Vi beskriver en fremgangsmåde til passivering af en glasoverflade under anvendelse af polyethylenglycol (PEG). Denne protokol dækker overflade rengøring, overflade funktionalisering og PEG-belægning. Vi introducerer en ny strategi for at behandle overfladen med PEG-molekyler over to runder, som giver overlegen kvalitet af passivering i forhold til eksisterende metoder.
Single-molekyle fluorescens spektroskopi har vist sig at være medvirkende til at forstå en bred vifte af biologiske fænomener på nanoskala. Vigtige eksempler på, hvad denne teknik kan give til biologiske videnskaber er de mekanistiske indsigt i protein-protein og protein-nukleinsyre-interaktioner. Når interaktioner af proteiner probet på enkelt-molekyle niveau proteinerne eller deres substrater ofte immobiliseret på en glasoverflade, hvilket muliggør en langvarig observation. Denne immobilisering ordning kan indføre uønskede overflade artefakter. Derfor er det vigtigt at passivere glasoverfladen til at gøre det inaktivt. Overfladebelægning anvendelse af polyethylenglycol (PEG) skiller sig ud for sin høje ydeevne i forebyggelsen proteiner fra ikke-specifikt at interagere med en glasoverflade. Det er imidlertid vanskeligt polymerbelægningen procedure på grund af komplikation af en række overfladebehandlinger og de strenge krav om, at en overflade skalvære fri for fluorescerende molekyler ved slutningen af proceduren. Her giver vi en robust protokol med trin-for-trin instruktioner. Det dækker overflade rengøring, herunder Piranha ætsning, overflade funktionalisering med aminogrupper, og endelig PEG-belægning. For at opnå en høj tæthed af en PEG lag, introducerer vi en ny strategi for at behandle overfladen med PEG-molekyler over to runder, hvilket bemærkelsesværdigt forbedrer kvaliteten af passivering. Vi giver repræsentative resultater samt praktiske råd for hver kritisk trin, så alle kan opnå den høje kvalitet overfladepassivering.
Når du udfører en enkelt molekyle protein undersøgelse er det vigtigt at opnå en høj kvalitet af overfladepassivering så forsøget er fri for enhver overflade-induceret protein funktionsfejl eller denaturering 1,2. Mens en glasoverflade behandlet med overfladeaktive midler, såsom bovint serumalbumin, er almindeligt anvendt til enkelt-molekyle nukleinsyre undersøgelse 3, graden af dens passivering ikke er høj nok til proteinholdige studier. Et glas overflade belagt med polymer (polyethylenglycol, PEG) er overlegen i passivering ydeevne 4-6. Derved er det blevet almindeligt brugt til enkelt-molekyle protein studier lige siden det blev introduceret til et enkelt molekyle fluorescens undersøgelse 7-10. Polymerovertrækket procedure kræver flere overfladebehandlinger 7,11,12. Derfor er det vanskeligt at følge hele proceduren uden detaljerede instruktioner. Ofte graden af overfladepassivering varierer afhængigt af, hvilken protokol is følges. Her præsenterer vi en robust protokol med trin-for-trin-vejledning, som vil fjerne en af de største flaskehalse for enkelt-molekyle protein studier. Se figur 1 for overblik.
Kritiske trin i denne protokol
Det er vigtigt at gøre overfladen hydrofil før amino-silaniseringen reaktion. Dette blev opnået gennem Piranha ætsning, der genererer frie hydroxylgrupper på et glas / kvarts overflade. Det anbefales ikke at holde piratfisk ætset overflade, der udsættes for enten H 2 O eller luft i en lang periode siden hydrofiliciteten af overfladen går ned gradvist.
NHS-ester PEG-molekyler er reaktive. Det tilrådes at lave portioner og gemme dem under nitrogen i -20 º C. Holdbarheden af APTES kemisk på rumtemperaturen er kort. Det tilrådes at udskifte den med en ny hver måned.
Ændringer af denne protokol
Når du ikke kan bruge Piranha ætsning for nogen praktisk grund, kan du etch anvendelse af KOH i en længere periode (fx overnight), som også vil gøre hydroxylgrupper udsat for. Den faldgrube af denne alternative fremgangsmåde er, at slæden bliver ubrugelig efter et par genbruger på grund af alvorlige ridser.
Det er ofte praktiseret at brænde et glas / kvarts overflade ved hjælp af propan fakkel, som er effektiv til at fjerne fluorescerende organiske materialer 7. Denne procedure blev ikke medtaget i denne protokol, fordi det er overflødigt at Piranha ætsning. Bemærk, at denne procedure vil potentielt føre til oxidation af hydroxylgrupper. Derfor bør denne procedure ikke udføres, når en overflade blev ætset med KOH eller Piranha løsning.
Når en buffer med pH-værdi lavere end 7, som anvendes til enkelt-molekyle billedbehandling, konformationen af PEG skifter fra "svamp" til "pensel", hvilket reducerer graden af passivering. Når pH lavere end 7,0 er brugt, anbefales det derfor, at yderligere passivere overfladen med disuccinimidyl tartarate <sup> 7..
Perspektiver
Dette arbejde har givet en robust protokol for at opnå en høj kvalitet overfladepassivering. Denne protokol vil være nyttigt for enkelt-molekyle fluorescens undersøgelser, der er involveret med proteiner 14 samt protein-komplekser i celleekstrakter og immunpræcipitater 15. Det vil blive udbredt til andre enkelt-molekyle teknikker såsom force spektroskopi og drejningsmoment spektroskopi 16. Det vil også være nyttige til forebyggelse af celler fra adsorption til en overflade 17.
Oplysningerne i dette arbejde protokol er krævende for sine multi-trin procedurer. Overfladepassivering hjælp lipid-PEG 8 og poly-lysin PEG 9 er tilgængelig som en alternativ tilgang. Da de ikke kræver nogen kemiske reaktioner er det let at gennemføre. Graden passivering er ikke så høj som den, der opnås ved kemisk modifgement af en overflade.
The authors have nothing to disclose.
SDC, ACH, og CJ blev støttet af Starting Grants (ERC-StG-2012 til 309.509) gennem Det Europæiske Forskningsråd. J.-MN blev støttet af National Research Foundation (NRF) (2011 til 0.018.198), Korea; og Pioneer Research Center Program (2012-009586) gennem NRF Korea finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT og fremtidig planlægning (MSIP). Dette arbejde blev også støttet af Center for BioNano Sundhed-Guard finansieret af MSIP Korea som Global Frontier Project (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL og J.-HH blev støttet af Seoul Science Fellowship Program for Seoul City, Korea. Det mærkede Rep protein var en generøs gave fra Dr. Sua Myong.
1. Slide preparation and cleaning | |||
Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24x32mm2, 22x40mm2, 24x50mm2 (No.1½, Rectangular) |
Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
H2O2 | Boom | 6233905 | Opened bottles should be stored at 4 °C. 1 L, hydrogen peroxide 30% |
H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
2. Coverslip cleaning | |||
Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | Store at the room temperature under N2 . Replace once in a month. 3-aminopropyl trimethoxysilane |
Flask (200mL) | VWR | Flask (200 mL) | Have one flask dedicated for aminosilanization. Pyrex flask |
Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da |
mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
6. Surface passivation (the second round) | |||
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
MS4-PEG | Pierce | 22341 | Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 mL DMSO. Store 20 mL aliquots at -20 °C. Short NHS-ester PEG, MW 333 Da |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
7. Assembling a microfluidic chamber | |||
Double sticky tape | Scotch | 10mm wide | |
Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
Neutravidin | Pierce | 31000 | Stock in 5 mg/mL in H2O at 4 °C. ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein |
Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/mL in H2O or T50 at 4 °C. |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |