Summary
Her beskriver vi en generell metode for tilfeldig microseed matrise screening. Denne teknikken er vist å signifikant øke suksessraten av protein krystallisering screening eksperimenter, redusere behovet for optimalisering, og gir en pålitelig forsyning av krystaller for datainnsamling og ligand-avslapnings eksperimenter.
Abstract
Tilfeldig microseed matrise screening (RMM) er et protein krystallisering teknikk der kimkrystallene legges til tilfeldige skjermer. Ved å øke sannsynligheten for at krystallene vokser i den metastabile sone for et protein som er fasediagrammet, er ekstra krystallisering fører ofte oppnås, og kvaliteten av krystaller dannes, kan økes, og en god tilførsel av krystaller for datainnsamlings-og avslapnings eksperimenter er gitt. Her beskriver vi en generell metode for RMM som kan brukes til enten sittende dråpe eller hengende dråpe dampdiffusjon eksperimenter, etablert enten for hånd eller ved hjelp av væskebehandlings robotikk, i 96-brønn eller 24-brønns skuffen format.
Introduction
Fra sin første søknad etter Perutz, Kendrew og medarbeidere i å bestemme strukturene av hemoglobin og myoglobin, til de moderne high throughput automatiserte rørledninger fra strukturelle genomikk konsortier, har makromolekylært røntgenkrystallografi gitt oss en enestående strukturell glimt inn i protein verden . Denne teknikken er fortsatt den mest allment gjeldende eksperimentell metode som tillater direkte visualisering av proteinstruktur på atom, eller i nærheten av atom-oppløsning (dvs i 1-3 et område). En forutsetning for røntgendiffraksjon som skal anvendes på et protein, er at det må først bli krystallisert, og det er denne fasen av prosessen som forblir den største hastighetsbegrensende trinn i strukturbestemmelse etter diffraksjonsmetoder 1, 2. Til tross for betydelige fremskritt i forståelsen av prosessen med protein krystallisering, og store forbedringer i kvalitet og tilgjengeligheten av krystallisering skjermerskuffer og relaterte teknologier, er det fortsatt umulig å sikkert forutsi sannsynligheten for krystallisering suksess tre. Biokjemiske og biofysiske metoder kan bli anvendt for å vurdere hvorvidt et protein av interesse viser gunstige egenskaper til krystallkjernedannelse og vekst, dvs. at det er vel-foldet, homogen, monodisperse, etc., men denne informasjonen ikke på noen måte å gi en endelig prediktor for krystallisering tilbøyelighet.
Såing har lenge vært påstått å være en levedyktig metode for å forbedre antall, størrelse og kvalitet av eksisterende krystaller eller krystallinske materiale 4-7. Denne fremgangsmåten er basert på den forutsetning at en tilstand som støtter krystallkjernedannelse ikke kan bli optimal for påfølgende krystallvekst, og vice versa. Ved å overføre kjerneholdige materialet fra en tilstand til en annen, kan man forsøke å effektivt kople disse prosessene, og dermed gi tilgang til nye, som ennå uutforsket krystallisering plass,og som et resultat å øke den samlede suksessrate på en screening eksperiment. Etablerte fremgangsmåter er blitt dokumentert for (i) macroseeding, overføring av en enkelt krystall i sin helhet fra en tilstand til en annen 8, (ii) strek såing, overføring av kjerneholdige materiale, vanligvis oppnådd ved anvendelse av retningsbestemt trykk ved bruk av f.eks en katt whisker til overflaten av et eksisterende krystaller, etterfulgt av etterfølgende passasje av whisker gjennom en ny krystallisering dråpe 9, og (iii) "klassiske" microseeding, overføring av krystall "frø", generert ved å høste knust krystaller (eller krystallinsk materiale), i forhold som ligner de som ga frøene 10.. Spesielt alle disse tre metodene er tidkrevende og dårlig skalerbar, i hvert fall i forhold til hva som er oppnåelig med moderne væskehåndtering krystallisering robotikk. Disse faktorene har bidratt, på noen nivå minst, til en oppfatning av at frøeting er en metode som skal besøkes kun når andre tilnærminger har ikke klart å bære frukter.
Tilfeldig matrise microseeding (RMM) er en fersk metodisk innovasjon som kombinerer fordelene ved tradisjonell microseeding med de av høy gjennomstrømming screening og skalerbarhet 11-13. Denne fremgangsmåten er avhengig av dannelsen av et frø lager, produsert fra kjerneholdige krystallinske materiale, som kan deles opp i porsjoner / på hver sub-well/coverslip i en standard 96-tilstand krystallisering skjerm. Denne metoden gjelder for både sittende eller hengende dråpe dampdiffusjon eksperimenter, etablert enten for hånd eller ved hjelp av væskebehandlings robotikk, i 24-brønn eller 96-brønns skuffen format. RMM er påvist eksperimentelt til en betydelig økning krystallisering suksessrate, og produsere krystaller av større diffraksjon kvalitet og kvantitet 11, 13, 14, og representerer et nyskapende verktøy i Krystallo 'arsenal av tilnærminger i ongoing innsats mot krystallisering suksess. Her beskriver vi en generell metode for RMM og gi prøvedata som illustrerer effektiviteten av denne teknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Strategiske hensyn
- Valget av seed-krystaller benyttes til microseeding eksperimenter vil variere avhengig av formålet med eksperimentet. I begynnelsen av et prosjekt er det nyttig å finne flere krystallisering treff som kan gi alternative utgangspunkter for krystall optimalisering. RMM reduserer behovet for krystall optimalisering fordi god kvalitet krystaller er mer sannsynlig å vokse i den metasone av fasediagrammet, dvs. i det området der følgende forstyrrelse eller Nukleasjon systemet går tilbake til likevekt. Vi vil derfor foreslå å bruke RMM rutinemessig så snart de første krystallene er innhentet (eller, mer presist, så snart de første krystallene slutte å vokse).
- For den første runden av RMM, bør et frø lager gjøres med så mye krystallinsk materiale som mulig. Hvis bare én brønn er tilgjengelig som inneholder krystaller, eller hvis krystaller er liten, kan det være nyttig å sette opp flere repetisjoner avopprinnelige hit (uten seeding) for å øke tilførselen av krystaller. Hvis, derimot, er flere forskjellige treff oppnås, kan kimkrystallene høstes fra en rekke tilstander og blandet sammen.
- For å unngå faseseparasjon, bør krystaller vokst i høy saltforhold høstes separat fra krystaller vokst i høy-PEG forhold. Hvis krystaller fra flere brønner blandes, bør et reservoar løsning som er mindre tilbøyelige til å gi saltkrystaller velges for frø suspensjon. For eksempel bør høye konsentrasjoner av fosfat-, sulfat-, kalsium-og magnesium unngås.
- Senere i et prosjekt, kan det være viktig å lete etter krystaller med forskjellige enhetsceller for å forbedre diffraksjon, unngå tvillingrikenes krystaller og oppnå krystaller som er egnet for binding av ligander. På dette stadiet bare de mest egnede krystaller (f.eks de som diffract beste) bør brukes til å gjøre avlsmateriale. Noen ganger gjentatte runder med microseeding er nødvendig, der kun de "beste"Krystaller blir brukt for å gjøre frøene lager for den etterfølgende runde. Hvis det er mulig, et" skal nøytrale "fellingsmiddel, for eksempel PEG 3000 anvendes til å suspendere kimkrystaller i å stimulere ny krystall-kontakter og å krystallkomplekser som kan være ustabile i høy -saltløsninger 12.
- Klassiske microseeding forsøk, hvor en enkelt krystallisering betingelse er brukt, er ofte nyttig å følge identifisering av en lovende tilstand og under påfølgende optimalisering. Det er ofte nødvendig å fortynne frøet lager for å få det ønskede antall av krystaller pr dråpe. En "kombinatorisk" microseeding eksperiment (hvor en serie av frø bestander av økende fortynning er lagt til en krystallisering tilstand) er en rask metode for å finne den optimale fortynning av avlsmateriale. Denne fremgangsmåten er beskrevet nedenfor.
2. Utarbeidelse av Seed Stock
- Lag en avrundet glass sonde fra et glass Pasteur pipette ved hjelp av en Bunsen flamme.
- Varm pipetten nær midten til den blir myk, deretter raskt fjerne den fra flammen og trekke den ut ved å trekke fra hverandre endene. Mål å trekke glasset ned til en diameter under 0,25 mm.
- Bryt glasset på det punktet hvor det er rundt 0,25 mm og kort stupe brutt enden inn i flammen. Gjenta dette inntil en halvkule av glass med en diameter på ~ 0,75 mm er dannet på enden. Denne sonden er nyttig for knusing av krystallinsk materiale som det er riktig størrelse for slående faste gjenstander på 0,01 til 1,0 mm skala, og det skader ikke plast overflaten av en krystallisering skuff sub-brønn eller dekkglass. Større prober (~ 1,0 mm) kan knuse små krystaller mer effektivt fordi krystallene er fanget mellom glass og plast.
- Plasser en 1,5 ml mikro rør som inneholder en Seed Bead på is.
- Inspiser en pre-etablert krystallisering skuffen ved hjelp av en kikkert mikroskop eller krystall imaging system og velge en eller flere appropriate brønner fra skuffen for å høste krystallinsk materiale for avlsmateriale generasjon. Ethvert materiale kan benyttes inkludert fine nåler, sfærolitter, mikrokrystaller og uregelmessige, dårlig dannet krystaller. Frøet lager bør gjøres så snart som mulig etter krystallene slutte å vokse, som eldre materiale er mer sannsynlig å være delvis tverrbundet, og dermed redusere sin egnethet for bruk i seeding eksperimenter. Dersom det er tvil om hvorvidt det krystallinske materialet som skal høstes er salt eller protein brønnen kan bli visualisert ved hjelp av UV-fluorescens mikroskop eller bildesystem forut for åpning, eller det krystallinske materiale kan bli utsatt for in-situ røntgendiffraksjon analyse i skuffen. Når du bruker de tidligere tilnærming protein krystaller vil fluoresce under UV-bestråling, vil saltkrystaller vises fargeløs.
- Åpne den valgte krystallisering skuffen godt. For 96-brønnen sitter slipp skuffer skar gjennom øvre plast forseglingssjikt rundt den valgte vel USIng en skalpell blad. For 24-brønns hengende slipp skuffer fjerne dekkglass ved hjelp av en pinsett. Snu dekkglass og legg den på et stabilt ren overflate. Fjern 50 ul av reservoarløsningen og overføre denne væsken til mikrosentrifugerør innehold kimperlen sikre at røret forblir på is hele.
- Grundig knuse krystallene i brønndelen (96-brønns brett) eller dekkglass (24-brønns brett) dråper, ved hjelp av glass probe utarbeidet i avsnitt 2.1, se på resultatene under et mikroskop. Små krystaller kan ta flere minutter å knuse grundig. I dette trinnet kan experimenter å kontrollere at krystallene er lett å knuse, og er derfor ikke tverrbundet, og også at de ikke er saltkrystaller. Saltkrystaller produsere en særegen klikk som kan bli hørt og følte når de blir knust. Dersom krystallene er tøft og vanskelig å knuse prøve å få tak i og bruke ferskere materiale.
- Fjern 5 pl av reservoarløsningen fra kimperlen røret og transfer til det tilsvarende sub-brønn (sittende dråpe eksperiment) eller dekkglass (hengende dråpe eksperiment) inneholdende det krystallinske materialet som skal høstes. Pipetter denne væsken opp og ned 5-6 ganger for å resuspendere så mye av de sub-brønn eller dekk innholdet som mulig. Retursuspensjonen til kimperlen røret og gjenta dette trinnet to ganger til, slik at så mye krystallinsk materiale blir høstet som mulig.
- Vortex kimperlen i to minutter, stoppe hvert 30 sek for å avkjøle røret på is.
- Gjør en fortynningsserie, fortynne frøet lager i reservoarløsningen med en faktor på 4 til 10 ved hvert trinn. Vanligvis vil for mange krystaller oppnås ved bruk av en ufortynnet frø lager, så bruke de fortynnede frø stocks å styre antallet av krystaller pr brønn. I den første runden av RMM, er det viktig ikke å fortynne frøet stock løsning, siden en større konsentrasjon av frø på flere krystallisering treff vil bli erholdt.
- Hvis det ikke skal brukes umiddelen gang, overfører frøet lagersuspensjon og den fortynnede frø lager til en -20 ° C eller -80 ° C fryseren for lagring. For å forhindre gjentatte fryse-tine sykluser, noe som kan redusere effekten av avlsmateriale, lagre dette materialet i små volum alikvoter, dvs. 10-20 mL. Når frosset, kan frø bestandene holdes på ubestemt tid inntil nødvendig.
Tre. Etablering av Krystallisering Skåler
- Avhengig av tilgjengeligheten av krystallisering fasiliteter og preferansene til eksperimentator, kan RMM krystallisering screening utføres ved hjelp av enten 24-brønners skuffer ansette den hengende dråpe dampdiffusjon metode, eller 96-brønns skuffer ved å bruke sittende dråpe dampdiffusjon metode. Krystallisering skuffer for RMM kan etableres enten for hånd, ved hjelp av en væske håndtering robotbeholderen, eller en kombinasjon av de to.
- En typisk RMM eksperiment satt opp for hånd, vil omfatte, 1,0 pl protein-løsning, 1,0 ul krystallisering tilstand, og0,5 mL avlsmateriale. En typisk eksperiment satt opp ved hjelp av en krystallisering robot vil bestå, 0,3 mL protein løsning, 0,2 mL krystallisering tilstand, og 0,1 mL avlsmateriale.
- For å utføre RMM screening i 24-brønns hengende dråpe skuffer, for det første, ved hjelp av en manuell pipette, overføres 300 ul av hver tilstand fra en 96-brønns tilstand krystallisering skjermen i 10 ml enkelt rør format i hver brønn av 4 x 24-brønners pregreased krystallisering skuffer.
- Overføring 1 pl av hver krystallisering tilstand fra hver 300 pl reservoaret på overflaten av en tilsvarende plast-dekkglass som både fremre og bakre beskyttende dekkpapir har blitt fjernet.
- Til en ul av hver krystallisering tilstand legge en mL av proteinløsningen, etterfulgt av 0,5 mL av krystall frø lager. Invert hver dekkglass, slik at slipp av væske nedad vendte og posisjon over det aktuelle godt.
- Trykk ned på dekkglass, komprimere tetterng fett og danner en sikker forsegling. Når alle 96 dråper er etablert, bør magasinet overføres til en inkubator eller konstant romtemperatur, vanligvis i området 4-18 ° C for lagring.
- For å utføre RMM screening i 96-brønners sitter slipp skuffer for det første å overføre 20-50 pl av hver tilstand fra en 96-brønns tilstand krystallisering skjermen i dyp brønn blokkformat i hver tilsvarende brønn av krystallisering skuffen. Denne overføringen trinnet kan utføres enten ved hjelp av en robot krystallisering, eller ved manuell overføring ved bruk av en 8-kanal pipette.
- Transfer reservoar, protein og avlsmateriale løsninger på dråpene for hånd eller med en robot ved hjelp av volumene beskrevet i 3.1. Noen kommersielt tilgjengelige krystallisering roboter ikke kontakt dispensere, og utfører frø lageroverføring ved hjelp av et slikt system kan resultere i blokkering av doserings tips eller tilknyttet slange. Rekkefølgen på utlevering er variabel: noen roboter dispensere alle løsninger samtidig. Hvisdette ikke er mulig, dispensere protein først, deretter reservoaret, så frø lager.
- Hvis en kontakt utleverings roboten ikke er tilgjengelig overføre frøene ved hjelp av en lav volumglassprøyte utstyrt med en butt nål. Skyll nålen ved å føre den gjennom reservoaret løsningen deretter dispensere frøet lager i hver dråpe.
- Tett skuffen ved hjelp av et gjennomsiktig forseglingssjikt og overføre til en inkubator eller konstant temperatur rom for lagring.
4. Inspeksjon av Krystallisering Skåler
- Visualisere alle krystallisering eksperimenter ved hjelp av enten en kikkert mikroskop eller en krystall imaging system. Førstnevnte gir generelt brukeren bedre kontroll over vis dybde, og graden av forstørrelse enn det sistnevnte, men er mer tidkrevende.
- Inspiser hver sub-well/coverslip i rekkefølge og ta opp noen bevis for krystalldannelse. Eksperimenter skal inspiseres en gang hver 24 timer til 5 dager etter etablering ogn deretter en gang hver 7. dag for opp til fire uker.
- Multiple sykluser av RMM er ofte nødvendig før optimal diffraksjon kvalitet krystallene blir produsert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(A) Eksempel på en RMM eksperiment
For å demonstrere effektiviteten av RMM screening vi anvendt denne metode til krystallisering av hen eggehvite lysozym (HEWL) og bovin lever katalase (BLC). Begge disse enzymene er utpreget krystalliserbar og er strukturelt godt karakterisert målene 15, 16. Som sådan både gi gode test fag som skal illustrere den forbedrede krystallisering suksessrate oppnåelig med RMM. Krystallisering eksperimenter ble etablert i 96-vel sittende dråpe skuffen format ved hjelp av væskebehandlings robotikk. Løsninger av HEWL og BLC ble fremstilt ved oppløsning av lyofiliserte pulvere av hver av 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5, til sluttkonsentrasjoner på 100 mg / ml og 20 mg / ml. For hvert protein tre 96-tilstand krystallisering skjermene ble brukt; JCSG, PACT og Morpheus. Krystallisering screening uten microseeding ble utført ved hjelp av reservoarvolum 50 ul, og 2 plsitter dråper bestående 1 mL av protein løsning og en ul av reservoaret løsning. De seks skuffer ble lagret i et rom med konstant temperatur ved 18 ° C og inspisert hver dag ved hjelp av et binokulært mikroskop. Noen bevis for krystallvekst ble registrert. Etter fem dager i en enkelt tilstand fra hver skuff som ble funnet å understøtte veksten av krystallinsk materiale som ble valgt og benyttet for seed lager generasjon. RMM screening ble utført som for ikke-RMM screening, med unntak av at 2,5 ul satt drops omfattende en pl protein-løsning, 1 pl av reservoar-løsning og 0,5 pl av frø stock ble anvendt. Alle seks RMM skuffer ble overført til en konstant romtemperatur på 18 ° C og daglig tilsyn ved hjelp av en kikkert mikroskop. Etter fem dager ble RMM skuffer av begge proteiner ble inspisert og antallet dråper med krystaller ble registrert. Figur 1 oppsummerer resultatene fra dette eksperiment og gir kvantitativ analyse. For HEWL en 4 til 10 gangerøke i krystallisering suksessrate, sammenlignet med ikke tilsådde skuffer, ble observert når RMM ble anbrakt på dette protein. Spesielt for BLC bare en enkelt tilstand i Morpheus skjermen ble funnet å gi krystaller, sammenlignet med 55 tilstander som er identifisert etter bruk av RMM. Videre var det et tre og syv ganger økning i suksessrate i BLC krystallisering ved hjelp JCSG og PACT skjermer hhv. I alle tilfeller og uansett krystallisering skjermen brukes RMM filtrering ga et betydelig større antall krystaller enn ikke-RMM screening. Repetisjon av RMM screening eksperimenter er beskrevet ved hjelp av en 1:100 utvannet frø ga betydelig færre treff enn når ufortynnet avlsmateriale ble brukt, forsterker kravet om å bruke ufortynnet aksjer når du utfører den innledende runden av RMM eksperimenter. For begge proteiner var det liten tilsynelatende variasjon i krystallkvalitet, som bedømt ved størrelse, morfologi, og dobbeltbrytningen. Sammenlignende vurdering av forskjelfraksjon krystallenes kvalitet som genereres ved hjelp av RMM i motsetning til konvensjonelle screening-metode går utenfor rammen av denne studien, men initial foreløpige diffraksjon analyse ved hjelp synkrotron-stråling av en undergruppe av krystaller av begge proteiner isolert fra RMM og ikke-RMM skjermene er angitt der for å være liten variasjon i diffraksjon kvalitet, som bedømt basert på oppløsning grenseverdi og punktprofil.
(B) Eksempler på optimalisere antallet av krystaller pr dråpe
Microseeding teknikkene regelmessig gir regnbyger av små krystaller. Det er derfor ofte nødvendig å fortynne frøet lager for å redusere graden av kjernedannelse. Videre kan det noen ganger være umulig å vokse krystaller i hit-forhold som ble funnet av RMM ved såing ikke benyttes 5. Det slike tilfeller er det ofte nyttig å bruke "klassiske" microseeding, hvor flere dråper er satt opp ved hjelp av den samme reservoar løsning med ulike fortynninger av et frø lager. Denne cen systematisk gjøres i flere lede forhold på en enkel plate ved hjelp av en "kombinatorisk"-tilnærming (Paul Reichert, Merck Research Laboratories, personlig kommunikasjon), som vist i figur 2.. Her en eller flere treff løsninger (H1 - H6) er fordelt i kolonnene til en krystallisering plate, mens en annen fortynning av et frø lager (S1 - S9) er lagt til de dråper av hver rad. Derfor er enhver kombinasjon av hit-løsning og fortynnet avlsmateriale er testet på en enkelt plate, og riktig nivå av fortynning og noen trender stede enkelt kan identifiseres.
Vi brukte denne kombi microseeding tilnærming til tre modell proteiner, xylanase, thaumatin og thermolysin. Hvert protein ble testet med en krystallisering tilstand som tidligere hadde blitt vist å gi ingen krystaller i fravær av såing, men konsekvent ga krystaller ved såing av ble brukt. Krystallisasjonstemperaturen betingelser som benyttes for xylanase, thaumatin og thermolysin er oppført i Tabell 2. Fire til seks forholdene ble etablert for hvert protein med enten to eller tre repetisjoner av hver protein / tilstand / avlsmateriale kombinasjon som vist. Drops omfattet 0,3 pl protein, 0.29 mL reservoarløsningen, og 10 nl frø lager. Alle skuffer ble etablert ved hjelp av en væskehåndtering krystallisering robot. Ryddig avlsmateriale og seks fortynninger av disse ble satt opp for hvert protein. Andre eksperimentelle detaljer har tidligere 12 blitt rapportert. Det gjennomsnittlige antall av krystaller som oppnås per dråpe er plottet mot fortynning av sæden lager i figur 3.. Disse dataene viser at antall krystaller følger en tilnærmet lineær sammenheng med antallet frø tilsatt. For de tre proteiner som ble testet, var 01:10 til 01:10 -3 -6 fortynninger nødvendig for å oppnå 1-10 krystaller pr dråpe.
Tabell 1. Liste over materialer.
| Krystallisering cocktail | Antall dråper etablerte per brett | |
| Xylanase (36 mg / ml) | 2 M ammoniumsulfat, 0,1 M Tris-HCl pH 8.5 | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 30% (w / v) PEG 4000, 0,2 M natriumacetat, 0,1 M Tris-HCl pH 8.5 | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 4 M natrium-formiat | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 3,5 M ammoniumsulfat, 250 mM natriumklorid, 50 mM natrium / kaliumfosfat pH 7.5 | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 1,5 M kaliumfosfat pH 7.0 | 3 |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 30% (w / v) PEG 4000, 0,2 M ammoniumacetat, 0,1 M natriumcitrat pH 5,6 | 2 |
| 20% (w / v) PEG 4000, 20% (v / v) 2-propanol, 0,1 M natriumcitrat pH 5,6 | 2 | |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 30 (% w / v) PEG 8000, 0,2 M ammoniumsulfat, 0,1 M natrium kakodylat, pH 6,5 | 2 |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 20 (% w / v) PEG 8000, 0,2 M magnesium-acetat, 0,1 M natrium kakodylat, pH 6,5 | 2 |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 2 M ammoniumsulfat, 0,1 M Tris-HCl pH 8.5 | 2 |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 1,5 M litium sulfat, 100 mMHEPES pH 7,5 | 2 |
| Thermolysin (15 mg / ml) | 20,0% (w / v) PEG 6000, 100 mM sitronsyre pH 5.0 | 3 |
| Thermolysin (15 mg / ml) | 1,26 M ammoniumsulfat, 200 mM litiumsulfat, 100 mM Tris-HCl pH 8.5 | 3 |
| Thermolysin (15 mg / ml) | 10% (v / v)MPD, 100 mM bicin pH 9,0 | 3 |
| Thermolysin (15 mg / ml) | 800 mM succinsyre pH 7,0 | 3 |
Tabell 2. Protein-løsninger og krystallisering betingelser som benyttes i kombi microseeding eksperimentet.
Figur 1. (A) sammenligning av RMM og ikke-RMM krystallisering screeningeksperimenter. Forhold som støtter krystallvekst er i grønt, forholdene ikke støtter krystallvekst er i grått. Forhold som er valgt for bruk i avlsmateriale generasjon er i rosa. Krystallisering skjermer er merket som følger (i) høne eggehvite lysozym, JCSG, ikke-RMM, (ii) høne eggehvite lysozym, JCSG, RMM, (iii) høne eggehvite lysozym, PAKTEN, ikke-RMM, (iv) høne f.eks g white lysozym, pakt, RMM, (v) hen eggehvite lysozym, Morpheus, ikke-RMM, (vi) hen eggehvite lysozym, Morpheus, RMM, (vii) bovine lever katalase, JCSG, ikke-RMM, (viii) storfelever katalase, JCSG, RMM, (ix) storfelever katalase, PAKTEN, ikke-RMM, (x) storfe lever katalase, PAKTEN, RMM, (xi) storfe lever katalase, Morpheus, ikke-RMM, (xii) storfelever katalase, Morpheus, RMM. (B) komparativ analyse av krystallisering suksessrate ved hjelp av RMM og ikke-RMM krystallisering screening. For ikke-RMM screening antall krystallisering forhold identifisert som støtter krystallvekst av enten HEWL eller BLC er vist i blått, for RMM screening antall krystallisering forhold identifisert som støtter krystallvekst av enten HEWL eller BLC er vist i rødt. Opplysningene er basert på inspeksjon av krystallisering skuffer fem dager etter etablering.
2.jpg "/>
Figur 2. Fordeling av krystallisering forhold og utvannet avlsmateriale suspensjoner for et enkelt protein i et eksempel kombi microseeding eksperiment. Uthevede kolonner H1-H6 inneholde ulike krystallisering forholdene støtter målprotein krystallvekst. Uthevede rader S1-S7 inneholde ulike fortynninger av en målprotein avlsmateriale suspensjon.
Figur 3. Sammenheng mellom avlsmateriale fortynning og gjennomsnittlig antall krystaller innhentet per dråpe i et kombinato microseeding eksperiment. De tre proteiner som ble brukt var xylanase, thaumatin og thermolysin. Drops ble etablert i en 96-brønns plate ved hjelp av en MRC væskehåndtering robot, og består av 0,3 pl protein, 0.29 mL reservoarløsningen, og 10 nl av frisk seed lager. Dataene presentert er basert på kontroll av krystallisering magasinene 5 dager etter etablering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen har vi beskrevet en generell metode for RMM protein krystallisering screening. Vi har vist ved å bruke to test proteinene en signifikant forbedring i krystallisering suksessrate ved bruk av denne metoden. Diffraksjon analyse ved hjelp av synkrotronstråling av en undergruppe av krystaller generert ved hjelp av RMM og ikke-RMM metoder avslørte lite variasjon i diffraksjon kvalitet mellom krystaller vokst med begge metoder, selv om tidligere forfattere har rapportert at god kvalitet krystaller er mer sannsynlig å vokse i RMM eksperimenter 11, 13. HEWL og BLC kan ha gitt atypiske resultater, fordi de er usedvanlig lett å krystallisere. Vi viser også viktigheten av å optimalisere konsentrasjonen av krystall frø bestander som brukes i RMM eksperimenter, og vise hvordan denne kan justeres ved fortynning for å sikre at et optimalt antall diffraksjon kvalitet krystallene blir produsert.
RMM er en enkel, høy gjennomstrømning, høytskalerbar fremgangsmåte som kan benyttes for å komplettere tradisjonelle filtreringsmetoder. Eksperimenter kan settes opp for hånd eller ved robot, i 96-brønn eller 24-brønns skuffer, og i hengende eller sittende slipp formater. Den største begrensningen av RMM er at den er avhengig av å skaffe en eller annen form for krystallinsk materiale av et målprotein (eller fra et homologt protein) for å generere et frø lager i det første eksempel. Det bemerkes imidlertid at høykvalitets krystallinsk materiale ikke er nødvendig, ja forfatterne har med hell benyttet mikrokrystaller og amorfe bunnfall for å gjøre frø bestander. Bruken av RMM screening er ikke begrenset til vekst av krystaller av fremmedproteiner. For eksempel er RMM vel egnet for dyrking av krystaller av selenomethione eller selenocysteine substituerte varianter. I slike tilfeller, kan krystaller av det opprinnelige protein bli brukt til å lage frøet lager. Selv om alternativ krystall nukleasjon protokoller har blitt dokumentert 1,4, ingen er like gjeldende for så vidt arange av proteiner som RMM.
Etter RMM et kombinatorisk microseeding tilnærmingen kan brukes for å optimalisere graden av såing for å produsere krystaller for datainnsamling. Dette er spesielt nyttig for ligand-avslapnings eksperimenter der ofte kreves et stort antall krystaller. Ved hjelp av denne metode en hel krystallisering skjermen kan det raskt etablert ved hjelp microseeding i kombinasjon med en fortynnet frø lager, med hver brønn gir et relativt lite antall av krystaller.
I konklusjonen oppfordrer vi alle som er engasjert i macromolecular krystallisering å gjøre RMM en del av sin rutine arbeidsflyt i alle tilfeller der diffracting krystaller ikke er hentet direkte fra deres opprinnelige skjermer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert delvis av BBSRC (BB/1006478/1). PRR er mottaker av en Royal Society University Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Ph–nix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
- Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- Babnigg, G., Joachimiak, A. Predicting protein crystallization propensity from protein sequence. J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).
- Bergfors, T.
- Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).
- Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).
- Bergfors, T. Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories. Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).
- Xu, L., Butcher, S. J., et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1. J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).
- Rangarajan, E. S., Izard, T. Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding. Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).
- Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).
- D'Arcy, A., Villard, F., et al. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).
- Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
- Obmolova, G., Malia, T. J., et al. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).
- Villasenor, A. G., Wong, A., et al. Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).
- Strynadka, N. C., James, M. N. Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. EXS. 75, 185-222 (1996).
- Diaz, A., Loewen, P. C., et al. Thirty years of heme catalases structural biology. Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).
