Summary
여기에서, 우리는 이미지 세포 계측법은 문화 숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 CFU 열거에 대한 대안으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
이러한 칸디다 알비 칸스, Histoplasma capsulatum, 그리고 크립토 neoformans를 같은 병원성 효모의 세포 발병 메커니즘의 연구는 일반적으로 단위 분석이나 유동 세포 계측법을 형성 식민지을 사용하여 효모 정량 뒤에 포유류의 호스트 또는 호스트 세포 (즉, 대 식세포)의 감염을 사용합니다. 콜로니 형성 단위 열거 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 방법 왔지만,이 기술은 성장을 비교할 때 특별한 관심입니다 고체 미디어 및 저 및 / 또는 변수 도금 효율에 약간의 곰팡이 종의 성장 둔화 등 단점과 한계를 가지고 야생형과 돌연변이 균주. 유동 세포 계측법 효모의 생존에 대한 신속한 정량 정보를 제공 할 수 있습니다, 그러나, 병원성 효모에 대한 유세포 검출 채택 높은 비용과 바이오 안전성 고려 등 실제적인 이유로 제한되었습니다. 여기에서, 우리는 이미지 기반을 보여대식 세포와 공동 배양 가능한 병원성 효모의 정량 Cellometer 비전 (생명 Nexcelom, LLC)를 사용하여 유세포 방법. Histoplasma capsulatum과 칸디다 H. :. 우리의 연구는 두 가지 인간의 곰팡이 병원균의 검출에 초점을 capsulatum는 대식 세포 phagosome에 내 복제하여 폐포 대 식세포를 정착, 그리고 여기, 우리는 양적 H.의 성장을 평가 이미지 세포 계측법과 함께 크리 딘 오렌지 /의 propidium 요오드 염색을 사용하여 RAW 264.7 대 식세포에서 capsulatum 효모. 우리의 방법 충실 단위 열거 형을 형성하는 전통적인 식민지로 측정 recapitulates 성장 동향,하지만 크게 증가 감도. 또한, 우리가 직접 C.의 GFP 발현 균주 라이브 대식 세포의 감염을 평가 알비 칸스. 우리의 방법론은 협회의 재치있는 중요한 인간의 곰팡이 병원균의 검출 및 정량화, 신속 정확하고 경제적 인 방법을 제공합니다H 호스트 세포.
Introduction
자신의 호스트 및 / 또는 숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 연구는 종종 시간 과정을 통해 또는 다른 감염 조건 하에서 가능한 진균 세포의 정량화가 필요합니다. 집락 열거 형 (CFU)이 가능한 진균 세포의 수를 측정 한하는 표준 방법입니다, 그러나,이 방법은 몇 가지 단점과 한계가있다. 첫째, 많은 곰팡이 종은 천천히 성장하고있다. 고체 매체에 표시 식민지의 성장은 크게 연구의 속도를 둔화, 1-3 주 소요될 수 있습니다. 여러 희석은 식민지의 셀 수있는 숫자를 보장하기 위해 도금해야하기 때문에 둘째, CFU 도금 동안 시료의 조작은, 힘든 과정입니다. 도금 효율은 물론 100 % 이하이기 때문에 셋째, CFU의 수는 도금 가능한 유기체의 수보다 일반적으로 낮다. 예를 들어, 동종 이형의 진균 병원체 Histoplasma capsulatum에 대한 도금 효율은 90 %로 높은 수 있지만, 같은 일상적으로 낮은 수30 %는 관련 곰팡이 dimorph의 Paracoccidioides의의 brasiliensis 1, 2 (10 %)도 낮다. 칸디다 albicans에 대한 도금 효율도 변화 3에 따라 달라질 수 있습니다. 많은 경우에, 그것은 죽은 및 / 또는 대사 비활성 셀의 존재와 농도를 결정하는 것이 유용 할 것이다 반면 마지막으로, CFU 분석은 고체 매체에 성장을 수립 할 수있는 유일한 라이브 적극적으로 나누어 세포를 차지하고 있습니다.
이전에 여러 가지 병원성 진균의 정량화를위한 유세포 방법은 4-6에 설명되어 있습니다. 그러나 공유 흐름 cytometers에 바이오 안전성 수준 2 (BSL2) 또는 BSL3 수준의 병원체를 사용하여 관련 바이오 안전성 봉쇄 문제로 인해,이 기술의 채택이 제한되었습니다. 유동 세포 계측법 마찬가지로, 이미지 세포 계측법 세포 정량의 민감하고 빠른 방법입니다. 그러나 이미지 세포 계측법은 비교 결과 7 적은 비용으로 수행 할 수 있습니다 -11. 여기, 우리는 호스트 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 이미지 세포 계측법을 수행하는 방법을 설명합니다. 우리는 두 사람의 곰팡이 병원균을 사용하여 우리의 방법을 보여줍니다 Histoplasma capsulatum 및 칸디다 균 albicans를 H.. capsulatum는 호흡기 질환을 일으키는 동종 이형의 진균 병원체, 인간, 그것은 같은 신진 효모 성장하고 폐포 대 식세포 내에서 복제 칸디다 때때로 칸디다증을 일으키는 인간의 공생 종입니다.. 우리는 이미지 세포 계측법 시각화 기능과 함께,이 효모의 빠른 정량화 할 수 있는지 보여줍니다.
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Protocol
1. H.와 대 식세포의 감염 capsulatum, C. albicans에
- 감염 이전에 16 시간, 24 잘 접시에 원하는 농도에 씨앗 식세포. 이 프로토콜에서는 잘 3.0 × 10 5 세포의 밀도가 /을 사용 하였다.
- 감염 원하는 다중성 (MOI)에서 로그 위상 성장 곰팡이 세포를 추가합니다. 이 프로토콜은 MOI의 범위 (- 5.0 0.2)을 수용 할 수 있습니다. H.와 RAW264.7 대식 세포의 감염 capsulatum, 우리는 MOI 0.2을 사용했다.
- 1.5 시간 식균 작용을 허용하는 다음, 세포 곰팡이를 제거하는 PBS와 대식 세포를 세 번 씻는다.
- 시료 분석 이전 시간에 원하는 번호를 품어. (우리의 실험 0.2) MOI 저에 감염된 대식 세포는 며칠 동안 가능한 남아 있고, 샘플마다 약 12 ~ 24 시간을 분석 할 수 있습니다.
2. 대식 세포 용해
- 대식 세포에서 곰팡이를 해방하려면, 미디어를 제거 PBS로 3 회 세척하고,0.5 ML 멸균 물을 추가합니다. 이러한 조건에서, 대식 세포 용해하고 곰팡이 세포는 그대로 유지됩니다.
- 상온에서 5 분 동안 품어.
- 얼음에 보관, 멸균 튜브에 해물을 전송합니다.
- 별도의 튜브에 20 ㎕의 해물을 전송 한 후 20 μL AO / PI 솔루션을 추가합니다. "샘플 준비 이미지 유세포 분석을위한"5 단계로 진행
3. CFU 도금
- 미디어 해물의 10 배 희석 (단계 2.3) 수행합니다.
- 각 희석 플레이트 (100) μL는 HMM-아가 플레이트에 복제합니다. 7-8일에 대한 5 % CO 2와 37 ° C에서 가습 챔버에서 번호판을 품어.
- 수동으로 최소 100 1,000 별개의 식민지의 최대 표시 판에 식민지를 계산합니다.
4. 라이브 식세포 내 균류의 시각화
- 라이브 식세포를 수집하려면, PBS로 세포를 3 회 세척한다. 4시 30 분 0.5 ML PBS과 부화를 추가 ° C.
- 조직 문화 우물에서 대 식세포를 제거하려면 부드럽게 여러 번 위아래로 피펫. 얼음에 보관, 멸균 튜브에 액체를 전송합니다.
- 별도의 튜브에 20 ㎕의 샘플을 전송 후, 20 μL AO / PI 솔루션을 추가합니다. "이미지 유세포 분석을위한 샘플 준비"5 단계로 진행합니다.
5. 이미지 유세포 분석을위한 시료 준비
- 철저하게 대상 시료를 피펫하고 일회용 세포 계수 챔버에 시료 20 μl를 전송합니다.
- 세포가 30 초 동안 챔버에 정착하도록 허용합니다.
- 이미지 cytometer에에 실을 계산 삽입합니다.
6. Cellometer 장비 설정
- 시스템에 VB-535-402 및 VB-660-502 그리고 그들은 제자리에 고정되어 있는지 확인하십시오 : 형광 광학 모듈을 삽입합니다.
- VB-535-402은 (475 nm의 여기, 535 nm에서 방출) 아 크리 딘 오렌지와 GFP 감지하는 데 사용됩니다.
- VB-660-502 (excitati540 nm에서 660 nm의 방출은)의 propidium 요오드 검출에 사용됩니다.
- 이미지 cytometer에 전원을 켜고 함께 제공되는 소프트웨어를 엽니 다.
7. Cellometer 소프트웨어 설치
- 사전 "분석 유형"및 분석 드롭 다운 메뉴에서 "셀 유형"을 선택합니다.
- 생존을 위해, 분석은 크리 딘 오렌지와의 propidium 요오드 검출에 최적화되어 있습니다.
- 칸디다 감염의 탐지를 위해, 분석은 GFP 감지에 최적화되어 있습니다.
- 상단의 "옵션"을 선택하고 "테이크 배경 이미지"를 클릭하고 작업을 완료 할 수 있습니다.
- "미리 시야 이미지"를 클릭하십시오.
8. 이미지 수집 절차
- 이미지 cytometer에로 준비된 샘플 챔버를 삽입합니다.
- 초점 노브를 사용하여 초점을 조정합니다.
- 일단 초점 "조사"를 클릭하고 이미지 수집 작업을 완료 할 수 있습니다.
- 레모일회용 계산 챔버를 쉬게하고 적절하게 폐기하십시오.
9. 이미지 데이터 분석
- 농도와 생존 능력 측정
- 계산이 완료되면, 대상 세포의 농도와 생존은 결과 페이지에 표시됩니다.
- 칸디다 감염 실험에서 GFP의 세포 인구 분석을위한 FCS 익스프레스 4로 데이터를 내보내려면 "내보내기"를 클릭하십시오.
- 칸디다 감염 세포의 FCS 인 분석
- FCS 인 4 줄거리 형광 히스토그램의 결과로. "NXDAT"파일을 가져옵니다.
- 칸디다 감염 세포의 인구 비율을 결정하는 히스토그램 세포 인구 게이트를 적용합니다.
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Representative Results
우리는 H.의 성장을 모니터링하는 Cellometer 비전 이미지 cytometer에 사용 대식 세포 capsulatum. RAW 264.7 세포는 H. 감염된 다양한 시간 지점에서 capsulatum 효모 세포는 샘플 이미지 기반의 유세포 분석에 의해 다음 AO / PI 염색을 실시 하였다. 병렬로, 샘플은 기존 CFU 열거 형으로 분석 하였다. 각 시점에서 시료는 대식 세포를 용해 물에 배양하였으며, 해방 효모 세포는 Cellometer 비전 소프트웨어 (도표 1A와 1B)에 의해 확인되었다. 각 시점 (그림 1C)에서 이미지 기반의 유세포 분석 및 CFU 열거 형에 의해 발견으로 우리는 가능한 효모의 농도에서 매우 유사한 경향을 관찰합니다. 예상대로, AO / PI 염색에 의해 감지 살아있는 효모의 절대 값 기호를 강조 CFU 분석에 의해 평가로 고체 배지에서 집락 형성 할 수있는 효모의 수보다 지속적으로 높게 나타났다가능한 만이 아닌 cultivatable 세포의 ificant 번호.
라이브 식세포 내의 곰팡이 세포의 시각화는 효모를 GFP - 표현 사용하여 수행 할 수 있습니다. 골수 유래 대 식세포 (BMDM가) C. 감염된 ADH1 발기인 12 (그림 2A)의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현의 albicans 효모 세포. GFP - C.와 BMDM 감염 0.1-10에 이르기까지 감염의 다중성 (MOI)에서 균 albicans 효모 감염된 대 식세포 (그림 2A)뿐만 아니라 감염된 대 식세포의 총 비율 (그림 2B)에서 GFP 강도의 증가 증가에 맞습니다.
그림 1. CFU 이미지를 기반으로 유세포 분석의 비교 H. 열거 RAW 264.7 대식 세포의 체외 감염시 capsulatum. () RAW 264.7 대 식세포가 H. 감염된 MOI 0.2에서 capsulatum 효모. 감염 후 24 시간 간격으로, 대식 세포가 용해하고 가능한 효모는 CFU 열거와 병렬 AO / PI 염색에 의해 평가되었다. (B) 대표 시야 (BR)와 FL1/FL2 (그린 / 레드) AO / PI 염색 H의 결합 된 이미지 . capsulatum는 용해 RAW 264.7 대 식세포에서 발표했다. 대형 PI 염색 RAW 264.7 대식 세포 (적색)을 제외하는 동안 분할 알고리즘은 형광 이미지 만 AO와 PI 긍정적 인 효모었다. 이미지는 10X 배율에서 캡처했습니다. (C) 효모 증식의 직접 비교가 아니라 AO / PI 염색 CFU 열거 형으로 평가 하였다. CFU 및 Cellometer 분석 수율 R 2 = 0.9927로 측정 성장 추세의 선형 회귀 분석./ files/ftp_upload/50599/50599fig1large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. C.의 GFP 발현 균주와 BMDM 감염의 정량 albicans에. () 캡처 시야 (BR) (상단)과 GFP-C의 형광 (가운데) 이미지 균 albicans는 MOI를 증가시 BMDMs 감염. 형광 강도의 히스토그램 번호 C의 증가를 나타내는 MOI가 증가함에 따라 GFP 형광 강도의 증가를 보여 알비는 BMDM 세포 (아래)와 관련. 소프트웨어는 감염되지 않은 통제 집단 (MOI = 0)으로 표시되는 기본 형광 강도의 선형 마커의 응용 프로그램을 기반으로 감염된 BMDMs을 확인했다. (B) 비율 infectioN MOI, MOI 증가함에 따라 감염 BMDMs의 증가를 보여주는.의 기능으로 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
이미지 세포 계측법은 사용자가 고품질 이미지를 캡처 전문 소프트웨어를 사용하여 세포의 빠른 정량화를 수행 할 수 있습니다. 미생물 병인의 분야에있는 이미지 세포 계측법의 채택에 하나의 잠재적 인 문제는 계산되는 미생물 포유류 숙주 세포를 포함한 세포의 혼합 인구에 존재하는 것입니다. 여기에서, 우리는 이미지 세포 계측법은 체외 대식 세포 감염시 가능한 병원성 효모의 정량화를 위해 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 우리의 방법론은 체외 대식 세포 감염 시험 법의 동안 관찰 곰팡이의 성장과 생존에 충실 recapitulates 동향뿐만 아니라, 기존의 CFU 분석 13에 비해 향상된 감도를 표시뿐만 아니라.
효모 세포의 정량화 CFU 열거 나 유동 세포 계측법 하나와 비교할 때 이미지 세포 계측법은 몇 가지 실질적인 이점을 제공합니다. CFUs을 도금 할 때, 실험실 노동자 플레이트 여러 dilut해야매우 노동 집약적 될 수있는 각 접시에 세포의 셀 수있는 숫자를 보장하기 위해 이온. 이미지 세포 계측법 여러 희석의 필요성을 없애줍니다. 이전에, 우리는 고체 매체에 식민지 형성은 종종 변수 것으로 나타났습니다, 및 이미지 세포 계측법은 농도가 13에 관계없이 세포의 열거를 가능하게하는 반면 매우 낮은 농도 곰팡이에 전혀 식민지를 형성하지 못할 수 있습니다. 매우 낮은 농도에서 곰팡이를 감지하고 계산하는 능력은 저용량 감염의 초기 단계에서 매우 유용 할 수 있습니다, 또는 정리하는 동안, 때 숫자와 생존 검출의 여백에있을 수 있습니다. 식민지가 표시되고 몇 일이 걸릴 수 있습니다 반면 또한, 이미지 세포 계측법에 의해 생성 된 데이터를 즉시 사용할 수 있습니다. 많은 곰팡이 종은 유동 세포 계측법에 의해 감지 될 수 있지만, 교차 오염의 가능성이 공유 시설 관심사입니다. 이 disposab 그대로 본 연구에 사용 된 계산 챔버, 바이오 안전성 측면에서 상당한 이점을 제공르와 급식. 작은 연구 실험실 11 중요 할 수있다 기존의 유동 세포 계측법과 비교했을 때 또한, 이미지 세포 계측법은 저렴한 가격과 작은 풋 프린트의 실제적인 이점을 제공합니다.
그것의 실제적인 장점 이외에, 효모 세포의 이미지 세포 계측법 정보를 제공 CFU 열거 할 수 없다고. 첫째, CFU 열거 정확하게 실시간으로 감염 실험에서 현재 가능한 곰팡이의 수를 나타냅니다하지 않을 수 있습니다 선택한 매체에 식민지의 성장을 수립 할 수있는 곰팡이를 감지 할 경우에만 할 수 있습니다. 또한, 고체 매체에 식민지의 성장을 수립 할 수있는 능력 실험 편견 (14)의 원천이 될 수 곰팡이의 야생형과 돌연변이 균주를 비교할 때 다를 수 있으며, 이러한 숨겨진 편견이 이미지 세포 계측법 및 CFU의 정량 비교에 의해 밝혀 될 수 있습니다 야생형과 돌연변이 균주. 특정 변형의 동작은 보 특징되면일 CFU 열거 및 이미지 세포 계측법, 우리는 그 이미지 세포 계측법은 곰팡이 정량의 대체 수단으로 사용할 수 있습니다 믿습니다.
일반적으로 이미지 세포 계측법 중 하나 한계는 유동 세포 계측법으로 많은 데이터 포인트를 수집을 허용하지 않는다는 것입니다. 이미지 cytometer에 캡처 한 이미지의 제한된 수의 정량적 데이터를 파생하기 때문에 시스템은 샘플 당 세포의 수백만 수천 수백에서 데이터를 수집하기 위해, 그것은 어렵습니다. 그러나,이 제한은 흐름 cytometer에와 유사한 데이터 포인트에 도달하기 위해 분석을위한 하나의 데이터 집합에 여러 개의 샘플을 그룹화하여 우회 할 수 있습니다. 우리는 또한 여기에 사용 된 AO / PI 염색법은 세포 생존 능력의 측정 방법 중 하나를 대표하고, 반드시 세포 활력 및 / 또는 특정 샘플 고체 배지에서 성장을 수립 할 수있는 능력을 의미하지 않는다는 것을 강조하고 싶습니다. 따라서 동안 우리의 방법은 그것이 효모의 라이브 / 데드 정량 손쉬운 방법을 제공합니다또한 FUN-1 15과 같은 세포 대사 지표와 함께 이미지 세포 계측법의 사용을 조사 할 재미있을 것입니다.
이미지 세포 계측법 소프트웨어를 식별하고 계산 관심의 세포 크기와 모양에 따라, 따라서, 이러한 매개 변수는 각 실험 기간 동안주의 깊게 설정되어 있는지 절대적으로 중요합니다. 새로운 효모 균주 이미지 세포 계측법을 수행 할 때, 우리는 하나의 첫 번째 매개 변수는 소프트웨어가 구별 할 수 있도록 설정되어 있는지 확인하기 위해 효모 플러스 숙주 세포의 혼합물을 계산에서 생성 된 데이터에 순수 효모 배양에서 생성 된 데이터를 비교하는 것이 좋습니다 두 종류의 세포.
미래에,이 작품은 이미지 세포 계측법을 통해 미생물을 검출하고 정량화하는 방법의 개발을위한 기초가 될 것입니다. 예를 들어 장기 균질에서 곰팡이를 검출하는 이미지 유세포 방법의 개발 분야에서 큰 도움이 될 것입니다. 또 다른 미래의 도전은 개발하는 것이미지 유세포 방법과 그것이 박테리아 세포의 정량화에 사용 될 수있는 소프트웨어를 evelop 및 수정. 광학 시스템, 디지털 카메라, 집중력과 생존이나 활력 측정을위한 더 빠른 방법을 제공 할 수있는 분야에서 형광 얼룩의 다양한 기능을 이미지와 박테리아 인구를 분석 이미지 cytometers에서 구현 될 수있는 발전과 함께 CFU 또는 광학 밀도 방법을 비교합니다. 요약하면, 여기에 제시된 작품 이미지 세포 계측법은 병원성 효모의 정량화를위한 중요한 방법임을 보여주는 증거의 개념이다. 이미지 기반 유세포 분석 소프트웨어의 복잡성은 매우 정량적 인 방법으로 숙주 세포와 병원성 균류 사이의 상호 작용을 분석 할 수있는 기회를 제공합니다. 이 기술은 곰팡이 병인 분야의 연구 질문의 범위를 해결하기 위해 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자 레오 리튬 잉 찬과 벤자민 파라는 Nexcelom 생명 LLC의 직원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience | ||
References
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