Summary
Her viser vi, hvordan billedet cytometri kan anvendes til kvantificering af patogene svampe i forbindelse med værtsceller i kultur. Denne teknik kan anvendes som et alternativ til CFU tælling.
Abstract
Undersøgelser af de cellulære patogenese mekanismer patogene gær såsom Candida albicans, Histoplasma capsulatum, og Cryptococcus neoformans almindeligvis anvender infektion af mammale værter eller værtsceller (dvs. makrofager) efterfulgt af gær kvantificering hjælp kolonidannende enhed analyse eller flowcytometri. Mens kolonidannende enhed tælling har været den mest anvendte metode i marken, denne teknik har ulemper og begrænsninger, herunder langsom vækst i nogle svampearter på faste medier og lave og / eller variabel plating effektivitet, som er af særlig bekymring, når man sammenligner vækst af vildtype og mutant stammer. Flowcytometri kan levere hurtige kvantitative oplysninger om gær levedygtighed, har dog vedtagelse af flowcytometrisk detektion for patogene gær været begrænset til en række praktiske årsager, herunder høje omkostninger og biosikkerhed overvejelser. Her viser vi et billede-baseretcytometrisk metode bruger Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) til kvantificering af levedygtige patogene gær i co-kultur med makrofager. Vore undersøgelser fokuserer på påvisning af to humane patogene svampe: Histoplasma capsulatum og Candida albicans H.. capsulatum koloniserer alveolære makrofager ved at replikere i makrofager fagosomet, og her, vi kvantitativt vurdere væksten af H. capsulatum gær i RAW 264,7 makrofager ved hjælp acridinorange / propidiumiodid-farvning i kombination med billedet cytometri. Vores metode trofast redegør væksttendenser som målt ved traditionel kolonidannende enhed tælling, men med væsentligt forøget følsomhed. Desuden har vi direkte vurdere infektion af levende makrofager med et GFP-udtrykkende stamme af C. albicans. Vores metode tilbyder en hurtig, præcis og økonomisk midler til detektion og kvantificering af vigtige menneskelige svampepatogener i samarbejde with værtsceller.
Introduction
Undersøgelser af patogene svampe i samarbejde med deres værter og / eller værtsceller kræver ofte kvantificering af levedygtige svampeceller over en kursus eller under forskellige infektion forhold. Tælling af kolonidannende enheder (CFU) er den standard metode, hvorved antallet af levedygtige svampeceller er blevet målt, men denne teknik har flere ulemper og begrænsninger. Først, mange svampearter vokser langsomt. Vækst af synlige kolonier på faste medier kan tage 1-2 uger, hvilket er betydeligt langsommere tempo for forskningen. For det andet, manipulation af prøver i løbet af CFU plating er en møjsommelig proces, da flere fortyndinger skal belagt for at sikre et tælleligt antal kolonier. Det tredje er antallet af CFU er typisk lavere end antallet af levedygtige belagt organismer fordi udpladningseffektiviteten er godt under 100%. For eksempel kan plating effektivitet for den dimorfe svampepatogenet Histoplasma capsulatum være så høj som 90%, men er rutinemæssigt så lav som30%, og er endnu lavere (10%) for den relaterede svampe dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Udpladningseffektivitet for Candida albicans er også genstand for variation 3.. Endelig CFU analyse tegner sig kun for levende og aktivt delende celler kan godtgøre vækst på faste medier, mens der i mange situationer vil det være nyttigt at bestemme tilstedeværelsen og koncentrationen af døde og / eller metabolisk inaktive celler.
Tidligere har flowcytometriske metoder til kvantificering af adskillige patogene svampearter blevet beskrevet 4-6. Men på grund biosikkerhed indeslutning problemer forbundet med at bruge biosikkerhed niveau 2 (BSL2) eller BSL3 niveau patogener på fælles flowcytometre, har vedtagelsen af denne teknik været begrænset. Ligesom flowcytometri, er billedet cytometri en følsom og hurtig metode til celle kvantificering. Dog kan billede cytometri udføres på en brøkdel af omkostningerne med sammenlignelige resultater 7 -11.. Her beskriver vi fremgangsmåder til udførelse billede cytometri af patogene svampe i forbindelse med værtsceller. Vi viser vores metoder ved hjælp af to humane patogene svampe: Histoplasma capsulatum og Candida albicans H.. capsulatum er en dimorf svampepatogen der forårsager respiratorisk sygdom, hos mennesker, vokser det som spirende gær og gentagelser inden alveolære makrofager Candida albicans er et menneske kommensale arter, der lejlighedsvis forårsager candidiasis.. Vi viser, at billedet cytometri tillader hurtig kvantificering af disse gærtyper, sammen med visualisering kapacitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Infektion af makrofager med H. capsulatum, C. albicans
- 16 timer før infektion, frø makrofager ved ønskede densitet i 24-brønds plader. I denne protokol, blev en tæthed på 3,0 x 10 5 celler / godt brugt.
- Tilføj svampeceller i log-vækstfase ved en ønsket flerhed af infektion (MOI). Denne protokol kan rumme en række MOI (0,2-5,0). Til infektion RAW264.7 makrofager med H. capsulatum, brugte vi en MOI på 0,2.
- Efter 1,5 timer for at tillade fagocytose, makrofager vaskes tre gange med PBS for at fjerne ekstracellulære svampe.
- Inkuber i ønsket antal timer før analysen. Ved lav MOI (0,2 i vores eksperiment), forbliver inficerede macrofagceller levedygtige i flere dage, og prøverne kan analyseres cirka hver 12-24 timer.
2.. Makrofag Lysis
- At befri svampe fra macrofagceller, fjerne medier, vaskes 3 gange med PBS, ogtilsættes 0,5 ml sterilt vand. Under disse betingelser vil makrofager lysere og svampeceller vil forblive intakt.
- Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Overfør lysat til sterilt rør, holde på is.
- Overfør 20 pi lysat til en separat rør, tilsæt derefter 20 ul AO / PI-løsning. Fortsæt direkte til trin 5: "Sample Preparation for Image Cytometric Analysis"
3.. CFU Plating
- Udfør ti-fold fortynding af lysater (fra trin 2.3) i medierne.
- Plade 100 ul hver fortynding i to eksemplarer på HMM-agaroseplader. Pladerne inkuberes i et fugtigt kammer ved 37 ° C med 5% CO2 i 7-8 dage.
- Manuelt regne kolonier på plader viser minimum 100 og maksimum 1.000 forskellige kolonier.
4.. Visualisering af Svampe inden Levende makrofager
- At indsamle levende makrofager, vaskes cellerne 3 gange med PBS. Tilsæt 0,5 ml PBS og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C.
- At fjerne makrofager fra vævsdyrkningsbrønde, pipettér forsigtigt op og ned adskillige gange. Overfør væsken til sterilt rør, holde på is.
- Overfør 20 ul prøve til et separat rør, tilsæt derefter 20 ul AO / PI-løsning. Fortsæt direkte til trin 5: "Sample Preparation for Image Cytometric Analysis".
5.. Prøveforberedelse for Image cytometri
- Pipette målprøven grundigt og derefter overføre 20 ul prøve i den disponible celletælling kammer.
- Lad cellerne til at bosætte sig i kammeret i 30 sek.
- Sæt tællekammer i billedet cytometeret.
6.. Cellometer Instrument Setup
- Sæt Fluorescens Optik Moduler: VB-535-402 og VB-660-502 i systemet, og sørg for de er låst på plads.
- VB-535 til 402 (excitation ved 475 nm, emission ved 535 nm) anvendes til acridinorange og GFP-detektion.
- VB-660 til 502 (excitatipå ved 540 nm, er emission ved 660 nm) anvendt til propidiumiodid detektion.
- Tænd for billedet cytometer og åbn den medfølgende software.
7.. Cellometer Software Setup
- Vælg den forudindstillede "Assay Type" og "Cell Type" i Assay rullemenuen.
- For levedygtighed, er assayet optimeret til acridinorange og propidiumiodid detektion.
- Til påvisning af Candida albicans infektion, udføres analysen optimeret til GFP detektion.
- Vælg "Indstillinger" i toppen og klik på "Take Background Image" og lade operationen at fuldføre.
- Klik på "Preview Bright-Field Image".
8.. Billede Acquisition Procedure
- Sæt den klargjorte prøve kammer i billedet cytometer.
- Brug fokuseringsknap og justere fokus.
- Når du er i fokus, skal du klikke på "Count" og lade billede erhvervelse operation for at fuldføre.
- Remove engangs tællekammer og bortskaffes på passende vis.
9.. Image Data Analysis
- Koncentration og levedygtighed måling
- Når optællingen er afsluttet, koncentrationen og levedygtighed targetcellerne vises i resultat side.
- Klik på "Eksporter" for at eksportere data i FCS Express 4 for celle population analyse af GFP i Candida albicans infektion eksperiment.
- FCS Express analyse af Candida albicans-inficerede celler
- Importer ". NXDAT" fil i FCS Express 4 og plot resultaterne i en fluorescens histogram.
- Påfør cellepopulation porten til histogrammet for at bestemme befolkningen procentdele af Candida albicans-inficerede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brugte Cellometer Vision billedet cytometer til at overvåge vækst H. capsulatum i macrofagceller. RAW 264.7-celler blev inficeret med H. capsulatum gærceller og på forskellige tidspunkter blev prøver underkastet AO / PI farvning efterfulgt af image-baserede cytometri. Sideløbende blev prøver analyseret ved traditionel CFU tælling. På hvert tidspunkt blev prøver inkuberet i vand for at lysere makrofager, og de befriede gærceller blev identificeret ved Cellometer Vision Software (figur 1a og 1b). Vi observerer meget sammenlignelige tendenser i koncentrationen af levedygtige gær som påvist ved image-baserede cytometri og CFU tælling på hvert tidspunkt (figur 1c). Som forventet, det absolutte antal levende gær detekteret af AO / PI farvning konsekvent var højere end antallet af gær kan koloni formation på fast medium, som vurderet af CFU analyse, som fremhæver tegnificant antal levedygtige, men ikke-dyrkbar celler.
Visualisering af svampeceller i levende makrofager kan opnås ved anvendelse af GFP-udtrykkende gærstammer. Knoglemarv-afledte makrofager (BMDM) smittet med C. albicans gærceller, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af ADH1-promotoren 12 (figur 2a). Infektion af BMDM med GFP-C. albicans gær på multipliciteter på infektion (MOI) spænder fra 0,1 til 10 svarede til trinvise stigninger i GFP intensitet i inficerede makrofager (figur 2a), samt den samlede procentdel af inficerede makrofager (figur 2b).
Figur 1. Sammenligning af image-baserede cytometri til CFU tælling af H. capsulatum under in vitro-infektion af RAW 264,7 makrofager. (a) RAW 264,7 makrofager inficeret med H. capsulatum gær ved en MOI på 0,2. Ved 24 timers intervaller efter infektionen blev makrofager lyseret og levedygtige gær vurderet af AO / PI farvning parallelt med CFU tælling. (B) Repræsentant brightfield (BR) og FL1/FL2 (grøn / rød) kombinerede billeder af AO / PI farves H . capsulatum frigivet fra lyserede RAW 264,7 makrofager. En segmentering algoritme tælles kun AO og PI positive gær i de fluorescerende billeder, mens de store PI-farvede RAW 264,7 makrofager (rød) er udelukket. Billeder blev taget til fange under 10X forstørrelse. (C) Direkte sammenligning af gær proliferation som vurderet af AO / PI farvning og CFU tælling. Lineær regressionsanalyse af væksttendenser målt ved CFU og Cellometer analyse udbytte R2 = 0,9927./ Files/ftp_upload/50599/50599fig1large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Figur 2. Kvantificering af BMDM infektion med en GFP-udtrykkende stamme af C. albicans. (a) Captured lysfelt (BR) (øverst) og fluorescerende (midten) billeder af GFP-C. albicans inficeret BMDMs på at øge MOI. Histogrammer for fluorescensintensiteterne viser en stigning i GFP-fluorescensintensitet som MOI stiger, hvilket udgør en stigning i antallet C. albicans forbundet med BMDM celler (nederst). Den software identificerede inficerede BMDMs baseret på anvendelse af en lineær markør på baseline fluorescensintensitet vises af inficerede kontrol population (MOI = 0). (B) Procent infection som funktion af MOI, som viser en stigning i inficerede BMDMs som MOI øges. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Billede cytometri tillader brugeren at fange billeder i høj kvalitet og ved hjælp af specialiseret software, udføre en hurtig kvantificering af celler. Én potentiel udfordring til vedtagelsen af billedet cytometri inden for mikrobiel patogenese er, at mikrober, der skal tælles, er til stede i en blandet population af celler, herunder pattedyrværtsceller. Her viser vi, at billedet cytometri kan anvendes til kvantificering af levedygtige patogene gær under in vitro makrofag infektion. Vores metodologi ikke blot trofast redegør tendenser i svampevækst og levedygtighed observeret under in vitro makrofag infektion assays, men også viser forbedret følsomhed i forhold til den traditionelle CFU-analysen 13..
Billede cytometri tilbyder adskillige praktiske fordele sammenlignet med enten CFU tælling eller flowcytometri til kvantificering af gærceller. Når plating CFUer, laboratorie arbejdere skal pladen flere fortynderenioner i for at sikre en tællelig antal celler på hver plade, som kan være meget arbejdskrævende. Billede cytometri eliminerer behovet for flere fortyndinger. Tidligere har vi vist, at kolonidannelse på faste medier er ofte variabelt, og ved meget lave koncentrationer svampe kan ikke danne kolonier overhovedet nogen, mens billedet cytometri muliggør tælling af celler uanset koncentration 13. Evnen til at opdage og tælle svampe ved meget lave koncentrationer kan være meget nyttigt i de tidlige stadier af en lav dosis infektion, eller under clearance, tal og levedygtighed, når kan være på marginen for afsløring. Derudover data genereret af billedet cytometri er tilgængelige med det samme, mens kolonier kan tage flere dage at blive synlige. Mens mange svampearter kan påvises ved flowcytometri, muligheden for krydskontaminering er en bekymring i fælles faciliteter. Den tællekammer anvendt i denne undersøgelse giver en betydelig fordel i form af biosikkerhed, da det er disposable og selvstændig. Endvidere billede cytometri giver de praktiske fordele ved lavere pris og et mindre fodaftryk sammenlignet med konventionel flowcytometri, som kan være vigtig for mindre forskningslaboratorier 11..
Ud over sine praktiske fordele, giver billede cytometri af gærceller oplysninger, som CFU optællingen ikke kan. Først, CFU tælling er kun i stand til at detektere svampe, der er i stand til at etablere kolonivækst på det valgte medium, som muligvis ikke nøjagtigt repræsenterer antallet af levedygtige svampe stede i en infektion eksperiment i realtid. Desuden kan evnen til at etablere koloni vækst på faste medier forskellige, når man sammenligner vildtype og mutant stammer af svampe, som kan være en kilde til eksperimentel skævhed 14, og disse skjulte bias kan blive afsløret ved sammenligning af billedet cytometri og CFU kvantificering af vildtype og mutant stammer. Når opførslen af en bestemt stamme er blevet karakteriseret af Both CFU tælling og image-cytometri, mener vi, at billedet cytometri kan anvendes som en alternativ måde svampe kvantificering.
En begrænsning af billedet cytometri i almindelighed er, at det ikke tillader indsamling af så mange datapunkter som flowcytometri. Da billedet cytometeret stammer kvantitative data fra et begrænset antal af optagne billeder, er det vanskeligt for systemet at indsamle data om hundreder af tusinder til millioner af celler pr prøve. Dog kan denne begrænsning omgås ved at gruppere flere prøver i et sæt af data til analyse for at nå tilsvarende datapunkter som et flowcytometer. Vi vil også gerne understrege, at AO / PI farvning metode, der anvendes her, repræsenterer en måde at måle af cellulær levedygtighed, og betyder ikke nødvendigvis, cellulære vitalitet og / eller evnen til at etablere vækst på fast medie i en given prøve. Derfor, mens vores metode giver en letkøbt måde af levende / døde kvantificering af gær, er detvil også være interessant at undersøge brugen af billedet cytometri i kombination med cellulære stofskifte indikatorer såsom FUN-1 15..
Billede cytometri software identificerer og tæller celler af interesse baseret på størrelse og form, og derfor er det helt afgørende, at disse parametre er indstillet omhyggeligt under hvert eksperiment. Ved udførelse billede cytometri med en ny gærstamme, foreslår vi, at man først sammenligne data genereret fra en ren gær kultur til data genereret fra tælle en blanding af gær plus værtsceller at sikre, at de parametre er indstillet sådan, at softwaren kan skelne mellem to celletyper.
I fremtiden vil dette arbejde være grundlaget for videre udvikling af metoder til påvisning og kvantificering af mikroorganismer via billedet cytometri. For eksempel vil udvikling af billedet cytometriske metoder til påvisning svampe inden orgel homogenater være til stor nytte i marken. En anden fremtidig udfordring bliver at develop og forfine billedet cytometriske metoder og software, således at det kan anvendes til kvantificering af bakterieceller. Med avancement i optiske systemer, digitale kameraer, og en bred vifte af fluorescerende pletter i marken, evne til billede og analysere bakterier befolkning kan implementeres i billedet cytometre, som kan give en hurtigere metode til koncentration og levedygtighed eller vitalitet måling i forhold til CFU eller optisk densitet metoder. Sammenfattende er det arbejde, der præsenteres her en proof-of-concept der viser, at billedet cytometri er en følsom metode til kvantificering af patogene gær. Den sofistikerede i image-baserede cytometri software giver mulighed for at analysere samspillet mellem vært celler og patogene svampe i en meget kvantitativ måde. Denne teknologi kan tilpasses til at løse en række forskningsspørgsmål inden for svampeangreb patogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne Leo Li-Ying Chan og Benjamin Paradis er medarbejdere i Nexcelom Bioscience LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience | ||
References
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
- Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
- Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
- Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
- Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
- Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
- Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
- Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
- Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
- Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
- Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).
