Vi beskriver ett förfarande för passivering av en glasyta med användning av polyetylenglykol (PEG). Detta protokoll omfattar ytrengöring, ytfunktionalisering, och PEG beläggning. Vi introducerar en ny strategi för att behandla ytan med PEG-molekyler över två omgångar, som ger överlägsen kvalitet på passivering jämfört med befintliga metoder.
Single-molekyl fluorescens spektroskopi har visat sig vara avgörande för att förstå ett brett spektrum av biologiska fenomen på nanonivå. Viktiga exempel på vad denna teknik kan ge biologiska vetenskaperna är de mekanistiska insikter om protein-protein och protein-nukleinsyra interaktioner. När interaktioner mellan proteiner sonderades vid enda molekyl nivå, proteinerna eller deras substrat ofta är immobiliserad på en glasyta, som möjliggör en långsiktig observation. Denna immobilisering system kan införa oönskade ytan artefakter. Därför är det väsentligt att passivera glasytan för att göra det inerta. Ytbeläggning med användning av polyetylenglykol (PEG) utmärker sig för sin höga prestanda i att förhindra proteiner från icke-specifikt interagerar med en glasyta. Det är emellertid svårt polymerbeläggningsproceduren, på grund av komplikationer som uppstår från en serie av ytbehandlingar och stringenta krav på att en yta behövervara fri från andra fluorescerande molekyler vid slutet av förfarandet. Här ger vi en robust protokoll med steg-för-steg-instruktioner. Den täcker ytan städning inklusive piraya etsning, ytfunktionalisering med amingrupper, och slutligen PEG beläggning. För att erhålla en hög densitet av en PEG-skikt, introducerar vi en ny strategi för behandling av ytan med PEG-molekyler över två rundor, vilket anmärkningsvärt förbättrar kvaliteten av passivering. Vi erbjuder representativa resultat samt praktiska råd för varje kritiskt steg så att alla kan uppnå kvalitets ytpassivering hög.
När du gör en enda molekyl proteinstudie är det viktigt att uppnå en hög kvalitet på ytan passivering så att experimentet är fri från alla ytor-inducerad protein fel eller denaturering 1,2. Medan en glasyta som behandlats med ytaktiva medel, såsom bovint serumalbumin, är vanligen används för enda molekyl nukleinsyra studier 3, är graden av dess passivering inte är tillräckligt hög för proteinstudier. En glasyta belagd med polymer (polyetylenglykol, PEG) är överlägsen i den passive prestanda 4-6. Därmed har det blivit allmänt används för enda molekyl proteinstudier ända sedan det infördes till en enda molekyl fluorescens studie 7-10. Den polymerbeläggning proceduren kräver flera ytbehandlingar 7,11,12. Därför är det svårt att följa hela förfarandet utan detaljerade instruktioner. Ofta graden ytpassivering varierar beroende på vilket protokoll is följde. Här presenterar vi en robust protokoll med steg-för-steg-instruktioner, vilket kommer att ta bort en av de största flaskhalsarna i enda molekyl proteinstudier. Se figur 1 för översikt.
Kritiska steg i detta protokoll
Det är viktigt att göra ytan hydrofil innan amino-silaniseringen reaktion. Detta uppnåddes genom piraya etsning som genererar de fria hydroxylgrupper på ett glas / kvarts yta. Det rekommenderas inte att hålla piraya etsade ytan utsätts för antingen H2O eller luft under en längre tid eftersom hydrofiliteten av ytan går ner gradvis.
NHS-ester-PEG-molekyler är reaktiva. Det rekommenderas att göra alikvoter och förvara dem under kväve i -20 º C. Hållbarheten för APTES kemiska vid rumstemperatur är kort. Det rekommenderas att ersätta den med en ny varje månad.
Modifikationer av detta protokoll
När du inte kan använda piraya etsning av någon praktisk anledning, kan du etsa använda KOH under en längre tid (t.ex. overnight), vilket också kommer att göra hydroxylgrupperna exponeras. Den fallgrop med denna alternativa metod är att sliden blir oanvändbar efter några återvinner grund av allvarliga repor.
Det är ofta praktiseras för att bränna ett glas / kvarts yta med hjälp av gasolbrännare, som är effektiva för att eliminera fluorescerande organiska material 7. Detta förfarande var inte med i detta protokoll för att det är överflödigt med piraya etsning. Observera att förfarandet eventuellt kommer att leda till oxidation av hydroxylgrupper. Därför bör detta förfarande inte utföras när en yta etsades använda KOH eller piraya lösning.
När en buffert med pH-värde lägre än 7 används för en enda molekyl avbildning, konformationen av PEG ändras från "svamp" till "borste", vilket minskar graden av passivering. Därför, när pH-värdet är lägre än 7,0 används, är det rekommenderat att ytterligare passivera ytan med disuccinimidyltartrat <sup> 7.
Perspektiv
Detta arbete har gett en robust protokoll för att uppnå hög kvalitet ytpassivering. Protokollet kommer att vara användbart för enda molekyl fluorescens studier som är involverade med proteiner 14 samt proteinkomplex i cellextrakt och immunoprecipitaten 15. Den kommer att i stor utsträckning för andra enda molekyl tekniker såsom kraft spektroskopi och vridmoment spektroskopi 16. Det kommer också att vara användbar för att förhindra celler från att adsorbera till en yta 17.
Protokollet i detta arbete är krävande för sina flerstegsförfaranden. Ytpassivering hjälp av lipid-PEG 8 och poly-lysin PEG 9 finns tillgängliga som ett alternativ. Eftersom de inte kräver några kemiska reaktioner är det lätt att genomföra. Emellertid är graden av passivering inte lika hög som den som uppnås genom kemisk modifblue av en yta.
The authors have nothing to disclose.
SDC, ACH, och CJ stöddes av Starting Grants (ERC-StG-2012 till 309.509) genom Europeiska forskningsrådet. J.-MN stöddes av National Research Foundation (NRF) (2011 till 0.018.198) i Korea; och Pioneer Research Center Program (2012-009586) genom NRF Korea finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT, och framtida planering (MSIP). Detta arbete stöddes också av Centrum för BioNano Hälso-Guard finansieras av MSIP Korea som Global Frontier Project (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL och J.-HH stöddes av Seoul Science Fellowship Program i Seoul City, Sydkorea. Det märkta Rep-protein var en generös gåva från Dr Sua Myong.
1. Slide preparation and cleaning | |||
Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24x32mm2, 22x40mm2, 24x50mm2 (No.1½, Rectangular) |
Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
H2O2 | Boom | 6233905 | Opened bottles should be stored at 4 °C. 1 L, hydrogen peroxide 30% |
H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
2. Coverslip cleaning | |||
Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | Store at the room temperature under N2 . Replace once in a month. 3-aminopropyl trimethoxysilane |
Flask (200mL) | VWR | Flask (200 mL) | Have one flask dedicated for aminosilanization. Pyrex flask |
Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da |
mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
6. Surface passivation (the second round) | |||
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
MS4-PEG | Pierce | 22341 | Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 mL DMSO. Store 20 mL aliquots at -20 °C. Short NHS-ester PEG, MW 333 Da |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
7. Assembling a microfluidic chamber | |||
Double sticky tape | Scotch | 10mm wide | |
Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
Neutravidin | Pierce | 31000 | Stock in 5 mg/mL in H2O at 4 °C. ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein |
Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/mL in H2O or T50 at 4 °C. |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |