Vi beskriver en fremgangsmåte for passivering en glassflate ved bruk av polyetylenglykol (PEG). Denne protokollen omfatter rengjøring overflate, overflaten funksjon, og PEG belegg. Vi introduserer en ny strategi for å behandle overflaten med PEG molekyler over to runder, som gir suveren kvalitet av passivisering i forhold til eksisterende metoder.
Single-molekyl fluorescens-spektroskopi har vist seg å være medvirkende til å forstå et bredt spekter av biologiske fenomener på nanoskala. Viktige eksempler på hva denne teknikken kan gi til biologiske vitenskaper er de mekanistisk innsikt på protein-protein-og protein-nukleinsyre interaksjoner. Når interaksjoner av proteiner er analysert på enkelt-molekyl nivå, er proteiner eller deres underlag ofte immobilisert på en glassflate, noe som åpner for en langsiktig observasjon. Dette immobilisering ordningen kan introdusere uønskede overflate gjenstander. Derfor er det viktig å passivere glassoverflaten for å gjøre den inert. Overflatebehandling ved hjelp av polyetylenglykol (PEG) skiller seg ut for sin høye ytelse i å forebygge proteiner fra ikke-spesifikt i samspill med en glassflate. Imidlertid er polymerbelegget prosedyren vanskelig, på grunn av komplikasjoner som oppstår fra en rekke overflatebehandlinger og de strenge krav om at en overflate måvære fri for eventuelle fluorescerende molekyler ved slutten av prosedyren. Her gir vi en robust protokoll med steg-for-steg-instruksjoner. Den dekker overflaterengjøring inkludert piranha etsing, overflatefunksjonalisering med amingrupper, og til slutt PEG belegg. For å oppnå en høy tetthet av et PEG sjikt, innfører vi en ny strategi for å behandle overflaten med PEG-molekyler i to omganger, som bemerkelsesverdig forbedrer kvaliteten på passivisering. Vi gir representative resultater samt praktiske råd for hver kritiske trinn, slik at hvem som helst kan oppnå høy kvalitet overflaten passivisering.
Ved utførelse av en enkelt-molekyler protein studie er det vesentlig å oppnå en høy kvalitet av overflate-passivering, slik at forsøket er fri for enhver overflate-indusert protein funksjonsfeil eller denaturering 1,2. Mens en glassoverflate ble behandlet med overflateaktive midler, slik som bovint serumalbumin, er ofte brukt for enkelt-molekyl nukleinsyre studier 3, er graden av dens passive ikke høy nok for protein-studier. En glassoverflate belagt med polymer (polyetylenglykol, PEG) er overlegen i passiveytelse 4-6. Dermed har det blitt universelt brukt for single-molekyl protein studiene helt siden den ble introdusert til en enkelt-molekyl fluorescens studie 7-10. Polymerbelegget fremgangsmåte krever flere overflatebehandlinger 7,11,12. Derfor er det vanskelig å følge hele prosedyren uten nærmere instruksjoner. Ofte er graden av overflatepassivering varierer, avhengig av hvilken protokoll is fulgt. Her presenterer vi en robust protokoll med steg-for-trinn-instruksjoner, som vil fjerne en av de store flaskehalsene av single-molekyl protein studier. Se figur 1 for oversikt.
Kritiske trinnene i denne protokollen
Det er viktig å gjøre overflaten hydrofil før amino-silanization reaksjon. Dette ble oppnådd via piranha etsing som genererer de frie hydroksyl-grupper på et glass / kvarts overflate. Det anbefales ikke å holde piranha etsede overflate eksponert for enten H 2 O eller luft i en lengre tidsperiode, siden det hydrofile egenskapene av overflaten synker gradvis.
NHS-ester PEG molekyler er reaktiv. Det anbefales å gjøre alikvoter og lagre dem under nitrogen i -20 º C. Holdbarheten av APTES kjemisk ved romtemperatur er kort. Det anbefales å erstatte den med en ny hver måned.
Modifikasjoner av denne protokollen
Når du ikke kan bruke piranha etsing for noen praktisk grunn, kan du etse bruker KOH for en lengre periode (f.eks overnight), vil der også gjøre hydroksylgrupper eksponert. Den fallgruve av dette alternativ tilnærming er at lysbildet blir ubrukelig etter noen resirkulerer grunn av alvorlige riper.
Det er ofte praktisert å brenne et glass / kvarts overflaten ved hjelp av propan lommelykt, som er effektiv i å eliminere fluorescerende organiske materialer 7. Denne prosedyren ble ikke inkludert i denne protokollen, fordi det er overflødig å piraja etsing. Legg merke til at denne fremgangsmåten vil kunne føre til oksydasjon av hydroksylgruppene. Derfor bør denne fremgangsmåte ikke utføres når en overflate er etset ved hjelp av KOH eller piraja løsning.
Når en buffer med pH-verdi lavere enn 7 brukes for enkelt-molekylet imaging, konformasjon av PEG endres fra "sopp" til "børste", hvilket reduserer graden av passivering. Derfor, når pH er lavere enn 7,0 er brukt, er det anbefalt å ytterligere passivere overflaten ved hjelp disuccinimidyl tartrat <sup> 7.
Perspektiver
Dette arbeidet har gitt en robust protokoll for å oppnå høy kvalitet overflaten passivisering. Denne protokollen vil være nyttig for single-molekyl fluorescens studier som er involvert med proteiner 14 samt protein komplekser innenfor celle ekstrakter og immunoutfellinger 15. Det vil være mye brukt for andre enkelt molekyl teknikker slik som kraft-spektroskopi og dreiemoment-spektroskopi 16. Det vil også være nyttig for å forhindre celler fra å adsorbere til en overflate 17..
Protokollen gitt i dette arbeidet er krevende for sine multi-trinn prosedyrer. Surface passivisering ved hjelp lipid-PEG 8 og poly-lysin PEG 9 er tilgjengelig som en alternativ tilnærming. Siden har de ikke krever noen kjemiske reaksjoner er det enkelt å implementere. Imidlertid er graden av passivering ikke er så høyt som det som oppnås ved kjemisk modification av en overflate.
The authors have nothing to disclose.
SDC, ACH, og CJ ble støttet av Starting Grants (ERC-StG-2012-309509) gjennom European Research Council. J.-MN ble støttet av National Research Foundation (NRF) (2011-0018198) i Korea; og Pioneer Research Center Program (2012-009586) gjennom NRF Korea finansiert av departementet for vitenskap, IKT, og fremtidig planlegging (MSIP). Dette arbeidet ble også støttet av Senter for BioNano Helse-Guard finansiert av MSIP av Korea som Global Frontier Project (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL og J.-HH ble støttet av Seoul Science Fellowship Program i Seoul City, Korea. Den merket Rep protein var en sjenerøs gave fra Dr. Sua Myong.
1. Slide preparation and cleaning | |||
Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24x32mm2, 22x40mm2, 24x50mm2 (No.1½, Rectangular) |
Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
H2O2 | Boom | 6233905 | Opened bottles should be stored at 4 °C. 1 L, hydrogen peroxide 30% |
H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
2. Coverslip cleaning | |||
Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | Store at the room temperature under N2 . Replace once in a month. 3-aminopropyl trimethoxysilane |
Flask (200mL) | VWR | Flask (200 mL) | Have one flask dedicated for aminosilanization. Pyrex flask |
Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da |
mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
6. Surface passivation (the second round) | |||
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
MS4-PEG | Pierce | 22341 | Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 mL DMSO. Store 20 mL aliquots at -20 °C. Short NHS-ester PEG, MW 333 Da |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
7. Assembling a microfluidic chamber | |||
Double sticky tape | Scotch | 10mm wide | |
Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
Neutravidin | Pierce | 31000 | Stock in 5 mg/mL in H2O at 4 °C. ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein |
Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/mL in H2O or T50 at 4 °C. |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |