Bruk av bildecytometri for kvantifisering av patogene sopper i foreningen med Host Cells

Summary

Her viser kor bildecytometri kan anvendes for kvantifisering av patogene sopper i assosiasjon med vertsceller i kultur. Denne teknikken kan brukes som et alternativ til CFU oppregning.

Abstract

Studier av de cellulære patogenese mekanismer for sykdomsfremkallende gjærsopp som Candida albicans, Histoplasma capsulatum, og Cryptococcus neoformans ofte ansette infeksjon av pattedyr verter eller vert celler (dvs. makrofager) etterfulgt av gjær kvantifisering ved hjelp av kolonidannende enhet analyse eller flowcytometri. Mens kolonidannende enhet opplisting har vært den mest brukte metoden i felten, har denne teknikken ulemper og begrensninger, inkludert treg vekst av enkelte sopparter på faste medier og lav og / eller variabel Plating effektivitet, som er spesielt opptatt av når man sammenligner vekst av villtype og mutant stammer. Flowcytometri kan gi rask kvantitativ informasjon om gjær levedyktighet har imidlertid innføringen av strømningscytometrisk deteksjon for patogene gjærsopp vært begrenset for en rekke praktiske grunner, inkludert den høye prisen og biosikkerhet hensyn. Her viser vi et bilde-basertecytometrisk metodikk bruker Cellometer Vision (Nexcelom biovitenskap, LLC) for kvantifisering av levedyktige patogene gjærsopp i co-kultur med makrofager. Våre studier fokuserer på deteksjon av to menneskelige sopp-patogener: Histoplasma capsulatum og Candida albicans H.. capsulatum koloniserer alveolære makrofager ved å kopiere innenfor makrofag phagosome, og her har vi kvantitativt vurdere veksten av H. capsulatum gjær i RAW 264,7 makrofager ved hjelp acridine oransje / propidium iodide farging i kombinasjon med bildet cytometry. Vår metode trofast sammenfatter vekst trender målt ved tradisjonelle kolonidannende enhet opplisting, men med betydelig økt følsomhet. I tillegg har vi direkte vurdere infeksjon av levende makrofager med GFP-uttrykke stamme av C. albicans. Vår metodikk tilbyr en rask, nøyaktig og økonomiske midler for påvisning og kvantifisering av viktige menneskelige sopp-patogener i foreningen viddh vertsceller.

Introduction

Studier av patogene sopp i forbindelse med sine verter og / eller vertscellene ofte krever kvantifisering av levedyktige soppcellene over en tid kurs eller under ulike infeksjon forhold. Telling av kolonidannende enheter (CFU) er den standard metode hvor antallet levedyktige soppceller er blitt målt, er imidlertid denne teknikk flere ulemper og begrensninger. Først mange sopparter er saktevoksende. Vekst av synlige kolonier på faste medier kan ta 1-2 uker, betydelig bremse tempoet i forskning. For det andre er håndtering av prøvene under CFU Plating en arbeidskrevende prosess, siden flere fortynninger må være belagt for å sikre en tellende antall kolonier. For det tredje er det antall CFU vanligvis lavere enn antallet levedyktige organismer pletteres fordi pletteringen effektivitet er godt under 100%. For eksempel kan plating effektivitet for den dimorf patogen sopp Histoplasma capsulatum være så høyt som 90%, men er så lav som rutinemessig30% og er enda lavere (10%) for den relaterte sopp dimorph Paracoccidioides brasiliensis ^{1, 2.} Plating effektivitet for Candida albicans er også gjenstand for variasjon ^tre. Endelig står CFU analyse for bare levende og aktivt delende celler i stand til å etablere vekst på faste medier, mens det i mange situasjoner, vil det være nyttig for å bestemme tilstedeværelsen og konsentrasjon av døde og / eller metaboliske inaktive celler.

Tidligere har flowcytometrisk metoder for kvantifisering av flere patogene sopparter blitt beskrevet ^4-6. Men på grunn av biosikkerhet containment problemer involvert med å bruke biosikkerhet nivå 2 (BSL2) eller BSL3-nivå patogener på delte flowcytometere har vedtakelsen av denne teknikken vært begrenset. Som strømningscytometri, er bildecytometri en sensitiv og rask metode for celle kvantifisering. Imidlertid kan bildecytometri utføres ved en brøkdel av kostnaden med sammenlignbare resultater ^{7 -}11. Her beskriver vi metoder for å utføre bildecytometri av patogene sopper i assosiasjon med vertsceller. Vi viser våre metoder ved hjelp av to menneskelige sopp-patogener: Histoplasma capsulatum og Candida albicans H.. capsulatum er en dimorphic sopp patogen som forårsaker luftveissykdommer, hos mennesker, vokser det som spirende gjær og replikerer i alveolære makrofager Candida albicans er en menneskelig commensal arter som tidvis forårsaker candida.. Vi viser at bildecytometri tillater hurtig kvantifisering av disse gjær, sammen med visualisering evne.

Protocol

En. Infeksjon av makrofager med H. capsulatum, C. albicans

1. 16 timer før infeksjon, frø makrofager på ønskede tetthet i 24-brønners plater. I denne protokollen, ble en densitet på 3,0 x 10 ⁵ celler / brønn benyttes.
2. Legg soppcellene i log-fase vekst på et ønsket mangfold av infeksjon (MOI). Denne protokollen kan romme en rekke MOI (0,2 til 5,0). For infeksjon av RAW264.7 makrofager med H. capsulatum, brukte vi en MOI på 0,2.
3. Etter 1,5 timer for å tillate fagocytose, makrofager vaske tre ganger med PBS for å fjerne ekstracellulære sopp.
4. Inkuber i ønsket antall timer før prøveanalysen. Ved lav MOI (0,2 i vårt eksperiment), infiserte makrofager forbli levedyktig i flere dager, og prøvene kan analyseres omtrent hver 12-24 hr.

2. Macrophage Lysis

1. Å frigjøre sopp fra makrofager, fjerne media, vask tre ganger med PBS, ogtilsett 0,5 ml sterilt vann. Under slike forhold vil makrofager lyse og soppcellene vil forbli intakt.
2. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
3. Overføre lysate til sterilt rør, holde på is.
4. Overfør 20 mL lysate til et eget rør, deretter legge 20 mL AO / PI-løsning. Gå direkte til trinn 5: "Sample Preparation for Bilde cytometrisk Analysis"

3. CFU Plating

1. Utfør ti-fold fortynning av lysatene (fra trinn 2.3) i media.
2. Plate 100 ul av hver fortynning i duplikat på HMM-agarose plater. Inkuber platene i et fuktet kammer ved 37 ° C med 5% _CO2 i 7-8 dager.
3. Manuelt telle kolonier på plater som viser en minimum 100 og maksimum 1000 distinkte kolonier.

4. Visualisering av Sopp innenfor Levende Macrophages

1. Å samle levende makrofager, vaske cellene tre ganger med PBS. Tilsett 0,5 ml PBS og inkuberes i 30 min ved 4 ° C.
2. Slik fjerner du makrofager fra vev kultur brønner, forsiktig pipette opp og ned flere ganger. Overføre væske til sterile rør, holder på is.
3. Overfør 20 mL prøve til et eget rør, deretter legge 20 mL AO / PI-løsning. Gå direkte til trinn 5: "Sample Preparation for Bilde cytometrisk Analysis".

5. Sample Preparation for Bilde cytometrisk Analysis

1. Pipetter mål-prøven grundig og deretter overføre 20 prøve inn i kast celle tellekammer.
2. La cellene til å bosette seg i kammeret i 30 sek.
3. Sett tellekammer inn i bildet cytometer.

6. Cellometer Instrumentinnstilling

1. Sett fluorescens Optics Moduler: VB-535-402 og VB-660-502 inn i systemet og sørge for at de er låst på plass.
   1. VB-535-402 (eksitasjon ved 475 nm, emisjon ved 535 nm) benyttes til akridinoransje og GFP deteksjon.
   2. VB-660-502 (excitation ved 540 nm, emisjon ved 660 blir nm) som brukes for deteksjon propidium jodid.
2. Slå på bildet cytometeret og åpne den medfølgende programvaren.

7. Cellometer Programvareoppsett

1. Velg den forhåndsinnstilte "analysen Type" og "Cell Type" i analysen nedtrekksmenyen.
   1. For levedyktighet, er analysen optimalisert for akridinoransje og propidium jodid deteksjon.
   2. For påvisning av Candida albicans infeksjon, er analysen optimalisert for deteksjon GFP.
2. Velg "Valg" på toppen og klikk på "Take bakgrunnsbilde", og la handlingen er fullført.
3. Klikk på "Preview Bright-Felt Image".

8. Image Acquisition Prosedyre

1. Sett den tilberedte prøven kammeret inn i bildet cytometer.
2. Bruk fokusskruen og justere fokus.
3. En gang i fokus, klikk på «Greven», og la bildeinnlastingen operasjon for å fullføre.
4. Remove disponibel telling kammer og skaff det.

9. Image Data Analysis

1. Konsentrasjon og levedyktighet måling
   1. Når tellingen er fullført, blir konsentrasjonen og levedyktigheten til målcellene vist i produktet siden.
   2. Klikk på "Export" for å eksportere dataene til FCS Express 4 for cellepopulasjonen analyse av GFP i Candida albicans infeksjon eksperiment.
2. FCS Express analyse av Candida albicans-infiserte celler
   1. Importere ". NXDAT" filen til FCS Express 4 og plott resultatet i en fluorescens histogram.
   2. Påfør cellepopulasjonen gate til histogrammet for å bestemme befolkningen prosenter av Candida albicans-infiserte celler.

Representative Results

Vi brukte Cellometer Vision image cytometer å overvåke veksten av H. capsulatum i makrofager. RAW 264,7 celler ble infisert med H. capsulatum gjærceller og ved forskjellige tidspunkter ble prøver underkastet AO / PI farging etterfulgt av bildebasert cytometrisk analyse. Parallelt ble prøvene analysert av tradisjonell CFU telling. På hvert tidspunkt ble prøver inkubert i vann for å lysere makrofager, og de ​​frigjorte Gjærcellene ble identifisert ved Cellometer Vision programvare (figurene 1a og 1b). Vi observerer svært sammenlignbare trender i konsentrasjonen av levedyktige gjær som oppdages av image-basert cytometrisk analyse og CFU telling på hvert tidspunkt (figur 1c). Som forventet, var det absolutte antall levende gjær oppdaget av AO / PI farging gjennomgående høyere enn antall gjær i stand til koloni formasjon på fast medium som vurderes av CFU analyse, fremhever tegnificant antall levedyktige, men ikke-cultivatable celler.

Visualisering av soppcellene innenfor levende makrofager kan oppnås ved hjelp av GFP-uttrykke gjær stammer. Benmarg-deriverte makrofager (BMDM) var infisert med C. albicans gjærceller som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av ADH1-promotoren ¹² (fig. 2a). Infeksjon i BMDM med GFP-C. albicans gjær på multiplicities på infeksjon (MOI) som spenner 0,1 til 10 samsvarer med trinnvise økninger i GFP intensitet innen infiserte makrofager (figur 2a) samt total andel av infiserte makrofager (Figur 2b).

Figur 1. Sammenligning av image-basert cytometrisk analyse for å CFU oppregning av H. capsulatum under in vitro infeksjon i RAW 264,7 makrofager. (a) RAW 264,7 makrofager ble infisert med H. capsulatum gjær på en MOI på 0,2. På 24-timers intervaller etter smitte, ble makrofager lysert og levedyktige gjær vurdert av AO / PI farging parallelt med CFU telling. (B) Representant lysfelt (BR) og FL1/FL2 (grønn / rød) kombinerte bilder av AO / PI farget H . capsulatum løslatt fra lyserte RAW 264,7 makrofager. En segmentering algoritme telles bare AO og PI positive gjærsopper i fluorescerende bilder mens de store PI-farget RAW 264,7 makrofager (rød) er ekskludert. Bilder ble tatt i henhold til 10X forstørrelse. (C) Direkte sammenligning av gjær spredning som vurderes av AO / PI farging og CFU telling. Lineær regresjonsanalyse av de veksttrendene målt ved CFU og Cellometer analyse gir R ² = 0,9927./ Files/ftp_upload/50599/50599fig1large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

Figur 2. Kvantifisering av BMDM infeksjon med GFP-uttrykke stamme av C. albicans. (a) Captured lysfelt (BR) (øverst) og fluorescerende (midten) bilder av GFP-C. albicans smittet BMDMs på å øke MOI. Histogrammer av fluorescensintensiteter viser en økning i GFP fluorescens intensitet som MOI øker, noe som representerer en økning i antall C. albicans forbundet med BMDM celler (nederst). Programvaren identifisert infiserte BMDMs basert på anvendelse av en lineær markør ved baseline fluorescensintensiteten vises av infisert kontroll befolkningen (MOI = 0). (B) Prosent infection som en funksjon av MOI, som viser en økning i infiserte BMDMs som MOI øker. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Bilde cytometry tillater brukeren å fange bilder av høy kvalitet, og ved hjelp av spesialisert programvare, utføre rask kvantifisering av celler. Et potensielt utfordring til innføringen av bildecytometri innen mikrobiell patogenesen er at mikrobene som skal telles er tilstede i en blandet populasjon av celler, inkludert pattedyr-vertsceller. Her viser vi at bildecytometri kan anvendes for kvantifisering av levedyktige patogene gjær i løpet av in vitro-makrofag-infeksjon. Vår metodikk ikke bare trofast sammenfatter trender i soppvekst og levedyktighet observert under in vitro makrofag infeksjon analyser, men også viser forbedret sensitivitet i forhold til den tradisjonelle CFU analysen ^13.

Bilde cytometry tilbyr flere praktiske fordeler sammenlignet med enten CFU oppregning eller flowcytometri for kvantifisering av gjærceller. Når plating CFUs, laboratorium arbeidere må plate flere fortynnetioner for å sikre en tellbar antall celler på hver plate, som kan være svært arbeidskrevende. Bilde cytometry eliminerer behovet for flere fortynninger. Tidligere har vi vist at koloni formasjon på faste medier er ofte variabel, og ved svært lave konsentrasjoner sopp kan mislykkes i å danne kolonier i det hele tatt, mens bildecytometri muliggjør telling av celler, uavhengig av konsentrasjonen ^13.. Evnen til å oppdage og telle sopp ved svært lave konsentrasjoner kan være svært nyttig i tidlige stadier av en lav dose infeksjon, eller under klaring, når tall og levedyktighet kan være på marginen for gjenkjenning. I tillegg data generert av image cytometry er tilgjengelig umiddelbart, mens koloniene kan ta flere dager før de blir synlige. Mens mange sopparter kan oppdages ved flowcytometri, er muligheten for krysskontaminering en bekymring i felles fasiliteter. Den tellekammer brukt i denne studien gir en betydelig fordel i form av biosikkerhet, som det er disposable og selvforsynt. Videre tilbyr bildecytometri praktiske fordeler lavere pris og mindre plass sammenlignet med et tradisjonelt flowcytometri, som kan være viktig for mindre forskningslaboratorier ^11..

I tillegg til sine praktiske fordeler, gir bilde cytometry av gjærceller informasjon som CFU oppregning ikke kan. Først er CFU oppregning bare i stand til å detektere sopp som er i stand til å etablere kolonivekst på mediet valgt, som vil ikke nøyaktig representerer antall levedyktige sopp tilstede i en infeksjon eksperiment i sanntid. Dessuten kan evnen til å etablere kolonivekst på faste medier forskjellig ved sammenligning av villtype-og mutante stammer av sopp, som kan være en kilde til eksperimentell skjevhet ^14, og disse skjulte skjevheter kan avsløres ved sammenligning av bilde-cytometri og kvantifisering av CFU vill-type og mutante stammer. Når opptreden av en spesiell stamme er blitt karakterisert av Both CFU opplisting og bilde cytometry, mener vi at bildet cytometry kan brukes som en alternativ måte å sopp kvantifisering.

En begrensning av bildecytometri er generelt at den ikke tillater samling av så mange datapunkter som strømningscytometri. Siden bildet cytometeret stammer kvantitative data fra et begrenset antall av bildene, er det vanskelig for systemet å samle inn data om hundretusener til millioner av celler per prøve. Imidlertid kan denne begrensning kan omgås ved å gruppere flere prøver til ett sett av data for analyse for å oppnå tilsvarende datapunkter som et flowcytometer. Vi ønsker også å understreke at AO / PI farging metode som brukes her representerer én måte å måle av mobilnettet levedyktighet, og indikerer ikke nødvendigvis cellular vitalitet og / eller evne til å etablere vekst på fast medium i en gitt prøve. Derfor, mens vår metode gir en lettvint metode for levende / døde kvantifisering av gjær, detvil også være interessant å undersøke bruken av bilde cytometry i kombinasjon med cellenes stoffskifte indikatorer som FUN-1 ^15.

Bildecytometri programvare identifiserer og teller celler av interesse basert på størrelse og form, og derfor er det absolutt avgjørende at disse parametere er satt forsiktig under hvert eksperiment. Ved utførelse bildecytometri med en ny gjærstamme, foreslår vi at man først sammenligne data generert fra en ren gjærkultur til data generert fra telling av en blanding av gjær pluss vertsceller for å sikre at de parametere er satt slik at programvaren kan skille mellom de to celletyper.

I fremtiden vil dette arbeidet være grunnlaget for videre utvikling av metoder for å oppdage og kvantifisere mikrober via image cytometry. For eksempel, vil utvikling av billedopptak cytometriske metoder for å detektere sopp innen organ-homogenatene være til stor nytte i felten. En annen utfordring framover vil være å develop og avgrense bilde-cytometriske metoder og programvare slik at den kan brukes for kvantifisering av bakterieceller. Med fremme i optiske systemer, digitale kameraer, og et bredt utvalg av fluorescerende flekker i feltet, evnen til bildet og analysere bakterier befolkningen kan implementeres i bilde cytometere, som kan gi en raskere metode for konsentrasjon og levedyktighet eller vitalitet måling i forhold til CFU eller optisk densitet metoder. Oppsummert er arbeidet som presenteres her en proof-of-concept viser at bildet cytometry er en følsom metode for kvantifisering av patogene gjærsopp. Raffinement av image-basert cytometrisk analyse programvare gir mulighet til å analysere samspillet mellom verts celler og patogene sopp i en svært kvantitativ måte. Denne teknologien kan tilpasses for å løse en rekke problemstillinger innen sopp patogenesen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM	Life Technologies	11965-084
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
AO/PI Solution	Nexcelom Bioscience	CSK-0102
Disposable Counting Chamber	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100
EQUIPMENT
Cellometer Vision	Nexcelom Bioscience
Cellometer Vision Software	Nexcelom Bioscience