Summary
Här beskriver vi en generell metod för slump microseed matrisscreening. Denna teknik har visat sig signifikant öka andelen framgångsrika proteinkristallisescreeningexperiment, minska behovet av optimering, och ge en tillförlitlig leverans av kristaller för datainsamling och ligand-blötläggningsförsök.
Abstract
Slumpmässig microseed matris screening (RMM) är ett protein kristal teknik där ympkristaller sättes till slumpmässiga skärmar. Genom att öka sannolikheten för att kristallerna kommer att växa i den metastabila zonen av ett proteins fasdiagram, är extra kristallisa leder ofta erhållits, kvaliteten på kristaller som produceras kan ökas, och ett bra utbud av kristaller för datainsamling och blötläggningsförsök tillhandahålls. Här beskriver vi en generell metod för riskhanteringsåtgärder som kan tillämpas på antingen sittande droppe eller hängande droppångdiffusion experiment som fastställs antingen för hand eller med hjälp av flytande robothantering i 96-brunn eller 24-brunnar format.
Introduction
Från sin ursprungliga ansökan genom Perutz, Kendrew och medarbetare i att bestämma strukturerna för hemoglobin och myoglobin, till de moderna med hög genomströmning automatiserade rörledningar av Structural Genomics konsortier har makromolekylär röntgenkristallografi gav oss en enorm strukturell inblick i protein världen . Denna teknik är fortfarande den mest tillämplig experimentell metod som tillåter direkt visualisering av proteinstrukturen på atomär eller nära atomär upplösning (dvs. inom 1-3 en rad). En förutsättning för röntgendiffraktion som skall tillämpas på ett protein är att det först måste kristalliseras, och det är detta skede av processen som förblir den största enskilda hastighetsbegränsande steget i strukturbestämning genom diffraktion metoderna 1, 2. Trots betydande framsteg i vår förståelse av processen för proteinkristallisering, och stora förbättringar av kvaliteten och tillgången på kristallisa skärmar,korgar och relaterad teknik, är det fortfarande omöjligt att tillförlitligt förutsäga sannolikheten för kristallise framgång 3. Biokemiska och biofysikaliska metoder kan tillämpas för att bedöma om ett protein av intresse visar gynnsamma egenskaper för kristallkärnbildning och tillväxt, är dvs det väl-vikas, homogen, monodispersa, etc, men dessa insikter inte på något sätt ge en definitiv prediktor för kristallisering benägenhet.
Sådd har länge påstods vara en genomförbar metod för att förbättra antal, storlek och kvalitet av befintliga kristaller eller kristallint material 4-7. Denna metod bygger på antagandet att ett tillstånd som stöder kristall kärnbildning kanske inte optimalt för efterföljande kristalltillväxt och vice versa. Genom att överföra kärnmaterial från ett tillstånd till ett annat, kan man försöka att effektivt frikoppla dessa processer, vilket ger tillgång till nya, ännu outforskade kristallise utrymme,och som ett resultat ökar den totala framgång på en screening experiment. Etablerade metoder har dokumenterats för (i) macroseeding, överföring av en enkristall i sin helhet från ett tillstånd till ett annat 8, (ii) strimma seeding, överföring av kärnförsedda material, i allmänhet erhållas genom tillämpning av riktad tryck med användning av till exempel en katts morrhår till ytan av en existerande kristaller, följt av efterföljande passagen av whisker genom ett nytt kristallisa droppe 9, och (iii) "klassiska" microseeding, överföring av kristall "frön", som genereras av skörd krossade kristaller (eller kristallint material), in i betingelser som liknar de som gav fröna 10. Särskilt alla tre av dessa metoder är tidskrävande och dåligt skalbara, särskilt i jämförelse med vad som är möjligt med moderna vätskehanteringskristallise robotik. Dessa faktorer har bidragit, på någon nivå åtminstone, till uppfattningen att utsädening är en metod som endast besökas när andra metoder har misslyckats med att ge resultat.
Slumpmässig matris microseeding (RMMS) är en ny metodologisk innovation som kombinerar fördelarna med traditionell microseeding med de av höghastighetsscreening och skalbarhet 11-13. Detta tillvägagångssätt förlitar sig på alstring av en startkultur, som tillverkas av kärnförsedda kristallina materialet, vilket kan alikvoteras i / på varje sub-well/coverslip i en standard 96-condition kristal skärmen. Denna metod är tillämplig på både sittande eller hängande droppångdiffusion experiment som fastställs antingen för hand eller med hjälp av flytande robothantering i 24-brunn eller 96-brunnar format. riskhanteringsåtgärder har visats experimentellt att avsevärt öka kristallise framgång, och producera kristaller av större diffraktion kvalitet och kvantitet 11, 13, 14, och utgör ett innovativt verktyg i kristallo "arsenal av metoder i oNgoing insats för kristallise framgång. Här beskriver vi en generell metod för RMM och ger exempeldata som visar effektiviteten av denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Strategiska överväganden
- Valet av frö-kristaller som används för microseeding experiment kommer att variera beroende på syftet med försöket. I början av ett projekt är det bra att hitta flera kristallisa hits som kan ge alternativa utgångspunkter för kristalloptimering. riskhanteringsåtgärder minskar avsevärt behovet av kristall optimering eftersom god kvalitet kristaller är mer sannolikt att växa i den metastabila zonen av fasdiagram, dvs i det område där följande störningar eller kärnbildning systemet återgår till jämvikt. Vi föreslår därför att använda RMM rutinmässigt så fort som de första kristaller erhålls (eller, mer exakt, så snart de första kristallerna sluta växa).
- För den inledande omgången av riskhanteringsåtgärder, bör ett frö lager göras med så mycket kristallint material som möjligt. Om endast en väl finns tillgängligt som innehåller kristaller, eller om kristallerna är små, kan det vara bra att ställa in flera upprepningar avursprungliga träff (utan seeding) för att öka utbudet av kristaller. Om emellertid ett flertal olika träffar erhållits kan ympkristaller skördas från flera villkor och blandades samman.
- För att undvika fasseparation bör kristaller odlas i hög saltförhållanden skördas separat från kristaller odlas i hög PEG förhållanden. Om kristaller från flera brunnar blandas bör en reservoar lösning som är mindre benägna att ge saltkristaller väljas för utsädes fjädring. Till exempel bör höga koncentrationer av fosfat, sulfat, kalcium och magnesium bör undvikas.
- Senare i ett projekt kan det vara viktigt att leta efter kristaller med olika enhetsceller för att förbättra diffraktion, undvika tvillingkristaller, och få kristaller som är lämpliga för bindning ligander. I detta skede bör användas endast de mest lämpliga kristaller (t.ex. de som diffract bäst) att fröet lager. Ibland upprepade omgångar av microseeding krävs, där endast de "bästa"Kristaller används för att göra fröet lager för den efterföljande omgången. Om möjligt, ett" bör neutral "fällningsmedel såsom PEG 3000 användas för att suspendera ympkristallerna in för att uppmuntra nya kristall kontakter och kristallisera komplex som kan vara instabila i höga -saltlösningar 12.
- Klassiska microseeding experiment, där en enda kristalliseförhållanden används, är ofta till hjälp efter att identifiera en lovande tillstånd och under efterföljande optimering. Det är ofta nödvändigt för att späda ut den startkultur för att få det önskade antalet kristaller per droppe. En "kombinatorisk" microseeding experiment (där ett antal frökapslar av ökande spädning tillsätts till en kristallisationstillstånd) är en snabb metod för att hitta den optimala spädningen av utsädeslagret. Denna metod beskrivs nedan.
2. Beredning av Seed Stock
- Gör en rundad glassond från ett glas pasteurpipett med hjälp av en bunsenlåga.
- Värm pipetten nära mitten tills den blir mjuk och sedan snabbt avlägsna den från lågan och dra ut den genom att dra isär ändarna. Sikta på att dra ner till en diameter under 0,25 mm glaset.
- Bryt glaset vid den punkt där den är ungefär 0,25 mm och kort störta brutna änden i lågan. Upprepa detta tills en halvsfär av glas med en diameter på ~ 0,75 mm är bildad på änden. Denna sond är användbar för krossning kristallint material som det är lämplig storlek för att slå fast föremål på 0,01-1,0 mm skala och det inte skadar plastytan av en kristallisationsplatta under bra eller täckglas. Större sonder (~ 1,0 mm) kan krossa små kristaller mer effektivt eftersom kristallerna är fångade mellan glas och plast.
- Placera ett 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande en Seed Bead på is.
- Inspektera en förutbestämd kristalfacket med ett binokulärt mikroskop eller kristallbildsystem och markera ett eller flera apenliga brunnar från facket för att skörda kristallint material för fröunderlag generation. Alla material kan användas inklusive fina nålar, sfäruliter, mikrokristaller och oregelbundna, dåligt formade kristaller. Fröet lager bör göras så snart som möjligt efter kristallerna sluta växa, eftersom äldre material är mer sannolikt att vara delvis tvärbunden, vilket minskar dess lämplighet för användning i sådd experiment. Om det finns några tvivel om huruvida det kristallina materialet som skall skördas är salt eller protein brunnen kan visualiseras med hjälp av en UV-fluorescensmikroskop eller avbildningssystem innan den öppnas, eller det kristallina materialet kan underkastas in situ-röntgendiffraktion analys i facket. Vid användning av de tidigare tillvägagångssätt proteinkristaller kommer fluorescerar under UV-bestrålning, kommer saltkristaller verkar färglös.
- Öppna den valda kristallisationsplatta väl. För 96-väl sitter droppe brickor skär genom den övre plasttätningsblad runt den markerade väl USIng ett skalpellblad. För 24 brunnar hängande droppe brickor bort täckglas med hjälp av en pincett. Vänd täckglas och placera den på ett stabilt ren yta. Ta bort 50 ul av reservoarlösningen och överföra denna vätska till mikrocentrifugrör innehåller Seed Bead se till att röret förblir på is hela.
- Grundligt krossa kristallerna i subwell (96-brunnar) eller täckglas (24-brunnar) sjunker, med hjälp av glassond upprättats i avsnitt 2.1, visar resultatet under ett mikroskop. Små kristaller kan ta flera minuter att krossa ordentligt. Detta steg gör det möjligt för försöksledaren att kontrollera att de kristaller som är lätta att krossa och är därför inte tvärbundna, och även att de inte är saltkristaller. Saltkristaller producerar distinkt klick som hörs och kände när de krossas. Om kristallerna är tuffa och svåra att krossa försök att skaffa och använda fräschare material.
- Ta 5 pl av reservoarlösningen från Seed Bead röret och tverför till motsvarande under väl (sittande droppe experiment) eller täckglas (hängande droppe experiment) som innehåller kristallina material som skall skördas. Pipettera denna flytande upp och ner 5-6 gånger för att suspendera så mycket av sub-well eller täck innehåll som möjligt. Returnera suspensionen till groddkornet röret och upprepa detta steg två gånger, så att så mycket kristallint material skördas som möjligt.
- Vortexa groddkornet för två minuter, stoppa varje 30 sekunder för att kyla röret på is.
- Gör en spädningsserie, utspädning av den startkultur i reservoarlösning med en faktor av 4 till 10 i varje steg. Vanligtvis kommer alltför många kristaller erhållas vid användning av en outspädd frö lager, så använd den utspädda frökapslar att kontrollera antalet kristaller per brunn. I den första omgången av riskhanteringsåtgärder, är det viktigt att inte späda ut utsädet stamlösning, eftersom ju större koncentrationen av frön de mera kristallisa träffar kommer att erhållas.
- Om den inte skall användas omedelbartbart, överföra fröet lager fjädring och den utspädda frö lager till en -20 ° C eller -80 ° C frys för förvaring. För att förhindra upprepade frys-tö-cykler, vilket kan minska effekten av fröet lager, lagra detta material i små volymer portioner, det vill säga 10-20 pl. När frysta, kan frökapslar hållas på obestämd tid tills det behövs.
3. Etablering av Kristallisa Brickor
- Beroende på tillgången på kristallisa anläggningar och preferenser försöksledaren, kan utföras RMMS kristal screening med antingen 24-såväl fack som använder den hängande droppångdiffusion metod, eller 96 brunnar brickor med hjälp av sitt droppångdiffusion metod. Kristallisations brickor för RMM kan fastställas antingen för hand, med hjälp av en vätskehanterande robotic dispenser, eller en kombination av de två.
- Ett typiskt riskhanteringsåtgärder experiment som inrättats för hand kommer att omfatta, 1,0 pl proteinlösning, 1,0 l kristal skick, och0,5 l frö lager. Ett typiskt experiment konfigureras med en kristallisering robot kommer att bestå, 0,3 pl proteinlösning, 0,2 l kristal skick, och 0,1 l frö lager.
- För att utföra RMM screening i 24-brunnars hängande droppe brickor, för det första, genom att använda en manuell pipett, överför 300 ul av varje tillstånd från en 96-brunns tillstånd kristal skärm i 10 ml enda rör format i varje brunn av 4 x 24-brunnars pregreased kristallisation brickor.
- Överför 1 l av varje kristal tillstånd från var 300 l behållare på ytan av en motsvarande plasttäckglas som både främre och bakre skyddsfilmen remsor har tagits bort.
- Till 1 l av varje kristallisationstillstånd till 1 l av proteinlösning följt med 0,5 l av kristall frö lager. Vänd varje täckglas så att den droppe vätska nedåt vänd och position ovanför lämpliga väl.
- Tryck nedåt på täckglas, komprimera sealing fett och bildar en säker tätning. När alla 96 droppar är etablerade, bör brickan överföras till en inkubator eller konstant temperatur, vanligen i intervallet 4-18 ° C för förvaring.
- För att utföra RMM screening i 96-brunnars sittande droppe brickor först överföra 20 till 50 | il av varje tillstånd från en 96-brunns tillstånd kristal skärm i djup brunn blocket format till varje motsvarande brunn i kristallisationsplatta. Denna överföringssteg kan genomföras med användning av antingen en kristallisa robot, eller genom manuell överföring med användning av en 8-kanals-pipett.
- Transfer reservoar, protein och utsäde lagerlösningar till dropparna för hand eller med en robot med hjälp av de volymer som anges i 3.1. Några kommersiellt tillgängliga kristallisa robotar inte kontakta dispense, och utför frö lager överföring med hjälp av ett sådant system kan leda till blockering av dispense tips eller tillhörande slangar. Ordningen på dispense varierar: några robotar avstå alla lösningar samtidigt. Omdetta inte är möjligt, avstå protein först, sedan behållaren, sedan frö lager.
- Om en kontakt dispense robot är inte tillgänglig överförings fröna med hjälp av en spruta låg volym glas försedd med en trubbig nål. Skölj nålen genom passering genom reservoarlösningen sedan dosera fröet lager i varje droppe.
- Täta kassett med en transparent tätningsblad och överför till en inkubator eller konstant temperatur utrymme för förvaring.
4. Inspektion av Kristallisa Brickor
- Visualisera alla kristallise försök med antingen en kikare mikroskop eller ett kristallbildsystem. Den förstnämnda ger vanligtvis användaren större kontroll över utsikt djup och graden av förstoring än de senare, men är mer tidskrävande.
- Inspektera varje sub-well/coverslip i sekvens och spela in några bevis för kristallbildning. Experiment ska inspekteras en gång per 24 timmar i 5 dagar efter etablering ochn därefter en gång var 7 dagar för upp till 4 veckor.
- Multipla cykler av RMM är ofta krävs innan optimal diffraktion kvalitet kristaller bildas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(A) Exempel på en RMM experiment
För att demonstrera effektiviteten av RMM screening vi tillämpat denna metod för att kristallisationen av höna äggvitelysozym (HEWL) och bovin lever katalas (BLC). Båda dessa enzymer är synnerligen kristalliserbar och är strukturellt väl karakteriserade målen 15, 16. Som sådan båda ger utmärkt försökspersoner med för att illustrera den förbättrade kristal framgång uppnås med riskhanteringsåtgärder. Kristallisaexperiment etablerades i 96-väl sitter droppe fack format med flytande robothantering. Lösningar av HEWL och BLC ställdes genom att lösa upp frystorkat pulver av vardera i 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5, till slutkoncentrationer av 100 mg / ml och 20 mg / ml. För varje protein tre 96-condition kristallisa skärmar använts, JCSG, PACT och Morpheus. Kristallisa screening utan microseeding utfördes med användning av reservoar volymer av 50 | il och 2 jilsittande droppar omfattar 1 l av proteinlösning och 1 l av reservoarlösning. De sex tråg lagrades i ett rum med konstant temperatur vid 18 ° C och inspekterades dagligen med användning av ett binokulärt mikroskop. Varje bevis på kristalltillväxt noterades. Efter fem dagar ett enda tillstånd från varje fack som fanns för att stödja tillväxten av kristallina material väljs och används för fröunderlag generation. RMM screening utfördes som för icke-RMM screening, med det undantaget att 2,5 | il sittande droppar innefattande en ^ il proteinlösning, 1 ul av reservoarlösning och 0,5 | il av startkultur användes. Alla sex RMM brickor överfördes till ett rum med konstant temperatur vid 18 ° C och inspekterades dagligen med användning av ett binokulärt mikroskop. Efter fem dagar RMMS brickor av båda proteinerna har inspekterats och antalet droppar med kristaller noterades. Figur 1 sammanfattar resultaten från detta experiment och ger kvantitativ analys. För HEWL en 4 till 10-faldigtökning i kristallisaträffsäkerhet, jämfört med icke-ympade brickor, observerades när RMM påfördes detta protein. Särskilt för BLC endast ett enda villkor i Morpheus skärmen befanns ge kristaller jämfört med 55 villkor som identifierats efter användning av riskhanteringsåtgärder. Vidare fanns det en ökning av andelen framgångsrika i BLC kristallisation med användning JCSG och PACT skärmar respektive 3 och 7-faldigt. I samtliga fall, och oberoende av kristallisa skärmen används riskhanteringsåtgärder screening gav ett betydligt större totalt antal kristaller än icke-riskhanteringsåtgärder screening. Repetition av de riskhanteringsåtgärder screeningexperiment beskrivs med en 1:100 utspädning frö gav betydligt färre träffar än när den outspädda fröunderlag användes, förstärker kravet på att använda outspädd lager när du utför den inledande omgången av riskhanteringsåtgärder experiment. För båda proteinerna fanns det lite uppenbar variation i kristallkvalitet, att döma av storlek, morfologi, och dubbelbrytning. Jämförande bedömning av difbråkdel kvaliteten på kristallerna som genereras med hjälp av riskhanteringsåtgärder i motsats till konventionella screeningmetoder går utanför ramen för denna studie, dock initialt preliminär diffraktionsanalys använder synkrotronljus av en delmängd av kristaller av båda proteiner isolerade från riskhanteringsåtgärder och icke-riskhanteringsåtgärder skärmar anges där till vara lite variation i diffraktion kvalitet, bedömt utifrån upplösning gräns och spotprofilen.
(B) Exempel på att optimera antalet kristaller per droppe
Microseeding tekniker ger regelbundet duschar av små kristaller. Därför är det ofta nödvändigt att späda frö lager att minska nivån av kärnbildning. Dessutom kan det ibland vara omöjligt att odla kristaller i drabbade förhållanden som har hittats av riskhanteringsåtgärder när sådd inte används 5. Det sådana fall är det ofta bra att använda "klassiska" microseeding, där flera droppar sätts upp med hjälp av samma reservoarlösningen med olika spädningar av ett frö lager. Denna cen ske systematiskt under flera bly förhållanden på en enda skylt med en "kombinatorisk" metod (Paul Reichert, Merck Research Laboratories, personlig kommunikation), som visas i figur 2. Här en eller flera drabbade lösningar (H1 - H6) dispenseras i kolumnerna i en kristallisationsplatta, medan en annan spädning av en startkultur (S1 - S9) sätts till de droppar av varje rad. Därför varje kombination av träff lösning och utspädd frö lager testas på en enda skylt, och den lämpliga nivån för utspädning och eventuella trender som finns kan lätt identifieras.
Vi tillämpat denna kombinato microseeding förhållningssätt till tre modellproteiner, xylanas, taumatin och termolysin. Varje protein testades med en kristallisationstillstånd som tidigare hade visat sig ge inga kristaller i frånvaro av sådd, men genomgående gav kristaller när ympning användes. De kristallise villkor som används för xylanas, taumatin och thermolysin är listade i tabell 2. Fyra till sex villkor fastställdes för varje protein med antingen två eller tre repetitioner av varje protein / skick / frö lager kombination som visas. Drops omfattade 0,3 l protein, 0,29 l reservoarlösning, och 10 nl frö lager. Alla magasin etablerades med hjälp av en vätskehantering kristal robot. Snyggt frö lager och sex spädningar därav sattes upp för varje protein. Andra experimentella detaljer har tidigare 12 rapporterats. Det genomsnittliga antalet erhållna kristallerna per droppe plottas mot utspädning av startkultur i figur 3. Dessa data visar att det antal kristaller följer en grovt linjärt samband med antalet frön sattes. För de tre proteinerna som testades, var 1:10 -3 till 01:10 -6 späd krävs för att erhålla 1-10 kristaller per droppe.
Tabell 1. Lista över material.
| Kristallisa cocktail | Antal droppar som fastställts per bricka | |
| Xylanas (36 mg / ml) | 2 M ammoniumsulfat, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| Xylanas (36 mg / ml) | 30% (vikt / volym) PEG 4000, 0,2 M natriumacetat, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| Xylanas (36 mg / ml) | 4 M natriumformiat | 3 |
| Xylanas (36 mg / ml) | 3,5 M ammoniumsulfat, 250 mM natriumklorid, 50 mM natrium / kaliumfosfat, pH 7,5 | 3 |
| Xylanas (36 mg / ml) | 1,5 M kaliumfosfat pH 7,0 | 3 |
| Taumatin (30 mg / ml) | 30% (vikt / volym) PEG 4000, 0,2 M ammonium-acetat, 0,1 M natriumcitrat pH 5,6 | 2 |
| 20% (vikt / volym) PEG 4000, 20% (volym / volym) 2-propanol, 0,1 M natriumcitrat pH 5,6 | 2 | |
| Taumatin (30 mg / ml) | 30 (% vikt / volym) PEG 8000, 0,2 M ammoniumsulfat, 0,1 M natriumkakodylat pH 6,5 | 2 |
| Taumatin (30 mg / ml) | 20 (% vikt / volym) PEG 8000, 0,2 M magnesiumacetat, 0,1 M natriumkakodylat pH 6,5 | 2 |
| Taumatin (30 mg / ml) | 2 M ammoniumsulfat, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5 | 2 |
| Taumatin (30 mg / ml) | 1,5 M litiumsulfat, 100 mM HEPES pH 7,5 | 2 |
| Termolysin (15 mg / ml) | 20,0% (vikt / volym) PEG 6000, 100 mM citronsyra pH 5,0 | 3 |
| Termolysin (15 mg / ml) | 1,26 M ammoniumsulfat, 200 mM litiumsulfat, 100 mM Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| Termolysin (15 mg / ml) | 10% (vol / vol)MPD, 100 mM bicin pH 9,0 | 3 |
| Termolysin (15 mg / ml) | 800 mM bärnstenssyra pH 7,0 | 3 |
Tabell 2. Protein lösningar och kristallisationsbetingelser som används vid kombinato microseeding experimentet.
Figur 1. (A) Jämförelse av riskhanteringsåtgärder och icke-RMM kristalscreeningsexperiment. Villkor som stöder kristalltillväxt är i grönt, förhållanden som inte stöder kristalltillväxt är i grått. Villkor som valts för användning i fröunderlag generation är i rosa. Kristallisations skärmar är märkta enligt följande (i) höna äggvitelysozym, JCSG, icke-RMM, (ii) höna äggvitelysozym, JCSG, RMM, (iii) höna äggvitelysozym PACT, icke-RMM, (iv) höna t.ex. g vit lysozym, pakt RMM, (v) höna äggvitelysozym, Morpheus, icke-RMM, (vi) höna äggvitelysozym, Morpheus, RMM, (vii) bovin lever katalas, JCSG, icke-RMM, (viii) nötlever katalas, JCSG, riskhanteringsåtgärder, (ix) nötlever katalas, Pact, icke-riskhanteringsåtgärder, (x) nötlever katalas, PACT, riskhanteringsåtgärder, (xi) nötlever katalas, Morpheus, icke-riskhanteringsåtgärder, (xii) nötlever katalas, Morpheus, riskhanteringsåtgärder. (B) Jämförande analys av kristal framgång med hjälp av riskhanteringsåtgärder och icke-riskhanteringsåtgärder kristallise screening. För icke-riskhanteringsåtgärder screening antalet kristallisationsförhållanden som identifierats som stödjande kristalltillväxt av antingen HEWL eller BLC visas i blått, för riskhanteringsåtgärder screening antalet kristallisationsförhållanden som identifierats som stödjande kristalltillväxt av antingen HEWL eller BLC visas i rött. Uppgifterna är baserade på inspektion av kristallisa fack 5 dagar efter etablering.
2.jpg "/>
Figur 2. Fördelning av kristallisavillkor och utspädda frö lager upphängningar för ett enda protein i ett exempel kombinato microseeding experiment. Markerade kolumner H1-H6 innehåller olika kristallisationsförhållanden som stöder målprotein kristalltillväxt. Markerade rader S1-S7 innehåller olika utspädningar av ett målprotein frö lager fjädring.
Figur 3. Korrelation mellan frö lager utspädning och genomsnittligt antal kristaller per droppe i en kombinato microseeding experiment. De tre proteinerna som användes var xylanas, taumatin och termolysin. Droppar etablerades i en 96-brunnars MRC platta med användning av en vätskehanteringsrobot, och innefattar 0,3 | il protein, 0,29 pl reservoarlösning och 10 nl av färskt se-ed lager. De data som presenteras är baserade på inspektion av kristallisafacken 5 dagar efter etablering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna skrift har vi beskrivit ett allmänt förfarande för RMM proteinkristallisascreening. Vi har visat genom att använda två testproteiner en betydande förbättring i kristallise framgång med denna metod. Diffraktion analys med synkrotronljus av en delmängd av kristaller som genereras med hjälp av riskhanteringsåtgärder och icke-RMMS metoder visade liten variation i diffraktion kvalitet mellan kristaller odlas antingen metod, även om tidigare författare har rapporterat att god kvalitet kristaller är mer sannolikt att växa i riskhanteringsåtgärder experiment 11, 13. HEWL och BLC kan ha gett atypiska resultat eftersom de är ovanligt lätta att kristallisera. Vi illustrerar också vikten av att optimera koncentrationen av kristall frökapslar som används i RMM experiment, och visa hur denna kan justeras genom utspädning så att ett optimalt antal diffraktion kvalitet kristaller bildas.
RMM är en enkel, med hög genomströmning, starktskalbar metod som kan användas för att komplettera traditionella screeningmetoder. Experiment kan ställas in för hand eller med robot, i 96-brunn eller 24 brunnar brickor, och i hängande eller sittande droppformat. Den största begränsningen av RMM är att det är beroende av att erhålla någon form av kristallint material av ett målprotein (eller ett homologt protein), för att generera en startkultur i ett första skede. Noteras bör dock att hög kvalitet kristallina material inte behövs, ja författarna har framgångsrikt använt mikrokristaller och amorf fällning att göra frökapslar. Användningen av RMM screening är inte begränsad till tillväxt av kristaller av nativa proteiner. Till exempel är RMM väl lämpade för odling av kristaller av selenomethione eller selenocystein substituerade varianter. I sådana fall, kan kristaller av det nativa proteinet användas för att göra såddlagret. Även alternativa kristallkärnprotokoll har dokumenterats 1,4, ingen är lika tillämpliga på så bred arängl av proteiner som RMM.
Efter RMM kan användas för ett kombinatoriskt microseeding tillvägagångssätt för att optimera nivån av ympning för att producera kristaller för datainsamling. Detta är särskilt användbart för ligand-blötläggnings-experiment där ett stort antal kristaller ofta krävs. Kan etableras snabbt Med hjälp av denna metod en hel kristal skärmen med microseeding i kombination med en utspädd frö lager, med varje brunn vilket ger ett relativt litet antal kristaller.
Avslutningsvis uppmanar vi alla som deltar i makromolekylära kristallisering att göra riskhanteringsåtgärder en del av sin rutin arbetsflöde i samtliga fall där brytande kristaller inte erhålls direkt från sina ursprungliga skärmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats delvis av BBSRC (BB/1006478/1). PRR är mottagare av en Royal Society University Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Ph–nix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
- Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- Babnigg, G., Joachimiak, A. Predicting protein crystallization propensity from protein sequence. J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).
- Bergfors, T.
- Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).
- Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).
- Bergfors, T. Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories. Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).
- Xu, L., Butcher, S. J., et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1. J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).
- Rangarajan, E. S., Izard, T. Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding. Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).
- Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).
- D'Arcy, A., Villard, F., et al. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).
- Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
- Obmolova, G., Malia, T. J., et al. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).
- Villasenor, A. G., Wong, A., et al. Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).
- Strynadka, N. C., James, M. N. Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. EXS. 75, 185-222 (1996).
- Diaz, A., Loewen, P. C., et al. Thirty years of heme catalases structural biology. Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).
