Summary
Vi genetisk kode for den unaturlige aminosyre, p-azido-L-phenylalanin på forskellige målrettede positioner i GPCR'er og vise alsidigheden af azidogruppen i forskellige applikationer. Heriblandt en målrettet fototværbinding teknologi til at identificere rester i den ligandbindende lomme af en GPCR, og stedspecifik bioorthogonal modificering af GPCR'er med et peptid-epitop-mærke eller fluorescerende probe.
Abstract
For at lette strukturelle og dynamiske studier af G-protein-koblet receptor (GPCR) signalering komplekser, er nye fremgangsmåder forpligtet til at indføre informative prober eller etiketter i udtrykte receptorer, der ikke forstyrrer receptorfunktion. Vi anvendte amber codon undertrykkelse teknologi til genetisk encode unaturlig aminosyre, p-azido-L-phenylalanin (AZF) ved forskellige målrettede positioner i GPCR'er heterologt udtrykt i pattedyrceller. Alsidigheden i azidogruppen er illustreret her i forskellige programmer for at studere GPCRs i deres oprindelige cellulære miljø eller under vaskemiddel opløste forhold. Først viser vi et cellebaseret målrettet fototværbinding teknologi til at identificere de rester i den ligandbindende lomme af GPCR hvor en tritium-mærket lille molekyle ligand tværbindes til en genetisk kodet azido aminosyre. Vi derefter demonstrere stedsspecifikke modifikation af GPCRs af bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligatur reaktiontion, der er målrettet azidogruppen hjælp phosphinligander derivater. Vi diskuterer en generel strategi for målrettet peptid-epitop tagging af udtrykte membranproteiner i-kulturen og dens påvisning under anvendelse af en helcelle-ELISA fremgangsmåde. Vi viser endelig, at AZF-GPCR'er kan selektivt mærkes med fluorescerende prober. De drøftede metoder er generelle, idet de i princippet kan anvendes på enhver aminosyre position i enhver udtrykte GPCR at afhøre aktive signalsystemer komplekser.
Introduction
Heptahelical G-proteinkoblede receptorer (GPCR) omfatter en superfamilie af højdynamiske membranproteiner, der medierer vigtige og forskellige ekstracellulære signaler. I den klassiske paradigme, er receptor-aktivering kombineret med ligand-induceret konformationelle ændringer. 1 er 2 Nylige fremskridt i strukturel biologi GPCR'er billede betydelig indsigt i de molekylære mekanismer i transmembran-signalering. 3-5 imidlertid at forstå med større kemisk præcision funktionel mekanisme og strukturelle dynamik GPCR signalering, er en værktøjskasse af metoder der kræves for at inkorporere informative molekylære og kemiske prober til at afhøre aktive signalsystemer komplekser.
Til dette formål har vi tilpasset en metode til site-specifikt indføre ikke-eller minimalt forstyrrende sonder ind udtrykte receptorer baseret på unaturlig aminosyre (ULA) mutagenese hjælp amber codon undertrykkelse teknologi tidligere udviklet af Schultz og coworkers. 6. Vi optimeret ULA mutagenese metode til at opnå et højt afkast udtryk og mutagenesesystem for proteiner såsom GPCRs, som er vanskelige at udtrykke i andre end pattedyrceller mest heterologe systemer. Ved hjælp af en retvinklet manipuleret suppressor tRNA og udviklede aminoacyl-tRNA syntetase par for en specifik ULA, vi stedspecifikt introduceret UAAs i udtrykte target GPCRs. Den vellykkede inkorporering af UAAs, p-acetyl-L-phenylalanin (AcF), p-benzoyl-L-phenylalanin (BZF) og p-azido-L-phenylalanin (AZF) er blevet påvist i vores model GPCR'er - rhodopsin og human CC kemokinreceptor, CCR5. 7, 8
I princippet kan en ULA være genetisk kodet til enhver position inden for protein-sekvens, og denne egenskab er et uvurderligt biokemisk værktøj, da det giver mulighed for single-codon scanning af et mål GPCR. Vi fokuserer her specifikt på den alsidighed af ULA, AZF, som har en reaktiv azigøre del. Ud over at tjene som en unik infrarød (IR) probe, 8, 9 AZF kan også tjene som en fotoaktiverbar tværbinder ved omsætning med tilgrænsende primære aminer eller alifatiske hydrogenatomer. Derudover kan biologisk inert azidogruppen deltage som en selektiv kemisk håndtaget bioorthogonal mærkning reaktioner. Her præsenterer vi eksempler, der illustrerer de nyttige anvendelser af stedspecifik inkorporering af AZF i GPCRs, såsom målrettet fotokrydsbinding til at fælde en receptor-ligand-kompleks, og ændring af GPCRs ved bioorthogonal epitop tagging og fluorescerende mærkning af strategier.
Fotoaktiverbar reagenser er blevet brugt til at studere biologiske systemer siden 1960'erne. 10. I denne periode har en overflod af receptor-ligand tværbindingsprocesser eksperimenter blevet rapporteret til at studere GPCR komplekser, hvoraf de fleste er involveret brugen af photoaffinity ligander. 11, 12 Men disse programmer er teknisk begrænset, da de der krævere syntese af ligander, der bærer en tværbindingsgruppe. 13-15 Desuden med tværbindergruppe i liganden, det er udfordrende at identificere placeringen af crosslink på GPCR. Stedspecifikt indføre fototværbinding grupper som UAAs i proteiner ved hjælp af amber codon undertrykkelsesteknologi er et værdifuldt fremskridt. 16, 17 Vi udviklede en Fototværbindingen teknik til at identificere den bindende grænseflade på en receptor, som er involveret i dannelsen af en receptor-ligand-kompleks i levende celler ved at indføre fotolabile grupper på GPCR. 18, 19 Her beskriver vi forsøgsprotokollen og metode for dataanalyse for at anvende denne målrettede fotokrydsbinding teknologi til at identificere bindingssted af en lille-molekyle ligand tritieret maraviroc på CCR5. Denne metode udnytter den præcis kvantificering af den radioaktive håndtag på liganden, i over at fastholde den native kemiske struktur af liganden.
Fluorescens-baserede teknikker støtter præcis forståelse af det strukturelle grundlag af receptor-aktivering ved direkte sondering den konformationelle tilstand af receptoren. 20, 21 imidlertid teknikker besidder fleksibilitet til at indføre fluorescerende mærker i GPCR'er stedspecifikt er begrænsede. Vi er interesseret i at ansætte bioorthogonal kemisk modifikation strategier til at lette enkelt molekyle detektion (SMD) af GPCR signalering komplekser. 22. azidogruppen kan deltage i bioorthogonal kemier såsom Staudinger-Bertozzi ligatur, 23, 24 kobber-fri strain-fremmet azid- alkyn cycloaddition (SpAAC) 25 og kobber-katalyseret azid-alkyn cycloaddition (CuAAC). 26. Vi fokuserer her på Staudinger-Bertozzi ligeringsreaktion, der involverer den specifikke reaktion mellem en azid og en phosphin. Vi viser, at anvendelsen af to forskellige phosphinoxider derivater konjugeret til et peptid epitop (FLAG peptid) eller et fluorescerende mærke(Fluorescein) for at opnå stedspecifik modifikation af GPCRs.
Vi har tidligere optimeret betingelserne for site-specifik mærkning af rhodopsin AZF varianter ved hjælp af røntgen-krystalstruktur og dynamiske simuleringer til at vælge target sites, der er solvent udsat for. 27, 28 Vi illustrerede også muligheden for at opnå baggrunden-fri mærkning af Staudinger- Bertozzi ligering. 29. Vi viser her den generelle procedure anvendes til at opnå fluorescerende mærkning af en detergent-solubiliseret receptor, som er immobiliseret på en immunoaffinitets matrix og efterfølgende visualiseret ved i-gel-fluorescens. Derudover viser vi en nyttig udvidelse på denne mærkning strategi til at identificere holdninger gøres til genstand for mærkning på en receptor af ukendt struktur, CCR5. Dette udføres ved hjælp af en målrettet peptid-epitop tagging strategi, der bygger på bioorthogonal ændring af AZF-GPCR varianter i en celle-baserede semi-high throughput format. 30. Dennemetode udnytter flertrins afsløring egenskaber af et celleoverflade-ELISA for at overvåge mærkning begivenheder.
De metoder, vi diskuterer her, er generelle og kan i princippet anvendes på enhver GPCR indarbejdet med AZF hjælp af amber codon undertrykkelse teknologi. I de protokoller, der præsenteres her, vi detalje de skridt, der er involveret i pattedyrcelleekspression af receptorer indarbejdet med UAAs såsom AZF bruger den unaturlige aminosyre mutagenesefremgangsmåde og deres efterfølgende ansøgninger for at lette strukturelle og dynamiske studier af GPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Stedsspecifik Genetisk Indarbejdelse af naturlige aminosyrer i GPCRs
- Oprethold HEK293T celler i DMEM (4,5 g / L glucose, 2 mM glutamin) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære.
- Transficere celler dyrket til 60-80% konfluens i en 10 cm plade ved hjælp af Lipofectamine Plus reagens.
- Til 750 ul DMEM, tilsættes 10 pi Plus reagens, 3,5 ug GPCR cDNA (pMT4. Rho eller pcDNA 3.1. CCR5) indeholdende amber-stopkodon i en ønsket position, 3,5 ug af suppressor tRNA-cDNA (pSVB.Yam) og 0,35 ug mutant amino-acyl-tRNA-syntetase cDNA for p-azido-L-phenylalanin (pcDNA.RS). Inkuber ved stuetemperatur i 15 min. Også udføre en lignende transfektion ved hjælp af vægt-GPCR-cDNA (som ikke indeholder en amber-stopkodon) for at tjene som kontrol. Tilføj denne blanding til 750 ul DMEM med 17 pi Lipofectamine. Efter ækvilibrering 15 minutter ved stuetemperatur, sættersamlet volumen på 4 ml.
- Aspirer medier på 10 cm plade, gælder transfektion blanding til cellerne, og vende tilbage til 37 ° C i 5% CO2-atmosfære. Efter 4-6 timer, supplerer celler med 4 ml DMEM indeholdende 20% FBS og 1 mM AZF.
- Den næste dag udskiftes vækstmediet med DMEM indeholdende 10% FBS og 0,5 mM AZF.
- Harvest celler 48 timer efter transfektion, at analysere udtryk eller fortsætte til fotokrydsbinding eller procedurer for mærkning, der er beskrevet i de følgende afsnit.
- Bekræft ekspression af GPCR rav-mutanten i nærværelse af UAA i vækstmediet. Vi gør dette ved Western immunoblot detektion. Lyse cellepelleten i 1% (w / v) dodecyl-β-D-maltoside (DDM) i 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 100 mM NaCI i 1 time ved 4 ° C. Centrifuger lysatet ved 16.000 xg og løse supernatanten under reducerende betingelser ved SDS-PAGE. Overførsel til en PVDF-membran og udføre immunoblot analyse til påvisning af fuldlængde-receptor-ekspression ved hjælp af the 1d4 mAb (National Cell Culture Center), som genkender en manipuleret epitop ved C-terminalen af receptoren. 31.
2. Kortlægning af et ligandbindingssitet Brug Målrettet fotokrydsbinding
- 48 timer efter transfektion aspirat medier fra cellerne og erstatte med 4 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Vende tilbage til 37 ° C i 15 min.
- Opblande cellerne med 1x PBS og overføre til en Falcon rør. Centrifuger ved 1500 rpm i 2 min for at pelletere cellerne og aspireres supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 1x Hanks Buffered Salt Solution indeholdende 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,2% BSA og den tritierede ligand ved mættende bindende koncentration for den krævede tid og temperatur for at sikre receptor-ligand-kompleks.
- Overfør cellesuspension til en 24-brønds eller 96-brønds plade til fotoaktivering af AZF ved 365 nm (f.eks anvende en UV-A-lampe) i 15 minutter ved 4 ° C. Maintain pladen på is for at undgå prøve opvarmning og cellelysis.
- Overfør cellerne til et Eppendorf-rør, centrifugeres for at pelletere cellerne, supernatanten fjernes, og videre til analyse. Pellets kan opbevares ved -20 ° C til fremtidig brug.
- Resuspender cellepelletene i lysepuffer indeholdende 1% (w / v) DDM, 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, og proteaseinhibitorer. Efter 1 times inkubation ved 4 ° C, centrifugeres cellelysatet i 10 minutter ved 16.000 xg og overføre supernatanten til et nyt rør.
- Tilføj 1d4 mAb-sepharose 2B harpiks til supernatanten og inkuberes natten over ved 4 ° C til immunopurify GPCR ved hjælp af det konstruerede C-terminalen 1d4 mAb epitop. Næste dag vaskes perlerne gentagne gange med lysisbuffer. Eluere prøver med 1% SDS ved 37 ° C i 1 time med omrystning.
- Overføre en del af eluenten til et 15 ml hætteglas indeholdende scintillationsvæske og tælles på en beta-scintillationstæller at kvantificere mængden af specifik binding af den tritierede ligand the receptoren.
- Løse de tilbageværende 1d4 mAb renset eluatet ved standard gelelektroforese. Vi anvender en 4-12% SDS-PAGE-gel og derefter halvtør overførsel til en PVDF-membran til immunblotning. Vi har også omfatter en vognbane med standard protein stigen til at vejlede visuel tilnærmelse af molekylvægt.
- Bloker PVDF-membran med 5% mælk i TBS-puffer indeholdende 0,05% Tween-20. Probe membranen for at bekræfte fuld længde receptorekspression med 1d4 mAb efterfulgt af HRP-konjugeret anti-muse IgG sekundært antistof.
- Behandles med forøget kemiluminescens (ECL) reagens og udsætte membranen til autoradiografi film til at visualisere bånd.
- Skær membranen med et barberblad til at adskille hver prøve bane, efterfulgt af afskæring ved specifikke molekylvægtmarkører. Overføringsmembranen segmenter hætteglas indeholdende scintillationsvæske. Kvantificere mængden af tritium i hver membran segment ved tælling på en beta-scintillationstæller.
- Identificer den positivephotocrosslink med påvisning af tritium i tilsyneladende molekylvægt lig med summen af tallet GPCR og liganden.
3. Målrettet Epitop Mærkning og Cell Surface enzymmaerket Assay (ELISA)
- 24 timer efter transfektion vaskes cellerne med 1 ml 1x PBS og Trypsinisér med 1 ml 0,25% trypsin i 3 minutter. Supplér med 9 ml DMEM indeholdende 10% FBS og 0,5 mM AZF. Resuspender celler og tælle celletætheden. Vi bruger en standard hæmocytometer.
- Forbehandler en høj-bindende, klar bund 96-brønds plade med 100 ml 0,01 mg / ml poly-D-lysin per brønd. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur, vaskes gentagne gange med 1x PBS og lufttørres.
- Plade 200 pi af de transficerede celler med en tæthed på 6 x Oktober 4-08 x 10 4 celler / brønd på 96-brønds plade og vende tilbage til 37 ° C i 5% CO2-atmosfære.
- Næste dag forberede celler til mærkning. Vask forsigtigt tre gange med 100 ul / brønd 1x PBS to fjerne enhver AZF indeholder vækstmedier. Sikre celler forbliver klæbet, for eksempel ved anvendelse af PBS indeholdende Ca2 + og Mg2 +.
- Forbered 50-200 uM FLAG-triarylphosphin mærkningsreagens i 1x HBSS / PBS fra en bestand fastholdes på 5-20 mm i PBS. Anvend 60 ml til hver brønd (i tre eksemplarer for hver rav mutant) og vende tilbage til 37 ° C i 30 minutter til 4 timer. Vedligeholde et sæt af brønde uden label behandling i 1x HBSS / PBS. Også omfatte en vægt GPCR kontrol til at sammenligne med AZF-GPCR varianter.
- Vask cellerne 3 gange med 100 ul / brønd blokeringsbuffer BB (1x PBS, 0,5% BSA), til fjernelse af uomsat etiket fuldstændigt.
- Anvende 100 ul / brønd af 4% paraformaldehyd (fremstillet ud fra en stamopløsning i 1x PBS 16%) til cellerne. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur. Der vaskes tre gange med BB.
- Udfør standard celleoverflade-ELISA-protokol til at detektere mærket receptor og receptor ekspression. Inkuberes med primært antistof i 1,5 time på is efterfulgt af sekundær ettibody inkubation ved stuetemperatur i 1 time.
- Tilsæt 100 pi anti-FLAG-M2-antistoffet (fx 1:2000 fortynding af antistof fremstillet i BB) for at påvise FLAG peptid epitop af FLAG-triarylphosphin mærkningsreagens. Probe Også ikke-label behandlede brønde som en negativ kontrol. Læg anti-CCR5 2D7 (vi bruger en 1:500 fortynding) antistof til et separat sæt af brønde for at bestemme vægt eller AZF-GPCR celleoverfladeekspression.
- Vask cellerne tre gange med BB, og inkuberes med 100 pi HRP-konjugeret anti-muse IgG sekundært antistof (1:2000 fortynding).
- Vask forsigtigt cellerne fem gange med BB. Der tilsættes 50 pi detektion buffer: Amplex Red, 20 mM H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90-forhold), og der inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur. Saml spektrale data på et fluorescens-multi-brønds pladelæser ved λ ex = 530 og λ em = 590.
4.. Bioorthogonal Fluorescent Mærkning af en GPCR
- Lyse10 7 høstede celler udtrykker vægt eller AZF-Rhodopsin varianter i 1 ml solubiliseringsbuffer indeholdende 1% (w / v) DM, 50 mM HEPES eller Tris-HCI, pH 6,8, 100 mM NaCI, 1 mM CaCl2 og proteasehæmmere for 1 timer ved 4 ° C. Centrifuger cellelysatet ved 15.000 xg i 10 minutter og opsamling af fraktionen supernatanten.
- Tilsæt 100 pi 1d4-mAb Sepharose 2B harpiks til at fange receptor ved hjælp af manipuleret C-terminale 1d4 epitop. Der inkuberes i 12 timer ved 4 ° C. Resinen vaskes tre gange med 0,1% (w / v) DDM i 0,1 M natriumphosphatbuffer, pH 7,3.
- Tilføj 0,1 mM fluorescein-phosphin i et samlet volumen på 0,3 - 0,5 mL at mærke receptor immobiliseret på immunoaffinitets matrix (1d4-mAb Sepharose 2B). Der inkuberes i 12 timer ved stuetemperatur. Centrifuger og fjern supernatanten. Resinen vaskes for at fjerne uomsat etiket.
- Elueres mærkede receptor med 100 ml elueringsbuffer indeholdende 0,1% (w / v) DDM og 0,33 mg / ml nonapeptid (C9-peptidet mod 1d4 epitop)i 2 mM phosphatpuffer, pH 6,0 ved inkubation på is i 1 time.
- Løse mærkede prøver ved SDS-PAGE under reducerende betingelser. Vask geler kortvarigt i PBS og derefter visualisere mærkning af AZF-GPCR af i-gel fluorescens. For eksempel bruger en konfokal fluorescens-scanner med en 488 nm bølgelængde laser til at detektere receptor modificeret med fluorescein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi ansat den unaturlige aminosyre mutagenese metode til site-specifikt indføre molekylære prober i en GPCR hjælp af amber codon undertrykkelse teknologi. Ordningen i figur 1 vises de vigtigste trin i den metode og de forskellige anvendelser af at indarbejde den alsidige UAA, p-azido-L-phenylalanin (AZF), i GPCRs. Angivelse af AZF-GPCRs i pattedyrceller muliggør målrettet fototværbinding til ligander, og målrettet peptid-epitop tagging eller fluorescerende modifikationer af en GPCR via bioorthogonal mærkningsordninger kemi.
Fototværbindingen teknik kan bruges til at undersøge de strukturelle aspekter af GPCR-ligand-komplekser i levende celler (figur 1a). Repræsentative data fra et sådant eksperiment er vist i figur 2. 19. Her anvendte vi et radioaktivt mærket lille molekyle ligand tritieret maraviroc at identificere dets binding sidder.e på CCR5. I dette eksempel UV-bestråling på celler, der udtrykker AZF-CCR5 varianter præinkuberet med tritieret maraviroc resulterer i kovalent tværbundne komplekser, der kan identificeres ved hjælp af følsomme radioaktive mærke på liganden. Blandt de flere positioner på testet CCR5, I28azF og W86azF kunne photocrosslink til tritieret maraviroc som afbildet med væsentligt højere scintillationsdetektorer tæller (røde barer, nederste panel, figur 2). Wt-receptoren viste ingen tværbinding til radioaktiv ligand.
Bioorthogonal mærkningsordninger kemier kan anvendes til site-specifikt ændre AZF-GPCR varianter. Vi beskæftigede Staudinger-Bertozzi ligatur kemi til at mærke to GPCRs: CCR5 og rhodopsin hjælp phosphinligander derivater (Skema 1). En strategi indebærer målrettet epitop mærkning af en GPCR i levende celler ved hjælp af en peptid-konjugeret etiket (figur 1b). Vi viser et sådant eksperiment, hvor en FLAG-peptide-triarylphosphin mærkning reagens anvendes til site-specifikt og selektivt modificere AZF-CCR5 varianter. I figur 3 viser vi repræsentative data fra en følsom og multi-trins ELISA afsløring strategi, der anvendes til at identificere holdninger, der er mærket med FLAG-peptidet. 30 Blandt de positioner på CCR5 undersøgte blev alle AZF-CCR5 varianter udtrykkes på celleoverfladen (rød barer, figur 3), og omkring halvdelen af dem med succes gennemgik målrettet epitop tagging (blå søjler, figur 3). vægt CCR5 tjente som en negativ kontrol for epitop tagging, der udvises af manglen på anti-FLAG-signal. I en alternativ strategi, vi mærkede detergent-solubiliseret AZF-GPCR'er immobiliseret på en immunoaffinitets matrix, såsom anti-1d4 mAb konjugeret til sepharose 2B harpiks, med en fluorofor-konjugeret etiket (figur 1c). In-gel-fluorescensbillede vist i figur 4 viser den vellykkede fluorescerendemærkning af GPCR rhodopsin ved tre forskellige positioner, der indgår med AZF ved Staudinger-Bertozzi ligering ved hjælp af et phosphinderivat fluorescein. 29. Som forventet wt rhodopsin viste ingen baggrund mærkning som ses ved fraværet af et fluorescerende bånd ved den forventede molekylvægt af receptoren.
Skema 1. Staudinger-Bertozzi ligeringsreaktion mellem en triarylphosphin og et azid til dannelse af en stabil amidbundet addukt.
Figur 1. Scheme illustrerer stedspecifik inkorporering af en UAA (AZF), og dets applikationer til s . tudy GPCR'er Stedspecifik UAA mutagenese opnås ved co-transfektion af tre separate plasmider i mammale celler, som bærer: en udviklet ortogonal aminoacyl-tRNA-syntetase specifik for UAA, en ortogonal suppressor tRNA, der genkender en amber-stopkodon (UAG) og det gen, der koder for GPCR indeholder et TAG mutation ved en ønsket position. Celler dyrket i nærværelse af ULA udtrykker en fuld-længde GPCR med et site-specifikt introduceret AZF. Disse celler kan derefter (a), inkuberet med ligand og aktiveres med UV-lys til at identificere tværbindinger mellem en GPCR og dens ligand, (b), der anvendes til site-specifikt epitop-tag en GPCR i kultur med et peptid-konjugeret kemisk mærke, eller (c), opløst til at oprense GPCR'er, som derefter bioorthogonally modificeret med et fluorescerende mærke under betingelser, hvor receptoren er immobiliseret på et antistof-konjugeret sepharose harpiks.0588/50588fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede
Figur 2. Målrettet fotokrydsbinding af en GPCR til en tritieret ligand. Vist her er de repræsentative resultater fra en tværbindende eksperiment mellem AZF-CCR5 varianter og en tritiummærket lille molekyle ligand, maraviroc. Topplade: The Western immunoblot genereret efter en typisk eksperiment, der viser ekspressionen af de testede AZF-CCR5 varianter. De farvede segmenter fremhæve, hvor PVDF membran blev skåret til scintillationstælling og svarer til de fundne scintillationsdetektorer tæller afbildet i søjlediagrammet i det nederste panel. Den røde segment repræsenterer den forventede molekylmasse (ca. 40 kDa) af kovalent tværbundne kompleks mellem receptoren og liganden. Denrefore, forventer vi at detektere tritium i de segmenter, når AZF indføres ved en position i receptoren, som er i tæt nærhed til det ligandbindende lomme og kan danne en kovalent tværbinding med liganden. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Grunbeck, A., et al. Genetisk indkodede af foto-tværbindingsmidler kort bindingsstedet for en allosterisk lægemiddel på en G-protein-koblet receptor. ACS Chemical Biology 7, 967-972 (2012). Copyright (2012) American Chemical Society. Klik her for at se større billede
Figur 3. ELISA påvisning af målrettede epitop-tagging af en GPCR Topplade:. Celleoverfladeekspression af HEK 293T cells udtrykker AZF-CCR5 varianter og WT og mock-transficerede kontroller sonderet med anti-CCR5 mAb 2D7 bruge hele cellebaserede ELISA (røde søjler). Bundplade: Celler fra samme transfektion blev behandlet med 0,05 mM FLAG-triarylphosphin i 1 time i levende celler, og derefter kvantificeres ved efterfølgende ELISA hjælp af anti-FLAG M2 mAb at bestemme omfanget af peptid-epitop tagging på hver position (blå søjler) . Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien for to eller flere replikere datasæt. Genoptrykt (tilpasset) med tilladelse fra Naganathan, S., et al. Stedspecifik epitop tagging af GPCRs ved bioorthogonal modifikation af en genetisk kodet unaturlig aminosyre Biokemi DOI:. 10.1021/bi301292h (2013). Copyright (2013) American Chemical Society. Klik her for at se større billede
Figur 4.. Fluorescerende mærkning af rhodopsin AZF inkorporeret i forskellige positioner. Vægt og AZF-rhodopsin mutanter immobiliseret på en immunoaffinitets matrix mærket med fluorescein-phosphin. Oprensede prøver blev separeret ved 4-12% SDS-PAGE og i-gel-fluorescens viste billede blev taget med et konfokalt 488 nm laser fluorescens scanneren med en emission filtersæt er optimeret til fluorescein-detektion. Figur tilpasset fra Huber, T., et al. Bioorthogonal mærkning af funktionelle G-protein-koblede receptorer på genetisk indkodede azidogrupper. indgivet (2013). Klik her for at se større billede
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her en robust metode til stedspecifik inkorporering af en reaktiv sonde, AZF, i GPCRs og demonstrere tre nyttige anvendelser af dette værktøj til at studere struktur og dynamik GPCRs. Vores metode til site-specifikt inkorporere UAAs omgår et grundlæggende problem med en alternativ strategi baseret på kemisk mærkning 32, 33 eller fastgørelse photocrosslinkers 34 til en enkelt tilgængelig cystein mutant. Selv kemier, der er målrettet cystein thiolgrupper er blevet anvendt til at fastgøre fluorescerende prober, sådan strategi nødvendiggør dannelsen af en cystein-frit protein baggrund. Dette kan være begrænsende, eftersom alle GPCR'er besidder mere end én cystein, hvoraf mange kan være afgørende for at opretholde ordentlig receptorfunktion. Derfor muligheden for at indføre en UAA, der er modtagelig for kemisk modifikation eller kan aktiveres med UV-lys er yderst attraktiv.
Den kovalente reaktion af en photoactivatable tværbinder med et mål molekyle er afhængig af afstand og tilstødende sidekæder. Derfor kan disse prober anvendes til at identificere interaktioner, der ligger inden for en bestemt afstand fra tværbindingsmiddel, for eksempel, er benzophenon-baserede tværbindingsmidler foreslået at have en afhængighed af 3 Å afstand. 35. Tidligere introducerede vi både AZF og BZF en UAA indeholder en benzophenon reaktiv gruppe, til at identificere rester i en GPCR der er inden for en defineret afstand fra en fluorescein eller tritium-mærket ligand. 18, 19 Den generelle anvendelse af denne teknologi kun afhænger af tilgængeligheden af sådanne mærkede ligander og generering af rav mutanter af et mål GPCR. Derudover er der i teorien målrettet fototværbinding teknik kan anvendes til at identificere interaktioner mellem GPCR'er og deres andre bindingspartnere, såsom en G-protein-eller β-arrestin. Dataene opnået fra disse tværbindende studier kan bruges til at skabe en mere nøjagtig molecular modeller af GPCR signalering komplekser.
Adskillige bioorthogonal kemiske reaktioner er blevet beskrevet i litteraturen, at give mulighed for site-specifikke modifikation ULA rester. UAA, AcF for eksempel har en ketogruppe, der kan deltage i hydrazon eller oxim ligeringsreaktioner. 36, 37 Vi har tidligere sammenlignet ændring af ketogrupper og azidogrupper med biotinylerede og fluoresceinkonjugeret reagenser. 29 Vores observationer indikerede, at azido gruppe AZF er virkelig mere bioorthogonal end sin keto modstykke. Derfor har vi efterfølgende fokuseret på anvendelsen af Staudinger-Bertozzi ligering til at ændre to GPCR'er med et peptid epitopmærke eller et fluorescerende mærke. Det er dog bemærkelsesværdigt, at Staudinger-Bertozzi ligatur udviser sub-støkiometriske 38 og fattige kinetiske egenskaber af mærkning. Desuden phosphiner er meget modtagelige for luftoxidation. 25. Vi har observeret, at Staudinger-Bertozzi ligatur kun opnår 30% mærkning efter inkubation i 12 timer ved stuetemperatur. 29. Af disse grunde er vi i øjeblikket evaluerer alternative mærkningsordninger kemier såsom CuAAC og SpAAC til site-specifikt mærke AZF-GPCRs.
Omend ulemperne ved Staudinger-Bertozzi ligeringsreaktioner viser vi her brug af en levende-celle-peptid-epitop tagging strategi til at identificere positioner på et mål GPCR, som er tilgængelige for senere fluorescerende mærkning. Derudover denne epitop tagging strategi har mange andre nyttige anvendelser, såsom indførelse af et epitopmærke ved en enkelt modificeret rest i modsætning til at indsætte hele epitop ved at erstatte native sekvenser. Denne funktion er særlig vigtigt med GPCRs siden modificere længden og sekvensen af højkonserverede loop segmenter kunne dramatisk ændre funktion. Endelig skal vi også illustreret her proof-of-concept forsøg at mærke GPCRs med fluoroforer, maKongen dem egnede til enkelt-molekyle detektion eksperimenter.
Konklusionen er, at AZF er et alsidigt værktøj til studiet af struktur og funktion af GPCRs. Vi har vist, at AZF er stedspecifikt indarbejdes GPCR'er udtrykkes i pattedyrceller ved hjælp af amber codon suppression system. Dette giver mulighed for ændring af en GPCR på kun én enkelt holdning. Strukturen og funktionen af den mærkede receptor kan derefter vurderes enten i den native plasmamembranen miljø eller i et rengøringsmiddel. Vi er nu klar til at undersøge GPCR signalsystemer komplekser med fleksibiliteten i AZF sonden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker generøse støtte fra en række fonde og filantropiske donorer (se SakmarLab.org).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
