Summary
Vi beskriver en fremgangsmåte for passivering en glassflate ved bruk av polyetylenglykol (PEG). Denne protokollen omfatter rengjøring overflate, overflaten funksjon, og PEG belegg. Vi introduserer en ny strategi for å behandle overflaten med PEG molekyler over to runder, som gir suveren kvalitet av passivisering i forhold til eksisterende metoder.
Abstract
Single-molekyl fluorescens-spektroskopi har vist seg å være medvirkende til å forstå et bredt spekter av biologiske fenomener på nanoskala. Viktige eksempler på hva denne teknikken kan gi til biologiske vitenskaper er de mekanistisk innsikt på protein-protein-og protein-nukleinsyre interaksjoner. Når interaksjoner av proteiner er analysert på enkelt-molekyl nivå, er proteiner eller deres underlag ofte immobilisert på en glassflate, noe som åpner for en langsiktig observasjon. Dette immobilisering ordningen kan introdusere uønskede overflate gjenstander. Derfor er det viktig å passivere glassoverflaten for å gjøre den inert. Overflatebehandling ved hjelp av polyetylenglykol (PEG) skiller seg ut for sin høye ytelse i å forebygge proteiner fra ikke-spesifikt i samspill med en glassflate. Imidlertid er polymerbelegget prosedyren vanskelig, på grunn av komplikasjoner som oppstår fra en rekke overflatebehandlinger og de strenge krav om at en overflate måvære fri for eventuelle fluorescerende molekyler ved slutten av prosedyren. Her gir vi en robust protokoll med steg-for-steg-instruksjoner. Den dekker overflaterengjøring inkludert piranha etsing, overflatefunksjonalisering med amingrupper, og til slutt PEG belegg. For å oppnå en høy tetthet av et PEG sjikt, innfører vi en ny strategi for å behandle overflaten med PEG-molekyler i to omganger, som bemerkelsesverdig forbedrer kvaliteten på passivisering. Vi gir representative resultater samt praktiske råd for hver kritiske trinn, slik at hvem som helst kan oppnå høy kvalitet overflaten passivisering.
Introduction
Ved utførelse av en enkelt-molekyler protein studie er det vesentlig å oppnå en høy kvalitet av overflate-passivering, slik at forsøket er fri for enhver overflate-indusert protein funksjonsfeil eller denaturering 1,2. Mens en glassoverflate ble behandlet med overflateaktive midler, slik som bovint serumalbumin, er ofte brukt for enkelt-molekyl nukleinsyre studier 3, er graden av dens passive ikke høy nok for protein-studier. En glassoverflate belagt med polymer (polyetylenglykol, PEG) er overlegen i passiveytelse 4-6. Dermed har det blitt universelt brukt for single-molekyl protein studiene helt siden den ble introdusert til en enkelt-molekyl fluorescens studie 7-10. Polymerbelegget fremgangsmåte krever flere overflatebehandlinger 7,11,12. Derfor er det vanskelig å følge hele prosedyren uten nærmere instruksjoner. Ofte er graden av overflatepassivering varierer, avhengig av hvilken protokoll is fulgt. Her presenterer vi en robust protokoll med steg-for-trinn-instruksjoner, som vil fjerne en av de store flaskehalsene av single-molekyl protein studier. Se figur 1 for oversikt.
Protocol
En. Skyv Forberedelse og rengjøring
En mikrofluidkammeret er sammensatt av en kvarts lysbilde og et dekkglass. I prismetypen total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, er på overflaten av kvartsglide avbildes. Derfor er det viktig å rengjøre en kvartsglide grundig med H2O, aceton, KOH, og piranha løsninger. Th er flertrinns rensing eliminerer fluorescerende organiske molekyler på en overflate som forstyrrer ett molekyl fluorescensmåling. I tillegg gjør den piranha etsing kvartsoverflaten hydrofil ved å generere hydroksylgrupper. De frie hydroksylgrupper er avgjørende for den amino-silanization reaksjonen i trinn 3.
- Drilling kvarts lysbilder. Bor et par hull i en kvartsglass med en 3/4 mm diamantbor (figur 2a). Hvis flere kanaler er ønsket, bore mer pairs av hull (figur 2b). Disse hullene blir brukt for å injisere løsningene inn i et mikrofluidkammer i trinn 7.
- Hold drillen litt våt i H 2 O under boringen. H 2 O utfører som et smøremiddel, noe som øker levetiden på borekronen.
- Sporadisk tørke tuppen av boret hjelper bore hull.
- Etter boring av hull, markerer den ene siden av dekselet lett kan identifiseres under PEGylering prosessen. Markørene kan benyttes som referanse for å unngå forvirring senere. For merking, kan en diamant borekronen brukes. Ikke bruk en penn siden blekket kan komme på overflaten.
- Rengjøring med H 2 O. Plasser lysbildene i et glass flekker krukke. Vanligvis 5 til 15 slides kan plasseres i en enkelt glass. Skyll lysbildene med MilliQ H 2 O. Gjenta det tre ganger og sonicate lysbildene med MilliQ H 2 O for 5 min for å fjerne skitt. Kast vannet og skyll lysbildene igjen tre ganger medMilliQ H 2 O. Merk at 130 W er sonication strømmen som brukes for denne protokollen. Høyere sonikator makt kan redusere levetiden til kvarts lysbilder.
- Rengjøring med aceton. Skift MilliQ H 2 O med aceton. Sonicate skinnene med aceton i 20 min eller lenger.
- Skylling med H 2 O. Kast aceton og skyll lysbildene med MilliQ H 2 O. Gjenta det for tre ganger for å fjerne eventuelle aceton rester.
- Rengjøring med KOH. Bytt ut vannet med en M KOH og sonicate lysbilder for 20 min eller lengre. Overdreven etsing (f.eks over natten KOH behandling) vil forbedre kvaliteten på overflaten, men vil innføre riper, noe som kan forstyrre fluorescens bildebehandling.
- Skylling med H 2 O. Skyll lysbildene med MilliQ H 2 O for tre ganger for å fjerne spor av KOH.
- Piranha etsing.
- Overfør lysbilder til en Duran glassholder eller en skreddersydd Teflon holder og place dem i et begerglass (1 L) som er plassert i en kjemisk hette.
- Fyll begeret med 450 ml H 2 SO 4.
- Legg 150 ml H 2 O 2 for 3:01 forholdet mellom H 2 SO 4 og H 2 O 2. Når oppløsningen begynner å koke spontant, øker temperaturen over 90 ° C. Kontroller at H 2 O 2-løsning er ved romtemperatur før du starter reaksjonen. Ellers kan temperaturen for kokeløsningen er lavere enn 90 ° C.
- Omrør løsningen for riktig blanding og la begeret uforstyrret i 20 min.
- Ta lysbildene ut av piraja løsning sammen med lysbildeholderen, og legg dem i en lysbildeholderen som inneholder MilliQ H 2 O. I mellomtiden, kast piraja løsning til en utpekt avfallsflasken når den når romtemperatur.
- Skyll lysbildene tre ganger med MilliQ H 2 O. Ekstra forsiktighet bør utvises i ytterligere steps for å unngå enhver mulig forurensning av lysbilder. Fortsett til trinn tre. Det anbefales å umiddelbart fortsette med følgende trinn.
* Forsiktig: piraja Løsningen er svært reaktive. Ved håndtering av denne løsningen ekstra forsiktighet bør utvises. I tillegg, når det ved en feil blandet med organiske oppløsningsmidler slik som aceton, kan det føre til en eksplosjon.
2. Cover Rengjøring
En mikrofluidkammeret er sammensatt av en kvarts lysbilde og et deksel s leppe. Når en prisme-type TIRF mikroskop brukes, blir overflaten av et dekkglass ikke avbildes. Derfor er det nok til å rense et dekk bare med H 2 O og KOH. I tilfelle et dekkglass må avbildes (f.eks via målet-type TIRF mikroskopi), anbefales det å behandle Dekkglass med piraja løsning (trinn 1,7). Merk at hvis PEGylering av dekkflaten ikke er av høy kvalitet, kan det fungere som en vask for proteiner enville gi opphav til variasjoner i proteinkonsentrasjon.
- Skylling med H 2 O. Plasser Dekk (24 x 30, 24 x 40, eller 24 x 50 mm 2) i et glass flekker krukke. Vanligvis 5 til 15 dekkglass kan plasseres i en enkelt glass. Skyll Dekk tre ganger med MilliQ H 2 O.
- Rengjøring med KOH. Bytt ut vannet med 1M KOH og sonicate Dekkglass for 20 min eller lengre.
- Skylling med H 2 O. Skyll Dekkglass 3 ganger med MilliQ H2O for å fjerne spor av KOH. Fortsett til trinn tre.
Tre. Amino-silanization av lysbilder og Dekk
Funksjon overflaten av kvarts lysbilder og Dekkglass med amingruppen via amino-silanization kjemi. Metanol anvendes som et løsningsmiddel og eddiksyre som en katalysator for den amino-silanization reaksjon.
- Skylling med metanol. Skift MilliQ H 2 O i farging retter (fra Steps 1 og 2) med metanol. Hold lysbilder og Dekk i metanol til trinn 3.3. Ikke oppbevar lysbilder og Dekk i metanol for en unødvendig lang tid (f.eks flere timer) siden urenheter i metanol vil adsorberes til overflaten.
- Forbereder amino-silanization løsning.
- Skyll et Pyrex kolbe flere ganger med metanol. Sonicate kolben med metanol i 5 minutter eller lenger. Det anbefales å ha en dedikert kolbe som er vedlikeholdt ren.
- Hell 100 ml metanol inn i kolben.
- Tilsett 5 ml eddiksyre.
- Tilsett 3 ml APTES (3-aminopropyl trimethoxysilane) og bland forsiktig ved å riste den.
- Amino-silanization. Sett på metanol i farging retter som inneholder lysbildene og Dekkglass med aminosilanization reaksjonsblandingen.
- Inkuber i 20-30 min. Under inkubasjonen sonicate gang i 1 min.
- Skylling med metanol. Sett på enminosilanization reaksjon med metanol. Kast metanol og legge en frisk metanol løsning. Gjenta denne prosedyren tre ganger.
4. Overflate Passivisering Bruke Polymer (første runde)
Passiviserende amin-belagte overflate av kvarts lysbilder og dekkglass ved å konjugere NHS-ester polyetylenglykol (PEG). Denne reaksjonen blir utført med matnings-konsentrasjonen av PEG-oppløsning ved pH 8,5 over natten.
- Tørking lysbilder og dekkglass. Tørk lysbilder og Dekk bruker N 2 gass og plassere dem i ren pipette bokser på en slik måte at den siden som må være pegylert vender opp. Pipetten boksen er delvis fylt med MilliQ H 2 O. Denne fuktig miljø hindrer PEGylering løsning tørker ut i løpet av natten inkubasjon.
- Forbereder reaksjon buffer. Forbered 0,1 M frisk natrium-bikarbonat-buffer (pH 8,5) ved å løse 84 mg natrium-bikarbonat i 10 mlMilliQ H 2 O. Det er ikke behov for å justere pH. Denne løsningen kan bli lagret i frossen tilstand for neste gangs bruk (f.eks Trinn 6.1).
- Forbereder PEGylering løsning.
- Tilbered en PEG blanding av 0,2 mg biotinylert NHS-ester PEG (5000 Da) 13 og 8 mg NHS-ester mPEG (5000 Da) i et 1,5 ml rør. Ved fremstilling av N antall lysbilder, klar N ganger større mengde av PEG-blanding i et enkelt rør.
- Legg 64 mL (eller N ganger 64 mL for N antall lysbilder) av den nylagde buffer (Step 4,2). Pipetter den opp og ned for å oppløse dem helt.
- Sentrifuger med 16 100 xg i 1 min for å fjerne luftbobler. Ikke pipette etterpå. Ellers, vil luftbobler dannes som forstyrrer PEGylering på trinn 4,4.
- PEGylering.
- Slipp 70 mL av PEGylering blandingen til en tørket kvarts lysbilde fra trinn 4.1. Bruk 90 mL ved 24 x 50 mm 2 coverslip.
- Forsiktig plassere en tørket dekkglass fra trinn 4.1 over løsningen.
- Å ha en jevn og høy kvalitet på PEGylering, tar seg ikke å innføre luftbobler. På grunn av overflatespenningen, kan det meste av luftboblene spontant forlater reaksjonsvolum i løpet av fem minutter på grunn av overflatespenningen.
- Inkuber lysbilder i en mørk og fuktig miljø. Halveringstiden av NHS-ester PEG som vi bruker ved pH 8 er ca en time. Som et minimum, inkubere dem i 2 timer. Over natten inkubering fører til høyere kvalitet på PEGylering (data ikke vist).
5. Langvarig oppbevaring
Lagring PEGylert lysbilder og dekkglass i N 2 ved -20 º C.
- Tørking lysbilder og dekkglass. Demontere nøye raset og dekkglass ved å skyve dekkglass til en side, skyll dem med MilliQ H 2 O, og tørk dem med N 2.
- Lagring av lysbilder og dekkglass. For umiddelbar bruk, følg fremgangsmåten for den andre runden av PEGylering (trinn 6). For å kunne lagres for en lengre periode, følger de neste trinnene.
- Plasser et par av lysbildet og dekkglass i et 50 ml rør, slik at de PEGylerte overflater er vendt bort fra hverandre.
- Delvis lukke røret, støvsuge røret, og deretter fylle den med N 2. Disse trinnene hjelper bevare den PEGylerte flate for en lang tidsperiode. Skru røret tett og lagre det ved -20 ° C. Kvaliteten av skinnene forblir godt i opp til 3 måneder (figur 3a, høyre).
6. Overflate Passivisering Bruke Polymer (andre runde)
Ytterligere runde av PEGylering for å gjøre PEG sjikt tettere og også til å slukke eventuelle gjenværende amingrupper på overflaten. Bruken av korte NHS-ester PEG-molekyler (333 Da) kan være effektiv i å trenge inn i en eksisterende PEG lag. Det er recanbefaler vi at du gjør dette andre runde av PEGylering rett før du bruker et lysbilde.
- Forbereder reaksjon buffer. Forbered 0,1 M frisk natrium-bikarbonat-buffer (pH 8,5). Den frosne oppløsningen fra trinn 4.2 kan også brukes.
- Forbereder PEGylering løsning. Oppløs 7 ul av 250 mM MS4-PEG i 63 pl av natrium-bikarbonat-buffer.
- PEGylering. Følg samme fremgangsmåte som i trinn 4.4. Inkuber i 30 minutter opp til over natten.
- Tørking lysbilder og dekkglass. Demonter par av raset og dekkglass, skyll dem med MilliQ H 2 O, tørk dem med N 2, og holde dem i en ren pipette boks. Fortsett for å sette sammen en microfluidic kammer i trinn 7.
7. Sammen et Microfluidic Chamber
Sette sammen et microfluidic kammer ved hjelp av et par av et pegylert kvarts sklie og et dekkglass. Dobbeltsidig klebrig tape brukes som et avstandsstykke. Kammeret er forseglet med epoksy-lim, og sålutions er innført gjennom hullene i kvarts lysbilde.
- Plasser en kvartsglass på et flatt underlag med pegylert siden opp.
- Lag en kanal (bredde 5 til 7 mm) diagonalt på pegylert overflaten ved å sette tosidige klebrig tape over glide. Påse at hullene er plassert i midten av kanalen. Pass på å ikke ødelegge pegylert overflaten under prosessen med å lage et kammer. Det er mulig å foreta en flerkanals bilde ved å plassere og holde de tosidige selvklebende bånd på en annen måte (se figur 2).
- Forsiktig plassere en pegylert dekkglass på toppen for å fullføre kammeret. PEGylert Siden skal vende ned.
- Forsegle kammeret ved å trykke på dekkglass over området der tosidige tape er plassert. Gjør det forsiktig, men grundig, slik at kammeret blir vann-tett tillukket.
- Lukk kantene på kammeret med Epoxy lim.
- Immobilisere Streptavidin eller NeutrAvidin påbiotinylert PEG laget ved å tilsette 50 pl 0,1 mg / ml Streptavidin eller NeutrAvidin oppløsning i T50 (10 mM Tris-HCl [pH8.0], 50 mM NaCl-buffer) ved hjelp av et P200-pipette. Etter 1 min med inkubasjon, skyll med 100 mL av T50-buffer.
- Legg biotinylerte biologiske molekyler for single-molekyl bildebehandling.
8. Skyv Recycling
Resirkulering kvarts lysbilder. Brukte lysbilder resirkuleres ved å ta av Dekkglass og tosidige klebrig bånd.
- Etter bruk, oppbevar kamrene i vann fra springen. Long-term inkubasjon i vann letter demontering av kamrene.
- Kok kamrene i vann fra springen ved hjelp av en mikrobølgeovn. Bruk en Pyrex begerglass. Kok i 10 min eller lenger.
- Ta av dekkglass og de tosidige klebrig tape med et barberblad. Ikke trykk en kvarts lysbilde vinkelrett på planet. Ellers bryter det. Hold barberblad bort fra kanalen. Otherwise, introduserer det riper på kanalen.
- Skyll lysbildene med et vanlig vaskemiddel ved å gni dem med fingrene.
- Plasser lysbildene i et glass flekker krukke. Vanligvis 5 til 15 slides kan plasseres i en enkelt glass. Legg 10% rengjøringsmidler og sonicate lysbilder for 20 min eller lengre. Vask objektglassene med en stor mengde av tab vann.
- Gå til trinn 1.2.
Representative Results
Etter microfluidic kammeret enheten (Step 07.01 til 07.06) og før det foretas Trinn 7,7, er det anbefalt kvalitetskontroll av PEGylert overflaten for å gjennomføre.
Hvis overflatepassivering har vært gjort med hell, er det mindre enn 10 ikke-spesifikt adsorberte proteiner per avbildningsområde (25 mm x 25 mm) observert når 1-10 nM fluorescensmerkede protein tilsettes inn i kammeret (figur 3a, venstre).
Når noen av de rengjøring eller reaksjonsmåten ikke er riktig utført, antall ikke-spesifikt adsorbert proteiner øker betydelig, og CCD-skjermen kan være mettet av fluorescens signaler. For eksempel, dersom piranha etsing hoppes over, er 100 ganger større mengde av ikke-spesifikk adsorpsjon observert (Figur 3a, sammenlign igjen med midten). Når den andre PEGylering trinnet hoppes over, det var ca 3 gangs en større mengde av ikke-spesifikk adsorpsjon observert (figur 3b). En lav grad av PEGylering blir observert når utløpt kjemikalier (f.eks APTES lagres ved romtemperatur i flere måneder) er (data ikke vist) benyttes. Kvaliteten på overflaten også faller ned når en betydelig mengde tid som har gått med siden det var pegylert (figur 3a, sammenlign venstre til høyre).
Til vår beste kunnskap, er det første gang at de to rundene av PEGylering blir introdusert for single-molekyl studier. De to runder med PEGylering garanterer den høyeste kvalitet av PEG lag formasjonen (Figur 3b). Den overlegne natur dobbel PEGylering er fremtredende vist i filmene (Sammenlign Movie 1a med Movie 1b). I disse filmer, er bakgrunnssignaler fra fluorescerende molekyler i oppløsningen observert å være mye svakere når den doble PEGylering var brukes, noe som tyder på at proteiner blir frastøtt mer effektivt ved den dobbelt Pegylert lag. Selv om denne to-trinns prosess på det sterkeste, kan den andre PEGylering trinnet hoppes hvis eksperimentet er utholdelig til ikke-optimal passivisering.
Figur 1:. Skjematisk fremstilling av overflatebehandlinger (a) et objektglass blir renset med aceton, KOH, og piranha løsninger. Det funksjonaliseres med APTES og pegylert med NHS-ester PEG. (B) et dekkglass er renset med KOH, så vel som med piraja oppløsning om nødvendig. Det funksjonaliseres med APTES og pegylert med NHS-ester PEG.
fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2:. Microfluidic kammer (a) En enkelt-kanalkammeret. Mikroskopet slide har to hull boret. Den er satt sammen med et dekkglass ved hjelp av to skiver av en dobbeltsidig tape. (B) En tre-kanalkammeret. Mikroskopet slide har seks hull boret. Det er satt sammen med et dekkglass ved hjelp av fire skiver av en dobbeltsidig tape.
Figur 3: CCD-bilder tatt med fargestoffmerkede proteiner i løsning. (A) CCD bildene ble tatt av prisme-type total intern refleksjon fluorescens mikroskopi ved hjelp av en 60X objektiv med 10 nM Cy3-labeld Rep i løsningen. (Venstre) En overflate ble fremstilt etter protokollen i denne artikkelen. (Middle) En overflate var forberedelserød følge protokollen i denne artikkelen, men piraja etsing ble hoppet over. (Høyre) Et underlag ble fremstilt ved å følge protokollen i denne artikkelen, og lagret i 3 måneder ved -20 ° C under nitrogen. (B) CCD bilder tatt med 10 nM Cy3-labeld Rep i løsningen. (Venstre) En overflate ble fremstilt etter protokollen i denne artikkelen. (Høyre) En overflate ble fremstilt etter protokollen i denne artikkelen, men den andre runden av PEGylering ble hoppet over. Scale bar = 5 mikrometer.
Film 1: CCD-filmer tatt med dye-merkede proteiner i løsningen. CCD-filmer ble tatt av prisme-type total intern refleksjon fluorescens mikroskopi ved hjelp av en 60X objektiv med 10 nM Cy3-labeld Rep i løsningen. Den tidsoppløsning er 100 msek. (A) Et underlag ble fremstilt ved å følge protokollen i denne artikkelen. (B) En overflate ble fremstilt etter protokollen i denne artikkelen, men den andre runden av PEGylasjon ble hoppet over. Klikk her for å vise Movie 1a og klikk her for å se film 1b.
Discussion
Kritiske trinnene i denne protokollen
Det er viktig å gjøre overflaten hydrofil før amino-silanization reaksjon. Dette ble oppnådd via piranha etsing som genererer de frie hydroksyl-grupper på et glass / kvarts overflate. Det anbefales ikke å holde piranha etsede overflate eksponert for enten H 2 O eller luft i en lengre tidsperiode, siden det hydrofile egenskapene av overflaten synker gradvis.
NHS-ester PEG molekyler er reaktiv. Det anbefales å gjøre alikvoter og lagre dem under nitrogen i -20 º C. Holdbarheten av APTES kjemisk ved romtemperatur er kort. Det anbefales å erstatte den med en ny hver måned.
Modifikasjoner av denne protokollen
Når du ikke kan bruke piranha etsing for noen praktisk grunn, kan du etse bruker KOH for en lengre periode (f.eks overnight), vil der også gjøre hydroksylgrupper eksponert. Den fallgruve av dette alternativ tilnærming er at lysbildet blir ubrukelig etter noen resirkulerer grunn av alvorlige riper.
Det er ofte praktisert å brenne et glass / kvarts overflaten ved hjelp av propan lommelykt, som er effektiv i å eliminere fluorescerende organiske materialer 7. Denne prosedyren ble ikke inkludert i denne protokollen, fordi det er overflødig å piraja etsing. Legg merke til at denne fremgangsmåten vil kunne føre til oksydasjon av hydroksylgruppene. Derfor bør denne fremgangsmåte ikke utføres når en overflate er etset ved hjelp av KOH eller piraja løsning.
Når en buffer med pH-verdi lavere enn 7 brukes for enkelt-molekylet imaging, konformasjon av PEG endres fra "sopp" til "børste", hvilket reduserer graden av passivering. Derfor, når pH er lavere enn 7,0 er brukt, er det anbefalt å ytterligere passivere overflaten ved hjelp disuccinimidyl tartrat <sup> 7.
Perspektiver
Dette arbeidet har gitt en robust protokoll for å oppnå høy kvalitet overflaten passivisering. Denne protokollen vil være nyttig for single-molekyl fluorescens studier som er involvert med proteiner 14 samt protein komplekser innenfor celle ekstrakter og immunoutfellinger 15. Det vil være mye brukt for andre enkelt molekyl teknikker slik som kraft-spektroskopi og dreiemoment-spektroskopi 16. Det vil også være nyttig for å forhindre celler fra å adsorbere til en overflate 17..
Protokollen gitt i dette arbeidet er krevende for sine multi-trinn prosedyrer. Surface passivisering ved hjelp lipid-PEG 8 og poly-lysin PEG 9 er tilgjengelig som en alternativ tilnærming. Siden har de ikke krever noen kjemiske reaksjoner er det enkelt å implementere. Imidlertid er graden av passivering ikke er så høyt som det som oppnås ved kjemisk modification av en overflate.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
SDC, ACH, og CJ ble støttet av Starting Grants (ERC-StG-2012-309509) gjennom European Research Council. J.-MN ble støttet av National Research Foundation (NRF) (2011-0018198) i Korea; og Pioneer Research Center Program (2012-009586) gjennom NRF Korea finansiert av departementet for vitenskap, IKT, og fremtidig planlegging (MSIP). Dette arbeidet ble også støttet av Senter for BioNano Helse-Guard finansiert av MSIP av Korea som Global Frontier Project (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL og J.-HH ble støttet av Seoul Science Fellowship Program i Seoul City, Korea. Den merket Rep protein var en sjenerøs gave fra Dr. Sua Myong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Slide preparation and cleaning | |||
| Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
| Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 (No.1½, Rectangular) |
| Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
| H2O2 | Boom | 6233905 | 1 L, hydrogen peroxide 30%. Opened bottles should be stored at 4 °C. |
| H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
| 2. Coverslip cleaning | |||
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
| Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
| APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | 3-aminopropyl trimethoxysilane. Store at the room temperature under N2. Replace once in a month. |
| Flask (200 ml) | VWR | Flask (200 ml) | Pyrex flask. Have one flask dedicated for aminosilanization. |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
| Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da. Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da. Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 5. Surface passivation (the second round) | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
| DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
| MS4-PEG | Pierce | 22341 | Short NHS-ester PEG, MW 333 Da. Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 ml DMSO. Store 20 µl aliquots at -20 °C. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 6. Assembling a microfluidic chamber | |||
| Double sticky tape | Scotch | 10 mm wide | |
| Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
| Neutravidin | Pierce | 31000 | ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein. Stock in 5 mg/ml in H2O at 4 °C. |
| Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/ml in H2O or T50 at 4 °C. |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |
References
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Surfaces and orientations: much to FRET about. Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).
- Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization. Methods. 52 (2), 192-200 (2010).
- Di Fiori, N., Meller, A. Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules. J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).
- Kingshott, P., Griesser, H. J.
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).
- Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2007).
- Finkelstein, I. J., Greene, E. C. Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies. Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).
- Kenausis, G. L., et al. Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption. J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).
- Groll, J., Star Moeller, M. polymer surface passivation for single-molecule detection. Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).
- Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro. J Biomed Opt. 16 (5), (2011).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay. J Vis Exp. (37), e1689 (2010).
- Upadhyayula, S., et al. Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces. Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).
- Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).
- Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes. Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
