liquides, dans 96 puits ou format de plateau de 24 puits.
Introduction
De sa demande initiale par Perutz, Kendrew et collègues dans la détermination des structures de l'hémoglobine et la myoglobine, les haut débit pipelines modernes automatisés de la génomique structurale consortiums, macromoléculaire cristallographie aux rayons X nous a offert un aperçu structurel sans précédent dans le monde de la protéine . Cette technique reste le procédé le plus largement applicable expérimental qui permet la visualisation directe de la structure des protéines à atomique, ou à proximité de résolution atomique (c'est à dire dans la gamme de 1-3 Å). Une condition préalable à la diffraction des rayons X pour être appliqué à une protéine est qu'elle doit d'abord être cristallisé, et c'est cette étape du processus qui reste le plus grand pas unique limitant la vitesse dans la détermination de la structure par des méthodes de diffraction 1, 2. Malgré des avancées significatives dans la compréhension du processus de cristallisation des protéines, et des améliorations majeures dans la qualité et la disponibilité des écrans de cristallisation,plateaux, et les technologies connexes, il reste impossible de prédire de façon fiable la probabilité de succès de cristallisation 3. Méthodes biochimiques et biophysiques peuvent être appliqués pour déterminer si une protéine d'intérêt affiche des caractéristiques favorables pour la nucléation et la croissance cristalline, c'est à dire qu'il est ainsi pliée, homogène, monodisperse, etc, cependant, ces indications en aucun cas fournir un indicateur définitif de cristallisation propension.
L'ensemencement a longtemps été censé être une méthode viable pour améliorer le nombre, la taille et la qualité des cristaux existants ou matériau cristallin 4-7. Cette approche est basée sur l'hypothèse qu'une condition qui favorise la nucléation des cristaux peut ne pas être optimal pour la croissance cristalline ultérieure et vice versa. En transférant le matériau nucléé d'un état à un autre, on peut tenter de découpler efficacement ces processus, donnant ainsi accès à un nouvel espace de cristallisation, encore inexploré,et par conséquent d'augmenter le taux de réussite globale d'une expérience de criblage. Méthodes établies ont été documentés pour (i) macroseeding, le transfert d'un monocristal dans son intégralité d'un état à un autre 8, (ii) l'ensemencement série, le transfert de matériau nucléé, généralement obtenu par l'application d'une pression directionnelle en utilisant par exemple la trichite d'un chat de la surface d'un cristal existant, suivi d'un passage ultérieur de la moustache grâce à une nouvelle goutte de cristallisation 9, et (iii) microseeding "classique", le transfert de cristal «graines», générés par la récolte broyé cristaux (ou cristallin matériel), dans des conditions similaires à celles qui ont donné les graines 10. Notamment tous les trois de ces méthodes sont longues et peu évolutive, certainement en comparaison à ce qui est réalisable avec la robotique moderne de cristallisation de manipulation des liquides. Ces facteurs ont contribué, à un certain niveau au moins, à la perception que les semencesING est une méthode pour être visité uniquement lorsque les autres approches ont échoué à porter ses fruits.
Aléatoire matrice microseeding (RMM) est une innovation méthodologique récente qui combine les avantages de microseeding traditionnelle avec ceux de criblage à haut débit et l'évolutivité 11-13. Cette approche repose sur la génération d'un stock de semences, produit à partir de matière cristalline nucléée, qui peut être répartie dans / sur chaque sub-well/coverslip dans un écran de cristallisation 96 condition standard. Cette méthode est applicable à tous les deux assis ou suspendus expériences de diffusion de vapeur à goutte, établis à la main ou à l'aide de la robotique de manipulation des liquides, dans 24 puits ou format de plaque de 96 puits. RMM a été démontré expérimentalement à augmenter de manière significative le taux de réussite de cristallisation, et produire des cristaux de meilleure qualité et la quantité de diffraction 11, 13, 14, et représente un outil novateur dans l'arsenal des cristallographes d'approches dans l'oNgoing effort vers la réussite de cristallisation. Nous décrivons ici une méthode générale pour RMM et fournissons des exemples de données illustrant l'efficacité de cette technique.
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Protocol
Une. Considérations stratégiques
- Le choix des semences cristaux utilisés pour des expériences de microseeding variera en fonction de l'objectif de l'expérience. Au début d'un projet, il est utile de trouver plusieurs coups de cristallisation qui peuvent fournir des points de départ de rechange pour l'optimisation de cristal. RMM réduit considérablement la nécessité pour l'optimisation de cristal car les cristaux de bonne qualité sont plus susceptibles de se développer dans la zone métastable du diagramme de phase, c'est à dire dans la région où après la perturbation ou la nucléation le système revient à l'équilibre. Nous suggérons donc d'utiliser RMM systématiquement dès que sont obtenus les premiers cristaux (ou, plus précisément, dès que les premiers cristaux cessent de croître).
- Pour la première série de RMM, un stock de semences doit être faite avec autant de matière cristalline que possible. Si un seul bien est disponible qui contient des cristaux, ou si les cristaux sont petits, il peut être utile de mettre en place de multiples répétitions de lahit original (sans semis) pour augmenter l'offre de cristaux. Si, cependant, on obtient des résultats différents de plusieurs, des cristaux d'ensemencement peuvent être récoltées à partir de plusieurs conditions et mélangés ensemble.
- Pour éviter une séparation de phase, les cristaux cultivés dans des conditions de haute teneur en sel doivent être récoltées séparément des cristaux cultivés dans des conditions de haute PEG. Si des cristaux à partir de plusieurs puits sont mélangés, une solution de réservoir qui est moins susceptible de donner des cristaux de sel doit être choisie pour la suspension d'ensemencement. Par exemple, des concentrations élevées en phosphate, sulfate, calcium et magnésium doivent être évités.
- Plus tard, dans un projet, il peut être important de chercher des cristaux de différentes cellules de l'unité afin d'améliorer la diffraction, éviter cristaux jumelés, et obtenir des cristaux qui sont appropriés pour des ligands de liaison. A ce stade, seuls les cristaux les plus appropriés (par exemple ceux qui diffractent meilleur) devraient être utilisés pour faire le stock de semences. Parfois tours répétés de microseeding sont nécessaires, où seul le «meilleur"Cristaux sont utilisés pour faire le stock de semences pour le tour suivant. Si possible, une" précipitation neutre "tel que le PEG 3000 doit être utilisé pour suspendre les cristaux de semences pour encourager de nouveaux contacts de cristal et à cristalliser des complexes qui peuvent être instables en haut des solutions de sel-12.
- Expériences de microseeding classique, où un état de cristallisation unique est utilisé, sont souvent utiles suite à l'identification d'une condition prometteuse et lors de l'optimisation ultérieure. Il est souvent nécessaire de diluer le stock de semences afin d'obtenir le nombre désiré de cristaux par goutte. Une expérience "combinatoire" de microseeding (où une série de stocks de semences de dilution croissante sont ajoutés à un état de cristallisation) est une méthode rapide pour trouver la dilution optimale du stock de semences. Cette approche est décrite ci-dessous.
2. Préparation de la semence Stock
- Faire une sonde en verre arrondi d'une pipette Pasteur en verre à l'aide d'un bec Bunsen.
- Chauffer la pipette vers le milieu jusqu'à ce qu'elle devienne souple, puis retirez rapidement à partir de la flamme et le dessiner en tirant à part les extrémités. Objectif pour tirer vers le bas le verre à un diamètre inférieur à 0,25 mm.
- Briser le verre à l'endroit où il se situe autour de 0,25 mm et brièvement plonger l'extrémité cassée dans la flamme. Répéter ce jusqu'à ce qu'un hémisphère de verre d'un diamètre de ~ 0,75 mm est formé à l'extrémité. Cette sonde est utile pour concassage matériau cristallin comme il est de taille appropriée pour la suppression des objets solides à l'échelle 0,01-1,0 mm et ne pas endommager la surface plastique d'une cristallisation plateau sous-ou bien lamelle. Grandes sondes (~ 1,0 mm) peuvent écraser les petits cristaux plus efficace parce que les cristaux sont piégés entre le verre et le plastique.
- Placez un tube de centrifugation de 1,5 ml contenant une graine perle sur la glace.
- Inspecter un plateau de cristallisation pré-établie à l'aide d'un microscope binoculaire ou système d'imagerie de cristal et sélectionnez un ou plusieurs appropriées puits du plateau à partir de laquelle récoltent matériau cristallin pour la génération du lot de plants. Tout matériau peut être utilisé y compris fines aiguilles, sphérolites, microcristaux et irréguliers, des cristaux mal formés. Le stock de semences doit être effectué dès que possible après que les cristaux cessent de croître, comme matériau âgée est plus susceptible d'être partiellement réticulé, réduisant ainsi son aptitude à l'emploi dans les expériences d'ensemencement. En cas de doute quant à savoir si le matériau cristallin à récolter est un sel ou une protéine du puits peut être visualisé en utilisant un microscope à fluorescence UV ou d'un système de formation d'image avant l'ouverture, ou le matériau cristallin peut être soumis à in-situ de l'analyse par diffraction des rayons X. dans le bac. Lorsque vous utilisez les anciens cristaux de protéines d'approche sera fluorescence sous irradiation UV, les cristaux de sel apparaîtront incolore.
- Ouvrez le plateau de cristallisation choisi bien. Pour 96 puits assis plateaux de chute couper à travers la feuille d'étanchéité supérieure en plastique autour du bien sélectionné USIng d'une lame de scalpel. Pour 24 puits plateaux de goutte suspendue enlever la lamelle à l'aide d'une paire de pinces. Inversez la lamelle et placez-le sur une surface propre stable. Retirer 50 pi de la solution de réservoir et de transférer ce liquide dans le tube à centrifuger contenant la perle de semences en sorte que le tube reste de la glace tout au long.
- Écraser soigneusement les cristaux dans le subwell (bac 96 puits) ou lamelle (plateau de 24 puits) diminue, en utilisant la sonde de verre préparé dans la section 2.1, l'affichage des résultats sous un microscope. Petits cristaux peuvent prendre plusieurs minutes pour écraser complètement. Cette étape permet à l'expérimentateur de vérifier que les cristaux sont faciles à broyer et ne sont donc pas réticulé, et également qu'ils ne sont pas des cristaux de sel. Les cristaux de sel produisent un clic distinctif qui peut être entendu et ressenti quand ils sont écrasés. Si les cristaux sont durs et difficiles à broyer essayer d'obtenir et d'utiliser des matériaux plus frais.
- Retirer 5 ul de la solution du réservoir à partir du tube de la perle de semences et transfert à la même sous-équivalent (assis expérience de la goutte), ou lamelle couvre-objet (suspendus expérience de la goutte) contenant le matériau cristallin à être récoltées. Introduire à la pipette ce liquide de haut en bas 5-6 fois pour remettre en suspension comme la plupart des sous-puits ou lamelle contenu que possible. Retour à la suspension de tube de perle de semences et répéter cette étape deux fois plus, veiller à ce que le maximum de matière cristalline est récolté que possible.
- Vortex la perle de semences pendant deux minutes, l'arrêt toutes les 30 secondes pour refroidir le tube sur la glace.
- Faites une série de dilution, la dilution du stock de graines dans une solution de réservoir par un facteur de 4 à 10 à chaque étape. En règle générale, trop de cristaux seront obtenus en utilisant un stock de semences non dilué, donc à utiliser les stocks de semences dilué pour contrôler le nombre de cristaux par puits. Au premier tour de RMM, il est important de ne pas diluer la solution stock de semences, car plus la concentration de graines les plus de coups de cristallisation seront obtenus.
- Si ce n'est pas pour être utilisés immédiatementment, transférer le stock de semences suspension et le stock de semences dilué à -20 ° C ou -80 ° C congélateur pour le stockage. Pour éviter des cycles répétés de gel-dégel, ce qui peut réduire l'efficacité du stock de semences, entreposer ce produit dans de petites fractions de volume, c'est à dire 10-20 pi. Une fois congelés, les stocks de semences peuvent être conservées indéfiniment jusqu'à ce que nécessaire.
3. Création de cristallisation Plateaux
- En fonction de la disponibilité des moyens de cristallisation et les préférences de l'expérimentateur, le criblage de cristallisation RMM peut être effectuée en utilisant soit des plateaux à 24 puits employant la méthode de diffusion en phase vapeur goutte suspendue, ou des plateaux à 96 puits en utilisant la méthode de la chute de la diffusion de vapeur assise. plateaux de cristallisation pour RMM peuvent être établis à la main, en utilisant un distributeur de manutention robotisé liquide, ou une combinaison des deux.
- Une expérience typique de RMM mis en place par la main comprendra, 1.0 solution de protéine pi, 1,0 pi état de cristallisation, et0,5 pi stock de semences. Une expérience typique mis en place à l'aide d'un robot de cristallisation comprendra, solution de protéine de 0,3 pi, 0,2 pi état de cristallisation, et 0,1 semences pi actions.
- Pour effectuer le dépistage des RMM dans 24 puits suspendus plateaux d'abandon, d'une part, à l'aide d'une pipette manuelle, transférer 300 pl de chaque état de 96 puits écran état de cristallisation dans 10 ml de format de tube unique dans chaque puits de 4 x 24 puits cristallisation lubrifiées en usine plateaux.
- Transférer 1 ul de chaque condition de cristallisation dans chaque réservoir 300 pl sur la surface d'une lamelle couvre-objet en plastique correspondante à partir de laquelle les deux bandes de renfort de protection avant et arrière ont été enlevés.
- Pour les 1 pl de chaque condition de cristallisation ajouter 1 pl de solution de protéine suivie par 0,5 pi de cristal stock de semences. Inverser chaque lamelle couvre-objet de telle sorte que la goutte de liquide est orienté vers le bas et la position au-dessus du puits approprié.
- Appuyez vers le bas sur la lamelle, la compression de la Sealing graisse et formant un joint sûr. Une fois que toutes les gouttes 96 sont établis, le plateau doit être transféré à un incubateur ou une chambre à température constante, habituellement dans la gamme de 4 à 18 ° C pour le stockage.
- Pour effectuer le dépistage des RMM dans 96 puits assis plateaux de déposer tout d'abord transférer 20-50 pi de chaque état de 96 puits écran état de cristallisation en format bloc de puits profond dans chaque puits correspondant du plateau de cristallisation. Cette étape de transfert peut être effectué en utilisant soit un robot de cristallisation, ou par un transfert manuel à l'aide d'une pipette à 8 canaux.
- réservoir de transfert, de protéines et de semences d'solutions aux gouttes à la main ou avec un robot en utilisant les volumes détaillés au paragraphe 3.1. Certains robots de cristallisation disponibles dans le commerce ne sont pas en contact distribution, et les graines de transfert d'actions performant utilisant un tel système peut entraîner un blocage de la distribution de conseil ou tuyauterie associée. L'ordre de distribution est variable: certains robots dispensent toutes les solutions simultanément. Sice n'est pas possible, passer la protéine d'abord, puis le réservoir, puis les stocks de semences.
- Si un contact de distribution de robot n'est pas disponible transfert des graines à l'aide d'une seringue en verre à faible volume munie d'une aiguille émoussée. Rincer l'aiguille en la faisant passer à travers la solution du réservoir, puis distribuer le stock de semences dans chaque goutte.
- Sceller le plateau à l'aide d'une feuille d'étanchéité transparent et le transférer à un incubateur ou une pièce à température constante pour le stockage.
4. Inspection de cristallisation Plateaux
- Visualiser l'ensemble des expériences de cristallisation à l'aide soit d'un microscope binoculaire ou d'un système de formation d'image à cristal. L'ancien permet généralement à l'utilisateur plus de contrôle sur la profondeur de vue et le degré d'agrandissement de ce dernier, mais prend plus de temps.
- Inspecter chaque sub-well/coverslip en séquence et enregistrer des preuves de la formation de cristaux. Les expériences doivent être inspectés une fois toutes les 24 heures pendant 5 jours après l'établissement et lan puis une fois tous les 7 jours pour un maximum de 4 semaines.
- Plusieurs cycles de RMM sont souvent nécessaires avant cristaux optimal de qualité de diffraction sont produites.
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Representative Results
(A) Exemple d'une expérience RMM
Pour démontrer l'efficacité du dépistage RMM nous avons appliqué cette méthode à la cristallisation de poule lysozyme d'oeuf blanc (HEWL) et foie de bovin catalase (BLC). Ces deux enzymes sont éminemment cristallisable et sont structurellement bien caractérisés des cibles 15, 16. En tant que tel à la fois de fournir d'excellents sujets d'essai avec qui pour illustrer le taux de réussite de cristallisation accrue réalisable avec RMM. expériences de cristallisation ont été établis dans 96 puits assis format plateau de déposer à l'aide de la robotique de manipulation des liquides. Solutions de HEWL BLC et ont été produites par dissolution de poudres lyophilisées de chaque dans 20 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 7,5, à des concentrations finales de 100 mg / ml et 20 mg / ml, respectivement. Pour chaque protéine trois écrans de cristallisation 96-état ont été utilisés; JCSG, le PACT et Morpheus. dépistage de cristallisation sans microseeding a été réalisée en utilisant des volumes de réservoir de 50 l et 2 plassis gouttes comprenant 1 pl de solution de protéine et 1 pl de solution de réservoir. Les six plateaux ont été stockés dans une chambre à température constante à 18 ° C et inspectés quotidiennement à l'aide d'un microscope binoculaire. Tout signe de la croissance des cristaux a été enregistré. Après cinq jours d'un seul état de chaque bac qui a été trouvé pour soutenir la croissance de matériau cristallin a été sélectionné et utilisé pour la production de semences d'actions. dépistage RMM a été réalisée comme pour le dépistage non-RMM, à l'exception que 2,5 pi assis gouttes comprenant 1 pl de solution de protéines, 1 pl de solution de réservoir et 0,5 pi de stocks de semences ont été utilisés. Tous les six plateaux RMM ont été transférés dans une chambre à température constante à 18 ° C et inspectés quotidiennement à l'aide d'un microscope binoculaire. Après cinq jours, les plateaux RMM des deux protéines ont été inspectés et le nombre de gouttes avec des cristaux a été enregistré. Figure 1 résume les résultats de cette expérience et fournit une analyse quantitative. Pour HEWL de 4 à 10 foisaugmenter le taux de réussite de cristallisation, par rapport aux plateaux non-têtes de série, a été observée lors de RMM a été appliqué à cette protéine. Notamment pour BLC un seul état dans l'écran Morpheus a été trouvé pour obtenir des cristaux par rapport à 55 conditions identifiées suite à l'utilisation de RMM. En outre, il y avait une augmentation dans le taux de réussite en BLC cristallisation en utilisant JCSG et écrans PACT respectivement 3 et 7 fois. Dans tous les cas et quelle que soit l'écran de cristallisation dépistage des RMM utilisés a donné un nombre significativement plus élevé total de cristaux de contrôle des non-RMM. Répétition des expériences de criblage RMM décrit en utilisant une semence diluée 1:100 donné beaucoup moins de résultats que lorsque le stock de semences non dilué a été utilisé, ce qui renforce l'obligation d'utiliser les stocks non dilués lors de l'exécution de la première série d'expériences RMM. Pour les deux protéines il y avait peu de variation apparente de la qualité de cristal, à en juger par la taille, la morphologie et la biréfringence. Évaluation comparative de la difqualité des cristaux générés en utilisant RMM par opposition aux méthodes de dépistage classiques de fraction dépasse le cadre de cette étude, cependant, l'analyse de diffraction préliminaire initiale en utilisant le rayonnement synchrotron d'un sous-ensemble de cristaux de deux protéines isolées de RMM et écrans non-RMM il indiqué à être peu de variation dans la qualité de diffraction, à en juger sur la base de la résolution limite et le profil de place.
(B) de l'exemple d'optimiser le nombre de cristaux par goutte
Techniques Microseeding donnent régulièrement des douches de petits cristaux. Il est donc souvent nécessaire de diluer le stock de semences à réduire le niveau de nucléation. En outre, il peut parfois être impossible de faire pousser des cristaux dans des conditions de vie qui ont été trouvés par RMM quand ensemencement n'est pas utilisé 5. Il tels cas, il est souvent utile d'utiliser microseeding "classique", où quelques gouttes sont mis en place en utilisant la même solution de réservoir avec différentes dilutions d'un stock de semences. Ce cun être fait systématiquement pour plusieurs conditions de plomb sur une seule plaque en utilisant une approche "combinatoire" (Paul Reichert, Merck Research Laboratories, communication personnelle), comme le montre la figure 2. Voici une ou plusieurs solutions de vie (H1 - H6) sont distribués dans les colonnes d'une plaque de cristallisation, tandis qu'un autre dilution d'un stock de semences (S1 - S9) est ajouté aux gouttes de chaque ligne. Par conséquent, chaque combinaison de solution de succès et dilué stock de semences sont testés sur une seule plaque, et le niveau approprié de dilution et des tendances actuelles peut être facilement identifié.
Nous avons appliqué cette approche combinatoire microseeding trois protéines modèles, xylanase, la thaumatine et thermolysine. Chaque protéine a été testée avec une condition de cristallisation qui a été montré précédemment pour donner pas de cristaux en l'absence d'ensemencement, mais constamment donné des cristaux lors de l'ensemencement a été utilisé. Les conditions de cristallisation utilisées pour la xylanase, la thaumatine et thermolysin sont énumérés dans le tableau 2. Quatre à six conditions ont été établies pour chaque protéine avec deux ou trois répétitions de chaque stock combinaison protéine / état / graine comme indiqué. Gouttes comprennent 0,3 protéine pi, 0,29 solution de réservoir pi, et 10 graines nl actions. Tous les plateaux ont été établis à l'aide d'une manipulation de liquides de robot de cristallisation. Neat stock de semences et six dilutions de ceux-ci ont été mis en place pour chaque protéine. D'autres détails expérimentaux ont été rapportés antérieurement 12. Le nombre moyen de cristaux obtenus par goutte est tracée en fonction de la dilution du stock de semences à la figure 3. Ces données montrent que le nombre de cristaux en résulte une relation à peu près linéaire avec le nombre de graines ajoutés. Pour les trois protéines testées, 01:10 -3 à -6 01:10 dilutions ont été nécessaires pour obtenir 1-10 cristaux par goutte.
Tableau 1. Liste des matériaux.
| Cristallisation cocktail | Nombre de gouttes établies par plateau | |
| La xylanase (36 mg / ml) | 2 M de sulfate d'ammonium, 0,1 M de Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| La xylanase (36 mg / ml) | 30% (p / v) de PEG 4000, 0,2 M d'acétate de sodium, 0,1 M de Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| La xylanase (36 mg / ml) | Formiate de sodium à 4 M | 3 |
| La xylanase (36 mg / ml) | 3,5 M de sulfate d'ammonium, chlorure de sodium 250 mM, 50 mM de sodium / phosphate de potassium à pH 7,5 | 3 |
| La xylanase (36 mg / ml) | 1,5 M de phosphate de potassium pH 7,0 | 3 |
| La thaumatine (30 mg / ml) | 30% (p / v) de PEG 4000, 0,2 M d'acétate d'ammonium, le citrate de sodium 0,1 M pH 5,6 | 2 |
| 20% (p / v) de PEG 4000, 20% (v / v) de 2-propanol, 0,1 M citrate de sodium pH 5,6 | 2 | |
| La thaumatine (30 mg / ml) | 30 (% p / v) de PEG 8000, 0,2 M de sulfate d'ammonium, le cacodylate de sodium 0,1 M pH 6,5 | 2 |
| La thaumatine (30 mg / ml) | 20 (% p / v) de PEG 8000, 0,2 M d'acétate de magnésium, le cacodylate de sodium 0,1 M pH 6,5 | 2 |
| La thaumatine (30 mg / ml) | 2 M de sulfate d'ammonium, 0,1 M de Tris-HCl pH 8,5 | 2 |
| La thaumatine (30 mg / ml) | Du sulfate de lithium 1,5 M, 100 mM de HEPES pH 7,5 | 2 |
| Thermolysine (15 mg / ml) | 20,0% (p / v) de PEG 6000, 100 mM d'acide citrique à pH 5,0 | 3 |
| Thermolysine (15 mg / ml) | 1,26 M de sulfate d'ammonium, le sulfate de lithium 200 mM, 100 mM Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| Thermolysine (15 mg / ml) | 10% (v / v)MPD, 100 mM pH 9,0 bicine | 3 |
| Thermolysine (15 mg / ml) | 800 mM de pH de l'acide succinique 7.0 | 3 |
Tableau 2. Les solutions de protéines et les conditions de cristallisation utilisées dans l'expérience de microseeding combinatoire.
Figure 1. (A) Comparaison des RMM et non-RMM expériences de criblage de cristallisation. Conditions favorisant la croissance de cristaux sont en vert, les conditions ne supportant pas la croissance des cristaux sont en gris. Conditions sélectionnés pour une utilisation dans les stocks de semences génération sont en rose. écrans de cristallisation sont étiquetés comme suit: (i) d'oeuf de poule lysozyme de blanc, JCSG, non-RMM, (ii) d'oeuf de poule lysozyme de blanc, JCSG, RMM, (iii) d'oeuf de poule lysozyme de blanc, le PACT, non-RMM, (iv) la poule par exemple, g lysozyme de blanc, le PACT, RMM, (v) d'oeuf de poule lysozyme de blanc, Morpheus, non-RMM, (vi) d'oeuf de poule lysozyme de blanc, Morpheus, RMM, (vii) le foie catalase bovine, JCSG, non-RMM, (viii) foie de bovin catalase, JCSG, RMM, (ix) la catalase de foie de bovin, PACT, non-RMM, (x) foie de boeuf catalase, PACT, RMM, (xi) foie de boeuf catalase, Morpheus, non-RMM, (xii) foie de boeuf catalase, Morpheus, RMM. (B) Analyse comparative des taux de succès de cristallisation en utilisant RMM et le dépistage de cristallisation non-RMM. Pour les non-RMM dépistage le nombre de conditions de cristallisation identifiées comme soutenant la croissance des cristaux de soit HEWL ou BLC sont en bleu, pour RMM dépistage le nombre de conditions de cristallisation identifiées comme soutenant la croissance des cristaux de soit HEWL ou BLC sont indiquées en rouge. Les données sont basées sur l'inspection de cristallisation plateaux 5 jours après établissement.
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Figure 2. Répartition des conditions de cristallisation et dilués semences d'suspensions pour une seule protéine dans un exemple expérience microseeding combinatoire. Colonnes en surbrillance H1-H6 contiennent différentes conditions de cristallisation supportant une croissance de cristal de protéine cible. Lignes en surbrillance S1-S7 contiennent différentes dilutions d'une protéine cible stock de semences suspension.
Figure 3. Corrélation entre les stocks de semences dilution et le nombre moyen de cristaux obtenus par goutte dans une expérience de microseeding combinatoire. Les trois protéines utilisées étaient xylanase, la thaumatine et thermolysine. Gouttes ont été établis dans une plaque de 96 puits MRC l'aide d'un robot de manipulation de liquide, et comprennent 0,3 protéine pi, 0,29 solution de réservoir pi, et 10 nl de soi fraised actions. Les données présentées sont fondées sur l'inspection des plateaux de cristallisation 5 jours après d'établissement.
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Discussion
Dans cet article, nous avons décrit une méthode générale pour RMM protéine dépistage de cristallisation. Nous avons démontré à l'aide de deux protéines de test un d'amélioration significative du taux de succès de la cristallisation en utilisant cette méthode. analyse de diffraction en utilisant le rayonnement synchrotron d'un sous-ensemble de cristaux générés en utilisant les RMM et les méthodes non-RMM a révélé peu de variation dans la qualité de diffraction entre les cristaux cultivés en utilisant soit la méthode, bien que les auteurs précédents ont signalé que les cristaux de bonne qualité sont plus susceptibles de grandir dans des expériences RMM 11, 13. HEWL et BLC ont peut-être donné des résultats atypiques car ils sont particulièrement faciles à cristalliser. Nous illustrons également l'importance de l'optimisation de la concentration des stocks de semences de cristaux utilisés dans les expériences RMM, et montrer comment cela peut être ajustée par dilution pour s'assurer que le nombre optimal de cristaux de qualité de diffraction sont produites.
RMM est un haut débit simple, et trèsProcédé évolutif qui peut être utilisé pour compléter les méthodes de criblage classiques. Les expériences peuvent être mis en place à la main ou par un robot, dans 96 puits ou des plateaux de 24 puits, et en accrochant ou assis formats d'abandon. La principale limitation de RMM est qu'il est tributaire de l'obtention d'une certaine forme de matière cristalline d'une protéine cible (ou d'une protéine homologue) afin de générer un stock de semences en première instance. Il convient de noter cependant que matériau cristallin de haute qualité n'est pas nécessaire, les auteurs ont en effet utilisé avec succès microcristaux et précipité amorphe pour faire des stocks de semences. L'utilisation d'un criblage RMM ne se limite pas à la croissance de cristaux de protéines natives. Par exemple, RMM est bien adapté pour la croissance des cristaux de selenomethione ou sélénocystéine variantes substituées. Dans de tels cas, les cristaux de la protéine native peuvent être utilisés pour faire le stock de semences. Bien que les protocoles cristal alternatif de nucléation ont été documentés 1,4, aucun n'est aussi applicable à la plus grande arange de protéines que les RMM.
Après RMM une approche microseeding combinatoire peut être utilisé pour optimiser le niveau de semis afin de produire des cristaux de collecte de données. Cela est particulièrement utile pour des expériences ligand-trempage où un grand nombre de cristaux sont souvent nécessaires. En utilisant cette approche un écran de cristallisation entière peut être rapidement établie à l'aide microseeding en combinaison avec un stock de semences dilué, chaque cédant ainsi un nombre relativement faible de cristaux.
En conclusion, nous encourageons toute personne engagée dans la cristallisation macromoléculaire à faire RMM une partie de leur flux de travail de routine dans tous les cas où les cristaux de diffraction ne sont pas obtenues directement à partir de leurs écrans initiaux.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par le BBSRC (BB/1006478/1). PRR est le récipiendaire d'une bourse de recherche de l'Université Royal Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Ph–nix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
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