Summary
Hier beschrijven we een algemene methode voor willekeurige microseed matrix screening. Deze techniek is een significante toename van de slaagkans van eiwitkristallisatie screeningsexperimenten, de behoefte aan optimalisatie en een betrouwbare aanvoer van kristallen voor gegevensverzameling en ligand-inweken experimenten.
Abstract
Random microseed matrix screening (RMM) is een proteïne kristallisatie techniek waarbij zaad kristallen worden toegevoegd aan willekeurige schermen. Door het verhogen van de kans dat kristallen groeien in de metastabiele zone van een proteïne fasediagram, worden extra kristallisatie leidt vaak verkregen, de kwaliteit van de geproduceerde kristallen worden verhoogd, en een goede kristaltoevoer voor gegevensverzameling en weken experimenten voorzien. Hier beschrijven we een algemene werkwijze voor RMM die kunnen worden toegepast op zowel zittende druppel of opknoping druppel dampdiffusie experimenten, met de hand of met vloeistofverwerking robotica, in 96-well of 24-wells formaat opgesteld.
Introduction
Vanaf de eerste toepassing ervan door Perutz, Kendrew en collega's bij het bepalen van de structuur van hemoglobine en myoglobine, aan de moderne high throughput geautomatiseerde pijpleidingen van de structurele genomics consortia heeft macromoleculaire X-ray kristallografie ons bood een ongekende structurele kijkje in het eiwit wereld . Deze techniek blijft de meest toepasselijke experimentele methode die de directe visualisatie van eiwitstructuur toelaat op atomaire, of in de buurt van atomaire resolutie (dwz in de 1-3 een Range). Voorwaarde voor röntgendiffractie worden toegepast op een eiwit dat eerst moet worden gekristalliseerd, en het is deze fase van het proces dat zich de grootste snelheidsbeperkende stap in structuurbepaling door diffractiemethodes 1, 2 blijft. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van het proces van proteïne kristallisatie, en belangrijke verbeteringen in de kwaliteit en beschikbaarheid van kristallisatie-schermen,laden en aanverwante technologieën blijft het onmogelijk om de kans op succes kristallisatie 3 betrouwbaar voorspellen. Biochemische en biofysische methoden kunnen worden toegepast om te beoordelen of een eiwit van interesse displays gunstige eigenschappen voor kristalkernvorming en groei, dus is het goed gevouwen, homogene, monodispers, enz., maar deze inzichten op geen enkele manier zorgen voor een definitieve voorspeller van kristallisatie geneigdheid.
Kiemen lang beweerd een haalbare werkwijze voor het verbeteren van het aantal, de grootte en kwaliteit van de bestaande kristallen of kristallijn materiaal 4-7 zijn. Deze benadering is gebaseerd op het uitgangspunt dat een voorwaarde dat nucleatie ondersteunt niet optimaal voor verdere kristalgroei en vice versa kunnen worden. Door de overdracht van een kern materiaal van de ene toestand naar de andere, kan men proberen om effectief te ontkoppelen deze processen, waardoor de toegang tot nieuwe, nog onontgonnen kristallisatie ruimte,en als gevolg een verbetering van de slaagkans van een screening experiment. Gevestigde methoden zijn beschreven voor (i) macroseeding, de overdracht van een enkel kristal in zijn geheel aan een toestand naar de andere 8, (ii) strook zaaien, de overdracht van kernen materiaal, algemeen verkregen door toepassing van gerichte druk met bijvoorbeeld een kat snorhaar op het oppervlak van een bestaande kristal, gevolgd door achtereenvolgende passage van de snorhaar door een nieuwe kristallisatie druppel 9, en (iii) "klassieke" microseeding, de overdracht van kristal "zaden", gegenereerd door oogsten gemalen kristallen (of kristallijn materiaal), in soortgelijke omstandigheden dat de zaden 10 opgeleverd. Met name alle drie van deze methoden zijn tijdrovend en slecht schaalbaar, zeker in vergelijking met wat haalbaar moderne vloeistofverwerking kristallisatie robotica. Deze factoren hebben bijgedragen, op een bepaald niveau althans de perceptie dat zaading is een methode om alleen te bezoeken wanneer andere methoden hebben gefaald vruchten af te werpen.
Random matrix microseeding (RMM) is een recente methodologische innovatie die de voordelen van de traditionele microseeding met die van high throughput screening en schaalbaarheid 11-13 combineert. Deze aanpak berust op het genereren van een uitgangsmateriaal, uit kernhoudende kristallijn materiaal, dat kan worden verdeeld in / op elke sub-well/coverslip bij een standaard 96-toestand kristallisatie scherm. Deze methode is van toepassing op zowel zittend of opknoping druppel dampdiffusie experimenten, met de hand of met behulp van liquid handling robotica, in 24-well of 96-wells formaat vastgesteld. RMM is experimenteel aangetoond aanzienlijk te verhogen kristallisatie succes en produceren kristallen groter diffractie kwaliteit en kwantiteit 11, 13, 14, en vormt een innovatief hulpmiddel in het arsenaal van de kristallografen "benaderingen in de oNgoing streven naar kristallisatie succes. Hier beschrijven we een algemene werkwijze voor RMM en zorgen voorbeeldgegevens illustreert de effectiviteit van deze techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Strategische overwegingen
- De keuze van zaad kristallen voor microseeding experimenten zal variëren afhankelijk van het doel van het experiment. Aan het begin van een project is het nuttig om verschillende kristallisatie hits die alternatieve aanknopingspunten kan bieden voor optimalisatie kristal te vinden. RMM reduceert de noodzaak van kristal optimalisatie omdat goede kwaliteit kristallen hebben meer kans om te groeien in de metastabiele zone van het fasediagram, dat wil zeggen in het gebied waar volgende verstoring of nucleatie keert het systeem terug naar evenwicht. We stellen daarom middels RMM routinematig zodra de eerste kristallen verkregen (of, nauwkeuriger, zodra de eerste kristallen stoppen met groeien).
- Voor de eerste ronde van RMM moet een uitgangsmateriaal worden met zoveel kristallijn materiaal mogelijk. Als slechts een putje beschikbaar die kristallen bevat, of indien de kristallen klein zijn, kan het nuttig zijn om meerdere herhalingen van deoriginele hit (zonder enten) de levering van kristallen verhogen. Indien echter meerdere treffers worden verkregen, kunnen entkristallen worden verzameld van diverse aandoeningen en samen gemengd.
- Fasescheiding te voorkomen, moet kristallen gekweekt in high-zout omstandigheden afzonderlijk worden geoogst van kristallen gegroeid in high-PEG omstandigheden. Als kristallen uit verschillende bronnen worden gemengd, moet een reservoir oplossing die minder waarschijnlijk zoutkristallen geven worden geselecteerd zaaizaad suspensie. Zo moeten hoge concentraties fosfaat, sulfaat, calcium en magnesium worden vermeden.
- Later in een project kan het belangrijk zijn om te zoeken naar kristallen met verschillende eenheidscellen ter verbetering diffractie, gekoppelde kristallen voorkomen en kristallen die geschikt zijn voor binding liganden verkrijgen. In dit stadium alleen de meest geschikte kristallen (bijv. die het best breken) worden gebruikt om het uitgangsmateriaal te maken. Soms herhaalde rondes van microseeding nodig zijn, waar alleen de "beste"Kristallen worden gebruikt om het uitgangsmateriaal te maken voor de volgende ronde. Indien mogelijk, een" moet neutraal "neerslagmiddel zoals PEG 3000 worden gebruikt om de kiemkristallen in slaapstand naar nieuwe kristal contacten stimuleren en complexen die onstabiel in hoge kristalliseren -zoutoplossingen 12.
- Klassieke microseeding experimenten, waar een enkele kristallisatie conditie wordt toegepast, zijn vaak nuttig na de identificatie van een veelbelovende conditie en tijdens verdere optimalisatie. Het is vaak noodzakelijk om het uitgangsmateriaal te verdunnen om het gewenste aantal kristallen per omlaag halen. Een "combinatorische" microseeding experiment (waar een reeks zaadvoorraden van toenemende verdunning worden toegevoegd aan een kristallisatie voorwaarde) is een snelle methode voor het vinden van de optimale verdunning van het uitgangsmateriaal. Deze benadering wordt hieronder beschreven.
2. Voorbereiding van het Zaad Stock
- Maak een ronde glazen sonde uit een glas Pasteur pipet met een bunsenvlam.
- Verhit de pipet in de buurt van het midden tot het zacht wordt, dan snel uit het vuur verwijderen en trek hem door elkaar te trekken de uiteinden. Streef ernaar de glazen tot een diameter van minder dan 0,25 mm te trekken.
- Breek het glas bij het punt waar het ongeveer 0,25 mm en kort dompelen de gebroken uiteinde in de vlam. Herhaal dit tot een halve bol van glas met een diameter van ~ 0,75 mm is gevormd op het einde. Deze sonde is handig voor het breken kristallijn materiaal als het op de juiste wijze is gedimensioneerd voor het slaan van vaste voorwerpen op de 0,01-1,0 mm schaal en het niet het plastic oppervlak van een kristallisatie tray sub-goed of dekglaasje beschadigen. Grotere sondes (~ 1,0 mm) kunnen kleine kristallen effectiever verpletteren omdat de kristallen worden gevangen tussen het glas en plastic.
- Plaats een 1,5 ml microcentrifugebuis met een Seed Bead op ijs.
- Inspecteer een vooraf vastgesteld kristallisatie lade met behulp van een binoculair microscoop of kristal imaging-systeem en selecteer een of meer appropriate putten uit de lade van waaruit kristallijn materiaal voor uitgangsmateriaal generatie oogsten. Elk materiaal kan worden gebruikt, waaronder fijne naalden, sferulieten, microkristallen en onregelmatige, slecht gevormde kristallen. Het uitgangsmateriaal moet zo snel mogelijk na het stoppen met groeien kristallen worden gemaakt, aangezien oudere materiaal is waarschijnlijk gedeeltelijk verknoopt, waardoor de geschiktheid ervan voor gebruik bij het zaaien proeven verminderen. Bij twijfel of het kristallijne materiaal te oogsten is zout of eiwit de put kan worden gevisualiseerd met UV-fluorescentie microscoop of beeldvormend systeem voor het openen of het kristallijne materiaal kan worden onderworpen aan in situ röntgendiffractie analyse in de lade. Bij gebruik van de vroegere aanpak eiwitkristallen zullen fluoresceren onder UV-bestraling, zal zoutkristallen verschijnen kleurloos.
- Open de geselecteerde kristallisatie lade goed. Voor de 96-well zitten druppel trays, foutje in de bovenste plastic verzegeling vel rond de put geselecteerde using een scalpel. Voor de 24-well opknoping druppel Verwijder laden het dekglaasje met behulp van een pincet. Keren de dekglaasje en plaats het op een stabiele schoon oppervlak. Verwijder 50 pl van de oplossing reservoir en breng deze vloeistof aan de microcentrifugebuis met het zaad Bead zodat de buis blijft op ijs in.
- De kristallen grondig verpletteren in de subwell (96-well tray) of dekglaasje (24-well tray) daalt, met behulp van de glazen sonde opgesteld in paragraaf 2.1, het bekijken van de resultaten onder een microscoop. Kleine kristallen kan enkele minuten duren om grondig te verpletteren. Deze stap kan de experimentator om te controleren of de kristallen gemakkelijk worden fijngemaakt worden derhalve niet verknoopt, en dat zij niet zoutkristallen. Zoutkristallen produceren een onderscheidend klik die kunnen worden gehoord en gevoeld wanneer ze worden geplet. Als de kristallen zijn taai en moeilijk om te proberen te verpletteren te verkrijgen en te gebruiken frisser materiaal.
- Verwijder 5 ul van de oplossing van het reservoir Seed Bead buis en transfer om het equivalent sub-goed (zittend druppel experiment), of dekglaasje (opknoping druppel experiment) dat het kristallijne materiaal te worden geoogst. Pipet deze vloeistof op en neer 5-6 keer om zoveel mogelijk van de sub-goed of dekglaasje inhoud mogelijk opnieuw in suspensie. De terugkeer van de schorsing van de Seed Bead buis en twee keer herhaal deze stap, ervoor te zorgen dat zo veel kristallijn materiaal wordt geoogst mogelijk.
- Vortex de Seed Bead voor twee minuten, stoppen elke 30 seconden aan de buis op ijs te koelen.
- Voeg een verdunningsreeks, verdunnen van de uitgangsmateriaal in reservoiroplossing met een factor 4 tot 10 in elk stadium. Meestal zal te veel kristallen zijn verkregen bij gebruik van een onverdund uitgangsmateriaal, dus gebruik het verdunde zaaivoorraden het aantal kristallen per putje controleren. In de eerste ronde van RMM, is het belangrijk de zaad voorraadoplossing te verdunnen, aangezien hoe groter de concentratie van de zaden meer kristallisatie bezoeken zullen worden verkregen.
- Als het niet wordt gebruikt onmiddellijklijk, de overdracht van het zaad voorraad schorsing en de verdunde uitgangsmateriaal een -20 ° C of -80 ° C vriezer voor opslag. Voor herhaalde vries-dooi cycli te voorkomen die de werkzaamheid van het uitgangsmateriaal kan verminderen, dit materiaal op in klein volume fracties, namelijk 10-20 pl. Eenmaal bevroren, kan zaadvoorraden onbeperkt houdbaar totdat het nodig is.
3. Oprichting van Kristallisatie laden
- Afhankelijk van de beschikbaarheid van kristallisatie faciliteiten en de voorkeuren van de experimentator, kan RMM kristallisatie screening worden uitgevoerd met behulp van 24-wells trays in dienst van de opknoping diffusie daling damp methode, of 96-well laden met behulp van de zittende druppel dampdiffusie methode. Kristallisatie bakken voor RMM kan ofwel worden vastgesteld door de hand met vloeistofverwerking apotheekrobot, of een combinatie van beide.
- Een typische RMM experiment opgezet met de hand zal bestaan, 1,0 ul eiwit-oplossing, 1,0 ul kristallisatie staat, en0,5 pl uitgangsmateriaal. Een typisch experiment ingesteld met behulp van een kristallisatie-robot zal bestaan, 0,3 ul eiwit-oplossing, 0,2 ul kristallisatie conditie, en 0,1 pl uitgangsmateriaal.
- Om RMM screening uitvoeren in 24 putjes opknoping druppel laden enerzijds middels een manuele pipet 300 pi van elke aandoening een 96 putjes toestand kristallisatie scherm 10 ml enkele buis formaat in elk putje van 4 x 24 putjes gesmeerde kristallisatie trays.
- Breng 1 pl van elk kristallisatie toestand van elk 300 pi reservoir op het oppervlak van een overeenkomstige plastic dekglaasje vertrekpunt voor en achter beschermlaag stroken verwijderd.
- De 1 pi van elke kristallisatie aandoening voeg 1 pl eiwitoplossing gevolgd door 0,5 pi kristal uitgangsmateriaal. Omkeren elke dekglaasje zodanig dat de druppel vloeistof naar beneden is gericht en positie boven de juiste goed.
- Druk beneden op het dekglaasje, comprimeren de sealing vet en het vormen van een veilige afdichting. Zodra alle 96 druppels worden ingesteld, is de lade overgebracht naar een incubator of kamer met constante temperatuur, gewoonlijk in het bereik 4-18 ° C voor opslag.
- Om RMM screening uitvoeren in 96-well zitten druppel laden eerst overdragen 20-50 pi van elke toestand van een 96-well voorwaarde kristallisatie scherm in diepe put blokformaat in elk overeenkomende well van de kristallisatie lade. Deze overdracht stap kan worden uitgevoerd met behulp van een kristallisatie robot of handmatig overbrengen met een 8-kanaals pipet.
- Transfer reservoir, eiwitten en pootgoed oplossingen voor de druppels met de hand of met een robot met behulp van de volumes beschreven in 3.1. Sommige commercieel verkrijgbaar kristallisatie robots geen contact afzien, en het uitvoeren van het uitgangsmateriaal overdracht met behulp van een dergelijk systeem kan leiden tot verstopping van doseertips of bijbehorende buizen. De volgorde van doseren is variabel: sommige robots afzien alle oplossingen tegelijk. Indiendit niet mogelijk is, afzien eiwit eerst, dan het reservoir, dan zaad voorraad.
- Als een contact afgeven robot is niet beschikbaar overdracht de zaden met een laag volume glazen injectiespuit voorzien van een stompe naald. Spoel de naald door het door het reservoir oplossing dan afzien van het zaad voorraad in elke druppel.
- Dicht de lade met behulp van een verzegelde doorzichtige plaat en over te dragen aan een broedstoof of constante temperatuur ruimte voor opslag.
4. Inspectie van Kristallisatie laden
- Visualiseer alle kristallisatie experimenten met behulp van een binoculair microscoop of een kristal imaging systeem. Eerstgenoemde verschaft algemeen de gebruiker meer controle over uitzicht diepte en de mate van vergroting dan de tweede, maar is tijdrovend.
- Inspecteer elk sub-well/coverslip in volgorde en registratie van alle bewijzen van kristalvorming. Experimenten moeten eenmaal per 24 uur gedurende 5 dagen na vestiging en worden geïnspecteerd den vervolgens eens in de 7 dagen tot 4 weken.
- Meerdere cycli van RMM's zijn vaak nodig voor een optimale diffractie kwaliteit kristallen worden geproduceerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(A) Voorbeeld van een RMM experiment
Om de effectiviteit van RMM screening tonen we aan deze methode toegepast op de kristallisatie van lysozym van kippeneiwit (HEWL) en runderlever catalase (BLC). Beide enzymen zijn bij uitstek kristalliseerbaar en zijn structureel goed gekarakteriseerd doelstellingen 15, 16. Als zodanig bieden beide uitstekende proefpersonen waarmee de verbeterde kristallisatie succes haalbaar met RMM illustreren. Kristallisatie experimenten werden opgericht in 96-well zitten druppel lade formaat met behulp van liquid handling robotica. Oplossingen van HEWL en BLC werden geproduceerd door het oplossen van gevriesdroogde poeders van elk in 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5, tot eindconcentraties van 100 mg / ml en 20 mg / ml. Voor elk eiwit werden gebruikt drie 96-toestand kristallisatie schermen; JCSG, PACT en Morpheus. Kristallisatie zonder microseeding screening werd uitgevoerd met reservoir volumina 50 pl en 2 uiDe zitting druppels bevattende 1 pi eiwitoplossing en 1 pl reservoiroplossing. De zes schalen werden bewaard in een ruimte met constante temperatuur bij 18 ° C en dagelijks geïnspecteerd door een binoculair microscoop. Elk bewijs van kristalgroei werd geregistreerd. Na vijf dagen een toestand van elke plaat die bleek de groei van kristallijn materiaal ondersteunen werd geselecteerd en gebruikt voor uitgangsmateriaal generatie. RMM screening werd uitgevoerd zoals voor niet-RMM screening, behalve dat 2,5 pl zitting druppels bevattende 1 pi eiwitoplossing, 1 ui reservoiroplossing en 0,5 pl uitgangsmateriaal gebruikt. Alle zes RMM trays werden overgebracht naar een ruimte met constante temperatuur bij 18 ° C bewaard en dagelijks gecontroleerd met behulp van een binoculair microscoop. Na vijf dagen de RMMS bakken van beide eiwitten werden onderzocht en het aantal druppels met kristallen opgenomen. Figuur 1 vat de resultaten van dit experiment en levert kwantitatieve analyse. Voor HEWL een 4 tot 10-voudigverhoging kristallisatie slagingspercentage, in vergelijking met niet-gezaaide trays, waargenomen wanneer RMM werd toegepast op dit eiwit. Met name voor BLC slechts een voorwaarde in het scherm Morpheus bleek kristallen werden verkregen in vergelijking met 55 omstandigheden die na gebruik van RMM. Verder was er een 3 en 7-voudige toename in de kans op succes in BLC kristallisatie respectievelijk met behulp JCSG en PACT-schermen. In alle gevallen en ongeacht de kristallisatie scherm leverde gebruikt RMM screening een aanzienlijk groter aantal kristallen dan niet-RMM screening. Herhaling van de RMM screening experimenten beschreven met behulp van een 1:100 verdund zaad leverde beduidend minder hits dan wanneer de onverdunde voorraad zaad werd gebruikt, het versterken van de verplichting om onverdunde voorraden te gebruiken bij het uitvoeren van de eerste ronde van RMM experimenten. Voor beide eiwitten was er weinig duidelijke variatie in kristal kwaliteit, zoals beoordeeld door de grootte, morfologie, en dubbele breking. Vergelijkende evaluatie van het verschilfractie kwaliteit van de gegenereerde gebruik RMM tegenstelling tot conventionele screeningmethoden kristallen buiten het kader van deze studie is echter eerste voorlopige diffractie analyse met behulp van synchrotronstraling uit een subset van kristallen van beide eiwitten geïsoleerd uit RMM en niet-RMM schermen aangegeven daar te weinig variatie in diffractie kwaliteit, zoals beoordeeld op basis van resolutie te beperken en spot profiel.
(B) Voorbeeld van het optimaliseren van het aantal kristallen per druppel
Microseeding technieken geven regelmatig buien van kleine kristallen. Het is derhalve vaak nodig om het uitgangsmateriaal te verdunnen tot het niveau van nucleatie verminderen. Bovendien kan het soms onmogelijk om kristallen groeien hit omstandigheden die werden gevonden door RMM wanneer zaaien niet gebruikt 5. Het dergelijke gevallen is het vaak handig om "klassieke" microseeding, waar enkele druppels zijn opgezet volgens dezelfde reservoir oplossing met verschillende verdunningen van een uitgangsmateriaal te gebruiken. Deze ceen systematisch worden meerdere leidingomstandigheden op een enkele plaat met een "combinatoriële" benadering (Paul Reichert, Merck Research Laboratories, persoonlijke communicatie), zoals getoond in figuur 2. Hier een of meer hit oplossingen (H1 - H6) worden verdeeld in de kolommen van een kristallisatie, terwijl een andere verdunning van een uitgangsmateriaal (S1 - S9) wordt toegevoegd aan de druppels van elke rij. Daarom moet elke combinatie van hit-oplossing en verdund zaad voorraad worden getest op een enkele plaat, en het juiste niveau van verdunning en eventuele trends aanwezig kan gemakkelijk worden geïdentificeerd.
We pasten deze combinatorische microseeding benadering van drie modeleiwitten, xylanase, thaumatine en thermolysine. Elk eiwit werd getest met een kristallisatie aandoening die voorheen aangetoond geen kristallen in de afwezigheid van zaaien geven, maar gaf consistent kristallen bij zaaien gebruikt. De kristallisatieomstandigheden voor xylanase, thaumatine en thermolysin worden in Tabel 2. Vier tot zes voorwaarden zijn opgesteld voor elk eiwit met twee of drie herhalingen van elk eiwit / conditie / uitgangsmateriaal combinatie zoals afgebeeld. Druppels bestaat 0,3 ul eiwit, 0,29 pi reservoir oplossing en 10 nl uitgangsmateriaal. Alle laden werden vastgesteld met behulp van een liquid handling kristallisatie robot. Nette zaad voorraad en zes verdunningen daarvan werden opgezet voor elk eiwit. Andere experimentele gegevens zijn eerder 12 vermeld. Het gemiddelde aantal kristallen verkregen per druppel wordt uitgezet tegen de verdunning van het uitgangsmateriaal in figuur 3. Deze gegevens tonen dat het aantal kristallen volgt een ruwweg lineair verband met het aantal zaden toegevoegd. Voor de drie eiwitten getest, 01:10 tot 01:10 -3 -6 verdunningen moeten 1-10 kristallen per druppel verkrijgen.
Tabel 1. Lijst van materialen.
| Kristallisatie cocktail | Aantal per tray gevestigde druppels | |
| Xylanase (36 mg / ml) | 2 M ammoniumsulfaat, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 30% (w / v) PEG 4000, 0,2 M natriumacetaat, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 4 M natriumformiaat | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 3,5 M ammoniumsulfaat, 250 mM natriumchloride, 50 mM natrium / kaliumfosfaat pH 7,5 | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 1,5 M kaliumfosfaat pH 7,0 | 3 |
| Thaumatine (30 mg / ml) | 30% (w / v) PEG 4000, 0,2 M ammoniumacetaat, 0,1 M natriumcitraat pH 5,6 | 2 |
| 20% (w / v) PEG 4000, 20% (v / v) 2-propanol, 0,1 M natriumcitraat pH 5,6 | 2 | |
| Thaumatine (30 mg / ml) | 30 (% w / v) PEG 8000, 0,2 M ammoniumsulfaat, 0,1 M natriumcacodylaat pH 6,5 | 2 |
| Thaumatine (30 mg / ml) | 20 (% w / v) PEG 8000, 0,2 M magnesiumacetaat, 0,1 M natriumcacodylaat pH 6,5 | 2 |
| Thaumatine (30 mg / ml) | 2 M ammoniumsulfaat, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5 | 2 |
| Thaumatine (30 mg / ml) | 1,5 M lithium-faat, 100 mM HEPES pH 7,5 | 2 |
| Thermolysine (15 mg / ml) | 20.0% (w / v) PEG 6000, 100 mM citroenzuur pH 5,0 | 3 |
| Thermolysine (15 mg / ml) | 1,26 M ammoniumsulfaat, 200 mM lithiumsulfaat, 100 mM Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| Thermolysine (15 mg / ml) | 10% (v / v)MPD, 100 mM bicine pH 9,0 | 3 |
| Thermolysine (15 mg / ml) | 800 mM barnsteenzuur pH 7,0 | 3 |
Tabel 2. Eiwitoplossingen en kristallisatieomstandigheden in de combinatorische microseeding experiment.
Figuur 1. (A) Vergelijking van RMM's en niet-RMM kristallisatie screening experimenten. Voorwaarden ondersteunende kristalgroei zijn in groen, voorwaarden kristalgroei niet ondersteunend zijn in het grijs. Voorwaarden geselecteerd voor gebruik in het uitgangsmateriaal generatie zijn in het roze. Kristallisatie schermen zijn als volgt (i) lysozym van kippeneiwit, JCSG, niet-RMM, (ii) lysozym van kippeneiwit, JCSG, RMM, (iii) lysozym van kippeneiwit, PACT, niet-RMM, (iv) hen gelabeld bv g wit lysozym, PACT, RMM, (v) lysozym van kippeneiwit, Morpheus, niet-RMM, (vi) lysozym van kippeneiwit, Morpheus, RMM, (vii) runderlever catalase, JCSG, niet-RMM, (viii) runderlever catalase, JCSG, RMM, (ix) runderlever catalase, PACT, niet-RMM, (x) runderlever catalase, PACT, RMM, (xi) runderlever catalase, Morpheus, niet-RMM, (xii) runderlever catalase, Morpheus, RMM. (B) Vergelijkende analyse van kristallisatie slagingspercentage met behulp van RMM's en non-RMM kristallisatie screening. Voor niet-RMM screening het aantal kristallisatieomstandigheden geïdentificeerd als ondersteuning van kristalgroei van beide HEWL of BLC verschijnen in blauw, voor RMM screening het aantal kristallisatieomstandigheden geïdentificeerd als ondersteuning van kristalgroei van beide HEWL of BLC zijn in rood weergegeven. De gegevens zijn gebaseerd op de inspectie van kristallisatie trays 5 dagen na vestiging.
2.jpg "/>
Figuur 2. Verdeling van kristallisatie omstandigheden en verdund zaad voorraad ophangingen voor een enkel eiwit in een voorbeeld combinatorische microseeding experiment. Gemarkeerd kolommen H1-H6 bevatten verschillende kristallisatieomstandigheden ondersteunen doelproteïne kristalgroei. Gemarkeerd rijen S1-S7 bevatten verschillende verdunningen van een doelwit eiwit zaad voorraad schorsing.
Figuur 3. Correlatie tussen zaad voorraad verdunning en gemiddeld aantal kristallen verkregen per druppel in een combinatorische microseeding experiment. De drie eiwitten gebruikt werden xylanase, thaumatine en thermolysine. Druppels werden in een 96-well plaat MRC toepassing van vloeistof handlingrobot en omvatten 0,3 pi proteïne, 0,29 pl reservoiroplossing en 10 nl verse seed voorraad. De gepresenteerde gegevens zijn gebaseerd op de inspectie van de kristallisatie trays 5 dagen na vestiging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel hebben we een algemene methode voor RMM eiwitkristallisatie screening beschreven. We hebben aangetoond middels twee testeiwitten een significante verbetering in kristallisatie succes met deze methode. Diffractie analyse met behulp van synchrotronstraling uit een subset van kristallen gegenereerd met behulp RMM en niet-RMM methoden geopenbaard weinig variatie in kwaliteit tussen diffractie kristallen gegroeid bij procedure, vroegere auteurs rapporteerden dat goede kwaliteit kristallen vaker groeien in RMM experimenten 11, 13. HEWL en BLC kunnen atypische resultaten hebben gegeven omdat ze ongewoon gemakkelijk te kristalliseren. We illustreren ook het belang van het optimaliseren van de concentratie van kristal zaadvoorraden gebruikt in RMM experimenten, en laten zien hoe dit kan worden aangepast door verdunning om ervoor te zorgen dat een optimaal aantal diffractie kwaliteit kristallen worden geproduceerd.
RMM is een eenvoudige, high throughput, zeerschaalbare methode die kan worden gebruikt om traditionele screeningsmethoden vullen. Experimenten kan worden ingesteld met de hand of door robot, in 96-well of 24-well trays, en in opknoping of zittend druppel formaten. De belangrijkste beperking van RMM is dat het afhankelijk verkrijgen andere vorm van kristallijn materiaal van een doeleiwit (of een homoloog eiwit) om een uitgangsmateriaal in eerste instantie genereren. Er zij evenwel op gewezen, dat hoogwaardig kristallijn materiaal niet nodig, inderdaad het auteurs succes gebruikt microkristallen en amorf precipitaat zaaivoorraden maken. Het gebruik van RMM screening is niet beperkt tot de groei van kristallen van natieve eiwitten. Zo is RMM goed geschikt voor het kweken van kristallen selenomethione of selenocysteïne gesubstitueerde varianten. In dergelijke gevallen kunnen kristallen van het natieve eiwit worden gebruikt om het uitgangsmateriaal te maken. Hoewel alternatieve kristalnucleatie protocollen zijn gedocumenteerd 1,4, geen daarvan is zo van toepassing op zo breed arange van eiwitten als RMM.
Na RMM een combinatorische microseeding benadering kan worden gebruikt om het niveau van zaaien optimaliseren om kristallen te produceren voor gegevensverzameling. Dit is vooral nuttig voor ligand-inweken experimenten waarbij een groot aantal kristallen dag zijn. Met deze aanpak een volledige kristallisatie scherm kan snel worden vastgesteld met behulp van microseeding in combinatie met een verdunde uitgangsmateriaal, met elk putje hetgeen tot een relatief klein aantal kristallen.
Tot slot moedigen wij iedereen die zich bezighouden met macromoleculaire kristallisatie om RMM's een deel van hun routine workflow in alle gevallen waarin buigingsinrichtingen kristallen niet rechtstreeks zijn verkregen uit hun eerste schermen maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd deels gefinancierd door de BBSRC (BB/1006478/1). PRR is de ontvanger van een Royal Society Universiteit Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Ph–nix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
- Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- Babnigg, G., Joachimiak, A. Predicting protein crystallization propensity from protein sequence. J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).
- Bergfors, T.
- Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).
- Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).
- Bergfors, T. Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories. Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).
- Xu, L., Butcher, S. J., et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1. J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).
- Rangarajan, E. S., Izard, T. Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding. Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).
- Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).
- D'Arcy, A., Villard, F., et al. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).
- Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
- Obmolova, G., Malia, T. J., et al. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).
- Villasenor, A. G., Wong, A., et al. Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).
- Strynadka, N. C., James, M. N. Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. EXS. 75, 185-222 (1996).
- Diaz, A., Loewen, P. C., et al. Thirty years of heme catalases structural biology. Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).
