Denne artikkelen beskriver kakerlakk ventral nerve ledningen disseksjon og ekstracellulære opptak fra Cercal nerve og connectives. Fremkalte responser er generert ved elektrisk stimulering av den Cercal nerve eller direkte mekanisk stimulering av cerci.
Kakerlakk ventral nerve ledningen forberedelse er en medgjørlig system for neuroethology eksperimenter, nevrale nettverk modellering, og teste de fysiologiske virkningene av insektmidler. Denne artikkelen beskriver omfanget av kakerlakk sensoriske modaliteter som kan brukes for å bestemme hvordan en insekt nervesystemet reagerer på miljømessige perturbasjoner. Vekten her er på flukt atferd mediert av cerci til gigantiske fiber overføring i Periplaneta americana. Dette in situ forberedelse krever bare moderat dissekere dyktighet og elektrofysiologisk kompetanse til å generere reproduserbare opptak av neuronal aktivitet. Peptider eller andre kjemiske midler kan deretter påføres direkte på nervesystemet i løsning med fysiologisk saltvann. Insekticider kan også bli administrert før disseksjon og flukt krets kan tjene som en proxy for en opphisset tilstand av det sentrale nervesystemet. I denne sammenheng analysene som beskrives heri ville også være nyttig å researchers interessert i lem regenerering og utviklingen av nervesystemet utvikling som P. americana er en etablert modellorganisme.
Det er mer enn 4000 kakerlakk arter, men bare om lag 30 er husholdning skadedyr. Kanskje den mest anerkjente er misnamed amerikansk kakerlakk Periplaneta americana som oppsto i Afrika, og finnes nå nesten overalt på kloden. I tillegg til den raske løpehastigheten 1 og unnvikende atferd, i tropene P. americana er i stand til uren 2,3.
De dominerende egenskapene til kakerlakk i sentralnervesystemet (CNS) er det segmenterte naturen og desentralisering av kontroll-prosesser 4,5. Hjernen, torakal og abdominal ganglia er bundet sammen av sammenkoblede interganglionic connectives å danne den ventrale nerveledning (VNC).
Ganglia på hvert segment er å integrere sentre. De er sammensatt av en ytre, kortikal regionen inneholdende celler som er ansvarlig for blod-hjerne-permeabilitet barriere like under dem, og somata av neuroner opprintende på at ganglion. Disse somata kan tilhøre interneurons, modulatory nevroner, eller motoriske nerveceller. De leverer axoner som forblir innenfor ganglion av opprinnelse (lokal interneuron), eller aksoner som prosjekt mellom ganglia av CNS (interganglionic interneurons) eller at terminere på perifer muskelceller (motoriske nevroner). De fleste somata er plassert ventralt eller ventrolateralt i ganglier cortex fem. Sammenkoblede, interganglionic connectives inneholder bare axoner og ingen neuronal celle organer.
Den neuropil av en ganglion inneholder gliacellene (neuroglia), axon traktater, bunter av aksoner og dendritter (neurites) av nerveceller. Den neuropil er blottet for nevronale celle organer. Dette er den regionen i ganglion hvor direkte synaptisk kommunikasjon mellom nerveceller og integrering av innganger oppstå.
Muligheten av den amerikanske kakerlakk P. americana å oppdage og plutselig svare på et rovdyr som nærmer seg (fot, håd, etc.) har blitt tilskrevet en refleks krets som består av cerci og gigantiske fiber system 6,7. Den cerci er et par av hornlignende, vind-sensitive strukturer som ligger på enden av bukhulen (figur 1). I P. americana ventral overflaten av hvert cercus inneholder ca 200 filiform (thread) hår som er organisert i 14 kolonner. Ni av disse kolonner kan gående identifisert i forskjellige dyr i henhold til responsegenskapene av den tilknyttede celle reseptoren og axon. Hvert hår er i en kontakt som gjør det mulig å bøye lettest i ett plan som er bestemt kolonne. Bevegelse av håret i en retning langs dens plan induserer en depolarisering i reseptoren celle og et utbrudd av aksjonspotensialer (APS) i sensorisk neuron. Bevegelse i motsatt retning hemmer eventuelle pågående spontane APs åtte. Den foretrukne planet av nedbøyning og retningen på responsen er forskjellig i hver kolonne. Dermed filiform hair-reseptor-komplekser er ikke bare ansvarlig for å detektere bevegelse av luft, men også for "koding", i form av aksesspunkter, fra hvilken luftstrømmen stammer fra. Behandling av denne informasjonen ved CNS resulterer i en "passende" flykte respons 6,7. Dette funksjonelle, søyle spesifisitet av de sensoriske hår er bevart fra dyr til dyr.
Reseptoren celle ifølge hvert filiform hår er ansvarlig for transduse den mekaniske avbøyning av håret i en neural hendelse (som resulterer i en serie-eller inhibering av AP i reseptoren cellens axon 9.. APS reise til terminalen abdominal ganglion (A6) via Cercal nerve XI, hvor de synapse med gigantiske axons av ventrale nerve ledningen (VNC). er de gigantiske axons antas å være ansvarlig for overføring og påfølgende eksitasjon av motoriske nevroner som resulterer i en flukt atferd 6,10,11.
Den atferds latency of flukten respons P. americana er en av de korteste av alle slags dyr 7.. Behavioral ventetid er tiden mellom ankomsten av en stimulus på en mechanoreceptor og igangsetting av en fluktrespons. I forsøk med høy hastighet kinematografi å registrere rømningsforsøk fra en angripende padde, ble kakerlakk observert å begynne sin tur vekk fra padde i ca 40 msek (tid fra begynnelsen av tungen utvidelse til kakerlakk bevegelse 7,12. Bruke kontrollerte vind puffs , atferds ventetid kunne bli redusert til 11 msek. Andre eksperimenter viste at et minimum vind puff hastighet på 12 mm / msek (med en akselerasjon av 600 mm / msek 2) kan fremkalle en flukt respons, mens enda lavere hastigheter (3 mm / sek) forårsaket sakte vandre kakerlakker å slutte å flytte 12.
Den sterke korrelasjonen som typisk eksisterer mellom gigantiske fiber systemer og flukt atferd har blitt godt dokumentert 13,14. I instanser hvor en bestemt celle er nødvendig og tilstrekkelig for å fremkalle en bestemt oppførsel cellen blir referert til som en kommando neuron 15,16. Giant interneurons (GIS) i vinden flukt krets av P. americana er ikke nødvendig at refleks. Dyr som har eksperimentelt ablasjon soldater fortsatt viser flukten atferd derfor disse soldater ikke anses kommando nevroner 17,18. Severing livmorhals connectives som er rostral til sensorisk-kretsen også påvirker atferden, noe som indikerer at synkende innspill fra hjernen har en effekt på rømningsretningen 19. Disse aspektene av fin kontroll og redundans er av vesentlig betydning for organismens overlevelse og er supplert med neurochemical modulasjon via biogene aminer 20.
The P. americana nerve ledningen forberedelse har vært en elegant modellsystem for neuroethologists løpet av de siste mange tiår starter med det banebrytende arbeidet til Roeder <sup> 21. Det tillater elevene å spille inn, vise og analysere primær sensorisk aktivitet, og de resulterende responser av gigantiske interneurons til deres innspill 22,23,24. I tillegg til å formidle ideen om at identifiserbare nevrale kretser ligger til grunn for atferdsmessige reaksjoner i miljøet, bør disse øvelsene innpode en forståelse for de biologiske bidrag fra denne felles husholdning pest.
En av grunnene til utstilling teknikker for denne klassiske forberedelse er at cerci systemet har vært og fortsatt er et aktivt forskningsområde i adressering spørsmål for utvikling av nevrale kretser samt spørsmål om synaptic reparasjon og regenerering 26-31. Enten metode for fremkaller aktivitet i kakerlakk ventral nerve ledningen kan brukes til å undersøke effekten av farmakologiske midler eller insektmidler på nervesystemet fungerer. Disse eksperimentene er gjort ved ganske enkelt å løse opp neuroactive kjemikalier i saltvann. Etter utveksling av denne oppløsning med den vanlige bademediet, kan det observeres endringer i fremkalt eller spontan aktivitet under innspilling fra connectives eller en motor nerve for å gi en jevn avlesning av den kjemiske effekt på CNS-funksjonen.
Som i alle nevrofysiologiske eksperimenter et vanlig problem er elektrisk støy. Sannsynligvis den største faktoren i signalkvaliteten for disse preparatene is sugeelektrode tetningen på nervevev. En tett forsegling som ikke helt trekker i Cercal nerve eller connective er ideelt. Opptakene kan også lages med to krok elektroder plassert under nerveledning og isolerende VNC med en blanding av mineralolje og petrolatum. Blandingen kan lastes inn i en sprøyte og utvist rundt nerve ledningen 32. Også en forsiktig disseksjon er like kritisk her som i alle CNS forberedelse. Noen kan synes det er lettere å få tilgang til CNS ved å dissekere ryggskjellaget. Selv om dette reduserer muligheten for å skade den ventrale nerveledning kan det være vanskelig å fjerne alt av indre organer ved hjelp av denne fremgangsmåten.
Det er ikke beskrevet her, men dette preparatet er mottagelig for intracellulære opptaket i de gigantiske interneurons 32,33. Hele nerve ledningen kan også fjernes for å få plass til flere opptak og stimulerende elektroder samtidig. Faktisk utforskning av antennal lapp, sopp body, og andre anterior CNS strukturer pågår fortsatt 34-35. Mens kakerlakk CNS fortsetter å belyse moderne nevrobiologisk forskning denne tilberedningen er enkel nok til å brukes i undervisning på vitenskapelig laboratorier.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Hyewon Cooper for illustrasjoner.
Reagent | |||
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | 182 silicone elastomer kit |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
NaH2PO4•2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
Material Name | |||
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt's brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |