Summary
Parabiotic sammenføyning av to organismer som fører til utvikling av en felles sirkulasjons-systemet. I denne protokollen beskriver vi den kirurgiske fremgangsmåten for å danne en parabiotic forbindelse mellom en villtype-mus og en konstitutiv GFP-uttrykkende mus.
Abstract
Parabiosis er en kirurgisk forening av to organismer slik deling av blodsirkulasjonen. Feste huden av to dyr fremmer dannelsen av microvasculature på stedet av inflammasjon. Parabiotic partnere dele sine sirkulerende antigener og dermed er fri for uønskede immunreaksjon. Først beskrevet av Paul Bert i 1864 en ble parabiosis kirurgi raffinert av Bunster og Meyer i 1933 for å forbedre dyre overlevelse to. I den aktuelle protokoll, blir to mus kirurgisk sluttet etter en modifikasjon av den Bunster og Meyer teknikk. Dyr blir koblet gjennom albuen og kneledd, etterfulgt av feste av huden gir fast støtte som hindrer at belastningen på huden sutureres. Heri, vi beskrive i detalj parabiotic sammenføyning av en allestedsnærværende GFP uttrykke mus til en vill type (WT) mus. To uker etter at inngrepet er de to separerte og GFP-positive celler kan påvises ved flowcytometrisk analyse i blodet sirkulererion av WT mus. Blodet kimerisme gjør det mulig å undersøke bidraget av de sirkulerende cellene fra ett dyr i den andre.
Introduction
Parabiosis, kirurgisk sammenføyning av to organismer, ble først beskrevet i 1864 av Paul Bert som en måte for å utvikle en modell for å studere felles sirkulasjons-systemer og besto av sammenføyning av huden og muskelveggene av to rotter en. Parabiosis fremmer dannelsen av microvasculature på stedet av inflammasjon 3 og har fått en rekke anvendelser innen fysiologiske undersøkelser, slik som hormonelle kommunikasjon mellom hypofysen og gonader, så vel som betydningen av nyrene hos hypertensjon 4.. Det er videre benyttet for å undersøke rekruttering og integrering av progenitorceller i neovaskularisering 5, vandring av hematopoietiske stamceller til 6, og lymfocytt handel 7, så vel som betydningen og kinetikk av sirkulerende inflammatoriske eller stamceller i tumormetastase 8,9, og nevrodegenerativ sykdom 10.
En vesentlig fordel med parabiosis løgnerved at de samarbeider dyrene har felles sirkulerende antigener, slik at cellemigrering og neovaskularisering uten å utløse en immunologisk reaksjon. Viktigere, Weissman et al. Har vist at parabiosis mellom mannlige og kvinnelige mus fører ikke til dannelse av anti HY antistoffer 11.
I den opprinnelige protokoll som er beskrevet av Paul Bert de to dyr ble sammenføyd gjennom kontakt mellom huden og muskelvegger 1. Denne metoden er imidlertid forårsaket betydelig belastning på dyrene og resulterte i høy dødelighet på grunn av infeksjon av såret. Siden da parabiosis teknikken har blitt revidert av flere grupper med den mest dominerende er protokollen foreslått av Bunster og Meyer i 1933 2. Deres metode inkludert sammenføyning av scapula leddene, kroppshulrom, og hud, tillater bedre støtte og mindre smerte for dyrene. På samme tid, er den nye fremgangsmåten resulterte i minimal postoperativ behandling og betydeligdelig redusert dødelighet. Den protokoll som er beskrevet her er en modifikasjon av den Bunster og Meyer teknikk som er mindre invasiv og tillater fastere sammenføyning. Nemlig, blir musene forbundet via albuen og kneledd, så vel som huden. Denne sammenføyning hindrer forlengelse av huden, og derfor forårsaker mindre smerte og komplikasjoner. Her beskriver vi sammenføyning av en vill type (WT) voksen mus til et konstituerende GFP uttrykke mus. Vi viser at to uker etter operasjonen kan vi oppnå 50% av blod kimerisme demonstrere effektiviteten av dette kirurgiske prosedyre for å opprette et felles sirkulasjonssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrestudier ble utført i henhold til retningslinjene for UCLA dyr omsorg og bruk komité og National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Varigheten av prosedyren beskrevet nedenfor er ca 45-60 min fra begynnelse til slutt.
En. Utarbeidelse av kirurgiske feltet
- Utfør prosedyren i en ren dyr operasjon rom.
- Utstyr: isofluran Vaporizer, Gaymer T Pumpe med varmepute.
- Sterile verktøy: to buede tang, fine saks, nål holder.
- Sterile hansker må brukes under hele prosedyren.
2. Fremstilling av dyr
- Plasser to hann-eller hunn-mus, fra samme genetisk bakgrunn, av samme vekt og størrelse i det samme bur og skjermen i minst to uker, for å sikre harmonisk sameksistens. Hunnmus er foretrukket på grunn av deres mindre aggressiv oppførsel.
- Anesthetize dyr vedved hjelp av en isofluran vaporizer. Plasser mus i en posi-Seal induksjonskammeret er koblet til isofluran fordamper (4-5% v / v). Etter anestesi indusert, overfører dyret til pelsbarberingsområdet, og opprettholde anestesi i løpet av fremgangsmåten gjennom en nesekonus koblet til isofluran (1,5-2% v / v). Påfør ophthalmic salve med en Q-tip til å forebygge tørre øyne.
- Plasser dyret i liggende stilling. Grundig barbere venstre side av musen plassert på venstre og høyre side av musen plassert på høyre starter på omtrent 1 cm over albuen til 1 cm under kneet.
- Aseptisk forberede de barberte områdene med å tørke godt (2-3x) med Betadine-gjennomvåt våtservietter etterfulgt av alkohol våtservietter. Plasser musene på en oppvarmet puten dekket av en steril pute.
- For analgesi, administrere Carprofen og Buprenorfin intraperitonealt eller subkutant i en dose på 10 mg / kg og 0,1 mg / kg hhv.
- Plasser dyrene på deres side, rygg mot rygg, med endjacent barberte områder vendt opp. For å unngå forurensning av det kirurgiske område, dekker mus med en steril drape utsette bare operasjonsområdet. Lag en liten drapere åpning for å holde steril når du utfører operasjonen. Vi gjorde drapere vinduet stort å ha en bedre visning under videoopptak.
Tre. Parabiosis
- Ved hjelp av en skarp saks, utføre langsgående hud-snittene til de barberte sider av hvert dyr som start 0,5 cm over albuen hele veien til 0,5 cm nedenfor kneleddet (figur 1). Etter innsnitt, forsiktig løsne huden fra det subkutane fascia ved å holde huden opp med et par av buede pinsett og separere fascia med et andre par for å lage 0,5 cm av fri huden. Utføre denne separasjon langs hele snittet.
- Begin sammenføyning ved å feste til venstre olecranon av et dyr mot høyre olecranon av det andre. Begge olecranons og kneledd er klart kan skilles følgende the hud innsnitt. For å lette sammenføyning, bøyes albuen til den første mus og passerer nålen av den ikke-absorberbare sutur 3-0 under olecranon. Tilsvarende, bøy albuen av andre mus og passerer samme sutur under den. Fest leddene tett ved en dobbelt kirurgisk knute.
- Koble kneledd følge samme prosedyre.
- Etter feste av leddene, kobler huden av de to dyr med en kontinuerlig absorberbar 5-0 Vicryl sutur som starter ventralt fra albuen mot kneet. For å hindre at huden sprekker og separasjon utføre et stramt sutur nedleggelse av huden i området rundt albuer og knær. Når ventral hud vedlegget er fullført, må du utføre en dobbel kirurgisk knute. Plasser mus i liggende stilling og fortsette sutur dorsally slutter med en dobbel kirurgisk knute. Kontroller kontinuiteten i sutur og bekrefter mangelen på åpninger.
- Administrer 0,5 ml av 0,9% NaCl subkutant i hver mus for å hindre dehydration.
4. Postoperativ Recovery
- Hold dyr på oppvarmet pad til bedring.
- Etter utvinning, gi smertestillende carprofen og buprenorfin. Gjenta intraperitonealt eller subkutant hver 24 og 12 timer henholdsvis, i 48 timer ved de samme doser som beskrevet ovenfor (trinn 2.5). Monitor dyr for tegn på smerte og nød som risting, slapphet, tygging av halen, buede ryggen, mangel på stell, etc. daglig i to uker.
- Profylaktisk, behandle mus med Sulfametoksazol / Trimetoprim mikstur i deres vannflaske 2 mg sulfa / ml 0,4 mg trim / ml for 10 dager for å hindre bakterieinfeksjoner.
- Hus hver parabiotic pair i et rent bur med monolittisk strø (f.eks papirhåndkle eller absorberende sterilt pad) for å hindre aspirasjon av strø. Returner dyrene til en sengetøy fylt bur når de er i stand til å opprettholde sternal recumbency med hodet opp. For å minimere belastningenfor nå for mat mens du justerer til parabiotic eksistens, plassere fuktet mat pellets på buret gulvet. Gi reirmateriale. 1-2 uker parabiotic mus har muligheten til å ambulate normalt på kirurgisk sammenkoblede for-og bakben-lemmer.
- Blood kimerisme skjer 10-14 dager etter operasjonen.
5. Bekreftelse og Reverse Prosedyre
- Etter to uker trekke blod fra halevenen til hver mus for flow-cytometrisk analyse for å bekrefte blod kimerisme (figur 3).
- Blodbearbeidelses for flowcytometrisk analyse: fortynne 2-3 dråper blod i 500 pl av 10 mM EDTA. Til 500 ul av 2% dekstran (fortynnet i PBS), blandes grundig og inkuberes ved 37 ° C i 30 min. Overfør supernatanten i et nytt rør, sentrifugering ved 1200 rpm i 5 min, og resuspender pelleterte celler i PBS (eller annen buffer) for flowcytometrisk analyse.
- Avhengig av eksperimentell design, kan parabiotic paret skilles ent senere tidspunkter. I vår erfaring, har vi opprettholdt parabiosed parene i opptil ni måneder uten noen komplikasjoner.
- Utfør omvendt prosedyre på et sterilt kirurgisk overflaten. Anesthetize mus ved å plassere dem i en induksjonskammeret er koblet til en fordamper isofluran (4-5%) og opprettholde anestesi med 1,5-2% isofluran, som beskrevet ovenfor (trinn 2.2).
- Fjern hår fra området rundt den første sutur og aseptisk forberede de barberte områdene som er beskrevet ovenfor (trinn 2.3, 2.4).
- For analgesi, gi carprofen og Buprenorfin intraperitonealt eller subkutant i en dose på 10 mg / kg og 0,1 mg / kg, henholdsvis.
- Dekk kirurgiske området med steril tildekking som beskrevet ovenfor (trinn 2.6).
- Ved hjelp av skarpe sakser, skiller musene gjennom et langsgående snitt langs side sutur og forsiktig løsne den nydannede fascia mellom de to mus med et par av buede tang. For å skille leddene, klippe knutene i suturkoble dem. Klipp av huden langs snitt for å oppnå glatte kanter og feste huden med en absorberbare kontinuerlig 5-0 belagt Vicryl sutur.
- For å hindre dehydrering, administrere 0,5 ml av 0,9% NaCl subkutant i hver mus. Hold dyr på oppvarmet pad til bedring.
- Etter gjenvinning, gjenta analgetisk administrasjon, karprofen (10 mg / kg) hver 24. time og buprenorfin (0,1 mg / kg) hver 12. time i 48 timer.
- For å hindre bakterieinfeksjoner behandle mus med Sulfamethoxazole / Trimethoprim oral suspensjon (2 mg sulfa / ml 0,4 mg trim / ml) i sin flaske i 10 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den forventede resultatet av parabiosis av to organismer er lik bidraget fra hvert dyr sirkulasjonssystemet til en felles blodsirkulasjon (fig. 2). Man kan enkelt kontrollere den vellykkede ekvilibreringsperiode av blod av parabiosed WT og GFP positive mus ved flowcytometrisk analyse. Her ble veneblod oppnådd fra halen til begge parabionts ved 2 uker etter kirurgi og ble fraksjonert for perifere blodceller (for å utelukke erytrocytter). Den fraksjon hematopoetiske-avledet cellefraksjon ble deretter analysert ved strømningscytometri for tilstedeværelse av GFP positive og WT-celler. I samsvar med tidligere studier, blod fra WT mus avslørte tilstedeværelse av kimerisme, som indikert med ca en halv GFP positiv og halv WT blodceller (53 vekt-% celler og 47% GFP-celler) (figur 3).
Figur 1. Parabiosis kirurgi:. snittstedet De laterale sider av bedøvede dyr blir barbert og huden langsgående snitt er utført (doted område) fra 0,5 cm over albuen til 0,5 cm nedenfor kneleddet.
Figur 2. Skjematisk fremstilling av parabiosis metoden. A) Bli med på en WT mus (til venstre) til en GFP positiv mus (til høyre). B) Omtrent to uker etter kirurgisk vedlegg, er ny microvasculature dannet på stedet der de to musene er koblet slik at han begynte av blodsirkulasjonen.
Figur 3. Blood kimerisme av parabiotic partnere. Flowcytometrisk analyse av blodprøve hentet fra WT parabiotic partner to uker etter kirurgisk sammenføyning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den parabiosis metoden diskutert her presenterer minimale tekniske problemer og resultater i lav dødelighet. Vedlegget av kne-og albueledd er en betydelig forbedring av Bunster og Meyer teknikk. Imidlertid forblir den prosedyre invasive dermed opprettholdelse av sterile betingelser gjennom hele operasjonen er avgjørende. For ytterligere å hindre infeksjon av det kirurgiske området, er det viktig at de parabiosed dyr som mottar en blanding av antibiotika, og kontrolleres regelmessig. For å sikre fast støtte og forhindre smerte, bør suturen forbinder albuer og knær omgir leddene i stedet for å passere gjennom vevet.
Som et alternativ til isofluran inhalering, kan bli indusert anestesi ved bruk av intraperitoneal injeksjon av ketamin / xylazin eller andre anestesimidler som er godkjent av institusjonelle utvalg. Fordelen ved å bruke isofluran er at den raskt kan fremkalle anestesi, og i betydelig grad redusere recovery tid. Videre kan graden av anestesi kontrolleres nøyaktig.
Parabiosis, noe som gjør det mulig for sirkulasjons-systemer fra to dyr til commingle og likevekt, er en kraftfull eksperimentell prosedyre for fysiologiske studier. Den presenterer flere fordeler til andre vanlig brukte teknikker som benmargstransplantasjon eller celleinjeksjon. Cell leveringsfremgangsmåter, til tider, å gi en kort vindu for å undersøke effekten av transplanterte celler. I tillegg øker immunsuppresjon risikoen for infeksjon og påfølgende sykelighet og dødelighet. Men med parabiosis kan man opprettholde en kimert sirkulasjon i lange perioder av gangen og studere sirkulerende faktorer (celler, cytokiner, etc.) uavhengig av deres opprinnelse. Dette systemet kan brukes til å bestemme betydningen av sirkulerende celler i sårheling, tumordannelse, aldring, regenerering og inflammatorisk respons, blant mange andre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Adriane Mosley og Libuse Jerabek (Stanford) for å få hjelp med den kirurgiske teknikken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane-Phoenix | Clipper | NDC 57319-559-06 | |
| Posi-Seal Induction Chamber | Molecular Imaging Products | AS-01-0530-SM | |
| Portable Anesthesia System | Molecular Imaging Products | AS-01-0007 | |
| Gaymer T Pump | Gaymar Industries, Inc | TP650 | |
| Warming Blanket (Heating pad) | Kent Scientific Corp | TP-22G | |
| Curved forceps | Roboz | RS-5101 | |
| Scissors | Fine Science Tools (FST) | FST 14063-09 | |
| Needle holder | FST | FST 12501-13 | |
| Electrical shaver | Oster | Golden A5 |
References
- Bert, P. Expériences et considérations sur la greffe animale. Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.
- Bunster, E., Meyer, R. K. Improved methods of parabiosis. Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).
- Waskow, C. Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation. Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).
- Finerty, J. C. Parabiosis in physiological studies. Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).
- Aicher, A., Heeschen, C. Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location. Circ. Res. 101, e102 (2007).
- Abe, S., Boyer, C., et al. Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).
- Donskoy, E., Goldschneider, I. Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice. J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).
- Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming. Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).
- Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. A transient parabiosis skin transplantation model in mice. Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., et al. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).
- Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice. Transplantation. 37, 3-6 (1984).
