हम polyethylene glycol (खूंटी) का उपयोग कर एक गिलास सतह passivating के लिए एक विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल सतह की सफाई, सतह functionalization, और खूंटी कोटिंग को शामिल किया गया. हम मौजूदा तरीकों की तुलना में passivation की बेहतर गुणवत्ता की पैदावार है, जो दो से अधिक दौर खूंटी अणुओं के साथ सतह के इलाज के लिए एक नई रणनीति का परिचय.
एकल अणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी nanoscale पर जैविक घटना की एक विस्तृत श्रृंखला को समझने में सहायक सिद्ध हो गया है. इस तकनीक को जैविक विज्ञान के लिए उपज सकता है की महत्वपूर्ण उदाहरण प्रोटीन, प्रोटीन और प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड बातचीत पर यंत्रवत अंतर्दृष्टि हैं. प्रोटीन की बातचीत एकल अणु के स्तर पर जांच कर रहे हैं, प्रोटीन या उनके substrates अक्सर एक लंबी अवधि के अवलोकन के लिए अनुमति देता है एक कांच की सतह पर स्थिर रहे हैं. इस स्थिरीकरण योजना अवांछित सतह कलाकृतियों को पेश हो सकता है. इसलिए, यह इसे निष्क्रिय करने के लिए कांच की सतह passivate करने के लिए आवश्यक है. Polyethylene glycol (खूंटी) का उपयोग कर सतह कोटिंग गैर विशेष रूप से एक कांच की सतह के साथ बातचीत से प्रोटीन को रोकने में अपने उच्च प्रदर्शन के लिए बाहर खड़ा है. हालांकि, बहुलक कोटिंग प्रक्रिया की वजह से एक सतह की जरूरत है कि सतह के उपचार की एक श्रृंखला और सख्त आवश्यकता से उत्पन्न होने वाली जटिलता को, मुश्किल हैप्रक्रिया के अंत में किसी भी फ्लोरोसेंट अणु से मुक्त हो. यहाँ, हम कदम दर कदम निर्देश के साथ एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यह पिरान्हा नक़्क़ाशी, amine समूहों के साथ सतह functionalization, और अंत में खूंटी कोटिंग सहित सतह की सफाई को शामिल किया गया. एक खूंटी परत के एक उच्च घनत्व प्राप्त करने के लिए, हम उल्लेखनीय passivation की गुणवत्ता में सुधार है जो दो दौर खत्म हो गया, खूंटी अणुओं के साथ सतह के उपचार के लिए एक नई रणनीति का परिचय. किसी को उच्च गुणवत्ता की सतह passivation को प्राप्त कर सकते हैं ताकि हम प्रतिनिधि परिणाम के साथ ही एक महत्वपूर्ण कदम के लिए व्यावहारिक सलाह प्रदान करते हैं.
एक एकल अणु प्रोटीन अध्ययन करते समय यह प्रयोग किसी भी सतह प्रेरित प्रोटीन की खराबी या विकृतीकरण 1,2 से मुक्त है कि इतने सतह passivation की एक उच्च गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. ऐसे गोजातीय सीरम albumin के रूप में surfactants, के साथ इलाज के लिए एक कांच की सतह, सामान्यतः एकल अणु न्यूक्लिक एसिड पढ़ाई 3 के लिए प्रयोग किया जाता है, इसके passivation की डिग्री प्रोटीन के अध्ययन के लिए काफी अधिक नहीं है. बहुलक (पॉलीथीन ग्लाइकोल, खूंटी) के साथ लेपित एक गिलास सतह passivation प्रदर्शन 4-6 में बेहतर है. इस प्रकार, यह एक एकल अणु प्रतिदीप्ति अध्ययन 7-10 के लिए पेश किया गया था जब से एकल अणु प्रोटीन के अध्ययन के लिए सार्वभौमिक खेतों में बन गया है. बहुलक कोटिंग प्रक्रिया कई सतह उपचार 7,11,12 की आवश्यकता है. इसलिए, यह विस्तृत निर्देश के बिना पूरी प्रक्रिया का पालन करने के लिए मुश्किल है. अक्सर सतह passivation की डिग्री है, जो प्रोटोकॉल मैं पर निर्भर करता हैएस पीछा किया. यहाँ हम एक अणु प्रोटीन के अध्ययन के प्रमुख बाधाओं में से एक को हटा देगा जो कदम दर कदम निर्देश के साथ एक मजबूत प्रोटोकॉल उपस्थित थे. अवलोकन के लिए चित्रा 1 देखें.
इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
यह एमिनो silanization प्रतिक्रिया से पहले सतह हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए आवश्यक है. यह एक गिलास / क्वार्ट्ज सतह पर मुक्त हाइड्रॉक्सिल समूहों उत्पन्न करता है जो पिरान्हा नक़्क़ाशी के माध्यम से हासिल की थी. यह धीरे – धीरे नीचे चला जाता है सतह के hydrophilicity के बाद से समय की एक लंबी अवधि के लिए एच 2 हे या हवा या तो उजागर करने के लिए पिरान्हा etched सतह रखने के लिए नहीं की सिफारिश की है.
एनएचएस एस्टर खूंटी अणुओं प्रतिक्रियाशील रहे हैं. यह -20 डिग्री सेल्सियस में aliquots बनाने और नाइट्रोजन के तहत उन्हें स्टोर करने की सलाह दी है कमरे के तापमान पर APTES रसायन के शेल्फ जीवन छोटा है. यह हर महीने एक नया एक से बदलने की सलाह दी है.
इस प्रोटोकॉल का संशोधन
आप किसी भी व्यावहारिक कारण के लिए पिरान्हा नक़्क़ाशी उपयोग नहीं कर सकते हैं, तो आप समय की एक लंबी अवधि के लिए KOH का उपयोग खोदना सकता है (जैसे हेvernight), जो भी हाइड्रॉक्सिल समूहों उजागर कर देगा. इस वैकल्पिक दृष्टिकोण का ख़तरा स्लाइड गंभीर खरोंच के कारण कुछ recycles के बाद बेकार हो जाता है.
यह अक्सर फ्लोरोसेंट कार्बनिक पदार्थों 7 को नष्ट करने में प्रभावी है जो प्रोपेन मशाल का उपयोग कर एक गिलास / क्वार्ट्ज सतह को जलाने के लिए अभ्यास किया है. यह पिरान्हा नक़्क़ाशी के लिए बेमानी है क्योंकि यह प्रक्रिया इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं किया गया. इस प्रक्रिया के संभावित हाइड्रॉक्सिल समूहों के ऑक्सीकरण को बढ़ावा मिलेगा ध्यान दें. एक सतह KOH या पिरान्हा समाधान का उपयोग etched गया था इसलिए, एक बार इस प्रक्रिया से बाहर किया जा नहीं करना चाहिए.
7 से कम पीएच के साथ एक बफर एकल अणु इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है, खूंटी की रचना passivation की डिग्री कम कर देता है जो "ब्रश," को "मशरूम" से बदल जाता है. 7.0 से कम पीएच प्रयोग किया जाता है इसलिए, जब यह आगे disuccinimidyl tartarate <उपयोग कर सतह passivate करने की सिफारिश की हैसमर्थन> 7.
परिप्रेक्ष्य
इस काम के लिए उच्च गुणवत्ता की सतह passivation को प्राप्त करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान की गई है. इस प्रोटोकॉल प्रोटीन 14 के साथ ही सेल के अर्क के भीतर प्रोटीन परिसरों के साथ शामिल है और 15 immunoprecipitates रहे हैं कि एकल अणु प्रतिदीप्ति अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा. यह व्यापक रूप से इस तरह के बल स्पेक्ट्रोस्कोपी और टोक़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में 16 अन्य एकल अणु तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. यह भी एक सतह से 17 adsorbing से कोशिकाओं को रोकने के लिए उपयोगी हो जाएगा.
इस काम में प्रदान प्रोटोकॉल अपनी बहु कदम प्रक्रियाओं के लिए मांग की है. लिपिड खूंटी 8 और पाली lysine खूंटी 9 का उपयोग कर सतह passivation एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में उपलब्ध हैं. चूंकि, वे इसे लागू करने के लिए आसान है किसी भी रासायनिक प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है. हालांकि, passivation की डिग्री रासायनिक modif के माध्यम से हासिल की है कि उच्च के रूप में नहीं हैएक सतह के ication.
The authors have nothing to disclose.
एसडीसी, ACH, और मुख्य न्यायाधीश यूरोपीय अनुसंधान परिषद के माध्यम से अनुदान (ईआरसी STG-2012-309509) शुरू द्वारा समर्थित थे. जे-एम.एन. कोरिया की नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) (2011-0018198) द्वारा समर्थित किया गया था; और कोरिया के एनआरएफ के माध्यम से अग्रणी अनुसंधान केंद्र कार्यक्रम (2012-009586) विज्ञान, सूचना एवं संचार प्रौद्योगिकी मंत्रालय, और भविष्य की योजना (MSIP) द्वारा वित्त पोषित. यह काम भी ग्लोबल फ्रंटियर परियोजना (एच GUARD_2013-M3A6B2078947) के रूप में कोरिया की MSIP द्वारा वित्त पोषित BioNano स्वास्थ्य रक्षक के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया. YKL और जे-एचएच सियोल शहर, कोरिया के सियोल विज्ञान फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित थे. लेबल प्रतिनिधि प्रोटीन डा. Sua म्योंग से एक उदार उपहार था.
1. Slide preparation and cleaning | |||
Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24x32mm2, 22x40mm2, 24x50mm2 (No.1½, Rectangular) |
Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
H2O2 | Boom | 6233905 | Opened bottles should be stored at 4 °C. 1 L, hydrogen peroxide 30% |
H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
2. Coverslip cleaning | |||
Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | Store at the room temperature under N2 . Replace once in a month. 3-aminopropyl trimethoxysilane |
Flask (200mL) | VWR | Flask (200 mL) | Have one flask dedicated for aminosilanization. Pyrex flask |
Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da |
mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
6. Surface passivation (the second round) | |||
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
MS4-PEG | Pierce | 22341 | Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 mL DMSO. Store 20 mL aliquots at -20 °C. Short NHS-ester PEG, MW 333 Da |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
7. Assembling a microfluidic chamber | |||
Double sticky tape | Scotch | 10mm wide | |
Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
Neutravidin | Pierce | 31000 | Stock in 5 mg/mL in H2O at 4 °C. ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein |
Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/mL in H2O or T50 at 4 °C. |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |