المسابر الجزيئية المشفرة وراثيا لدراسة G مستقبلات البروتين يقترن
Summary
نحن راثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين في مختلف المناصب المستهدفة في GPCRs وتظهر براعة المجموعة azido في تطبيقات مختلفة. وتشمل هذه التكنولوجيا photocrosslinking المستهدفة لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من النوع من الاختزال، ومواقع محددة من التعديل bioorthogonal GPCRs مع علامة الببتيد حاتمة أو التحقيق الفلورسنت.
Abstract
لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية للG-البروتين يقترن مستقبلات (GPCR) يشير المجمعات، ثمة حاجة إلى نهج جديد لتقديم تحقيقات إعلامية أو التسميات في المستقبلات التي أعرب عنها التي لا التشويش على وظيفة مستقبلات. كنا العنبر التكنولوجيا رامزة لقمع وراثيا ترميز الأحماض الأمينية غير طبيعية، ف azido-L-ألانين (ايه زد اف) في العديد من المناصب المستهدفة في GPCRs أعرب heterologously في خلايا الثدييات. ويتضح براعة المجموعة azido هنا في التطبيقات المختلفة لدراسة GPCRs في البيئة الخلوية المحلية أو في ظل ظروف solubilized المنظفات. الأولى، ونحن يبرهن على وجود خلية مقرها استهداف التكنولوجيا photocrosslinking لتحديد المخلفات في جيب ملزم يجند من حيث النوع من الاختزال crosslinked صغيرة جزيء يجند المسمى التريتيوم لترميز وراثيا حمض azido الأمينية. نحن ثم إثبات التعديل في مواقع محددة من GPCRs من قبل bioorthogonal شتاودينغر-Bertozzi ربط REACنشوئها يستهدف مجموعة azido باستخدام المشتقات الفوسفين. نناقش استراتيجية عامة لاستهداف علامات الببتيد حاتمة للبروتينات غشاء أعرب في الثقافة والكشف عنها باستخدام نهج يستند ELISA خلية كاملة. أخيرا، وتبين لنا أن AZF-GPCRs يمكن الموسومة بشكل انتقائي مع تحقيقات الفلورسنت. المنهجيات التي تمت مناقشتها هي عامة، في أن يتمكنوا من حيث المبدأ يمكن تطبيقها على أي موقف الأحماض الأمينية في أي أعربت النوع من الاختزال لاستجواب المجمعات إشارات نشطة.
Introduction
تشمل Heptahelical G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) والفصيلة من البروتينات الغشاء ديناميكية للغاية التي تتوسط إشارات خارج الخلية الهامة والمتنوعة. في النموذج الكلاسيكي، ويقترن تنشيط مستقبلات مع التغيرات متعلق بتكوين التي يسببها يجند. 1، 2 وقد وفرت التطورات الأخيرة في علم الأحياء الهيكلي للGPCRs البصيرة كبير على الآليات الجزيئية للإشارات عبر الغشاء. 3-5 ومع ذلك، ولكي نفهم بدقة أكبر الكيميائية آلية الوظيفية والهيكلية للديناميات النوع من الاختزال الإشارات، لا بد من أدوات نهج لدمج تحقيقات الجزيئية والكيميائية بالمعلومات لاستجواب المجمعات إشارات نشطة.
تحقيقا لهذه الغاية، ونحن تكييفها طريقة لموقع تحديدا إدخال غير الحكومية أو الحد الأدنى تحقيقات إقلاق إلى المستقبلات التي أعرب عنها على أساس الأحماض الأمينية غير طبيعية (UAA) الطفرات باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع رائدة من قبل شولتز وجoworkers. 6 ونحن الأمثل منهجية الطفرات UAA لتحقيق التعبير ذات الإنتاجية العالية ونظام الطفرات للبروتينات مثل GPCRs، التي يصعب التعبير عنها في أكثر الأنظمة الأخرى مغاير من خلايا الثدييات. باستخدام القامع المهندسة متعامد الحمض الريبي النووي النقال وتطورت أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال الزوج مخلقة لUAA محددة، قدمنا موقع UAAs تحديدا في GPCRs الهدف التعبير عنها. إدماج الناجح لUAAs، ف الاسيتيل-L-ألانين (ACF)، فقد ثبت ف بيروكسايد-L-ألانين (BzF)، وف azido-L-ألانين (ايه زد اف) في GPCRs نموذجنا – رودوبسين والبشرية CC مستقبلات chemokine، CCR5. 7، 8
من حيث المبدأ، وهي UAA يمكن ترميز وراثيا في أي موقف داخل تسلسل البروتين وهذه الخاصية هي أداة لا تقدر بثمن البيوكيميائية، لأنها تتيح احد كودون مسح وGPCR الهدف. ونحن نركز هنا على وجه التحديد على براعة من UAA، ايه زد اف، التي لديها رد الفعل عزيالقيام شاردة. بالإضافة إلى بمثابة الأشعة تحت الحمراء (IR) التحقيق فريدة من نوعها، 8، 9 ايه زد اف يمكن أيضا أن تكون بمثابة photoactivatable عبر رابط نتيجة للتفاعل مع الأمينات الأولية المجاورة أو الهيدروجين الأليفاتية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمجموعة azido خاملة بيولوجيا المشاركة بصفة انتقائية مقبض الكيميائية في التفاعلات وضع العلامات bioorthogonal. نحن هنا تقديم أمثلة توضح التطبيقات المفيدة التأسيس في مواقع محددة من AZF في GPCRs، مثل photocrosslinking تستهدف فخ مجمع مستقبلات يجند، وتعديل GPCRs بواسطة bioorthogonal علامات حاتمة واستراتيجيات وضع العلامات الفلورية.
وقد استخدمت الكواشف Photoactivatable لدراسة النظم البيولوجية منذ 1960s. (10) وفي هذه الفترة، تم الإبلاغ عن وفرة من التجارب يشابك مستقبلات يجند لدراسة المجمعات النوع من الاختزال، ومعظمها ينطوي على استخدام بروابط photoaffinity 11، 12 ومع ذلك، فإن هذه تطبيقات تقتصر من الناحية الفنية، لأنها تحتاج اليهاالتوليف (ه) من بروابط تحمل مجموعة يشابك. 13-15 وعلاوة على ذلك، مع شاردة crosslinker في يجند، فإنه يمثل تحديا لتحديد موقع تشعبي على النوع من الاختزال. إدخال موقع تحديدا الجماعات photocrosslinking كما UAAs إلى بروتينات باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع هو النهوض قيمة 16، 17 طورنا تقنية photocrosslinking التعرف على واجهة ملزمة للمستقبلات التي تشارك في تشكيل مجمع مستقبلات يجند في الخلايا الحية من خلال إدخال مجموعات عطوب بالضوء في GPCRs 18، 19 نحن هنا وصف بروتوكول تجريبي وطريقة تحليل البيانات لتطبيق هذه التكنولوجيا photocrosslinking المستهدفة لتحديد موقع ملزمة ليجند جزيء صغير، maraviroc معالج بالتريتيوم، على CCR5. تستفيد هذه الطريقة على تقدير دقيق للمقبض المشعة على يجند، بالإضافة إلى الإبقاء على التركيبة الكيميائية الأم ليجند.
التقنيات المعتمدة مضان دعم فهم دقيق لأساس الهيكلية للتنشيط مستقبلات عن طريق التحقيق مباشرة بتكوين الدولة من مستقبلات 20، 21 ومع ذلك، وتقنيات امتلاك المرونة اللازمة لإدخال العلامات الفلورية في GPCRs هي موقع على وجه التحديد محدودة. ونحن مهتمون في توظيف استراتيجيات التعديل الكيميائي لتيسير كشف bioorthogonal واحدة جزيء (SMD) من النوع من الاختزال المجمعات الإشارة. يمكن 22 المجموعة azido المشاركة في كيمياء bioorthogonal مثل شتاودينغر-Bertozzi ربط، 23، 24 خالية من النحاس وروجت سلالة أزيد- إضافة حلقية آلكاين (SpAAC) 25 والمحفزة النحاس وأزيد آلكاين إضافة حلقية (CuAAC) 26 ونحن نركز هنا على ربط رد فعل شتاودينغر-Bertozzi التي تنطوي على ردة فعل معينة بين أزيد والفوسفين. ونحن لشرح استخدام اثنين من المشتقات الفوسفين مختلفة، مترافق إلى حاتمة الببتيد (FLAG الببتيد) أو تسمية الفلورسنت(فلوريسئين) لتحقيق تعديل في مواقع محددة من GPCRs.
نحن الأمثل سابقا الظروف لوضع العلامات الخاصة بكل موقع من رودوبسين ايه زد اف المتغيرات باستخدام التركيب البلوري للأشعة السينية والمحاكاة الديناميكية لاختيار المواقع المستهدفة التي هي المذيبات يتعرض 27، 28 ونحن أيضا يتضح جدوى لتحقيق وضع العلامات خالية من الخلفية بواسطة شتاودينغر- Bertozzi ربط 29 نظهر هنا للإجراءات العامة المستخدمة لتحقيق وضع العلامات الفلورية من مستقبلات المنظفات solubilized الذي يجمد على مصفوفة immunoaffinity وبعد ذلك تصور من قبل مضان في هلام. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نبرهن على تمديد مفيدة عن هذه الاستراتيجية ووضع العلامات لتحديد مواقف قابلة للوضع العلامات على مستقبلات الهيكل غير معروف، CCR5. ويتم ذلك من يستخدم إستراتيجية علامات الببتيد حاتمة المستهدفة التي تعتمد على تعديل bioorthogonal من AZF-النوع من الاختزال المتغيرات في شكل شبه عالية الإنتاجية المستندة إلى الخلايا. هذا 30طريقة يستغل متعددة الخطوات خصائص الكشف عن ELISA سطح الخلية لرصد الأحداث ووضع العلامات.
المنهجيات نناقش هنا هي عامة ومن حيث المبدأ يمكن تطبيقه على أي النوع من الاختزال تدمج مع ايه زد اف باستخدام العنبر كودون تكنولوجيا القمع. في البروتوكولات المعروضة هنا نحن بالتفصيل الخطوات المتبعة في التعبير خلايا الثدييات مستقبلات تدمج مع UAAs مثل ايه زد اف باستخدام طريقة غير طبيعية من الأحماض الأمينية الطفرات وتطبيقاتها اللاحقة لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية للGPCRs.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف منهجية قوية لإدراجها في مواقع محددة من التحقيق على رد الفعل، ايه زد اف، في GPCRs وإظهار ثلاثة تطبيقات مفيدة من هذه الأداة لدراسة بنية وديناميات GPCRs. لدينا وسيلة لموقع تحديدا دمج UAAs تلتف مشكلة أساسية مع استراتيجية بديلة تقوم على وصفها كيميائيا 32، 33 أو رب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدعم السخي من العديد من المؤسسات والجهات المانحة الخيرية (انظر SakmarLab.org).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| [header] | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| [header] | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| [header] | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
