Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Published: November 7, 2013 doi: 10.3791/50608
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1School of Molecular Medical Sciences, University of Nottingham, 2Division of Drug Delivery and Tissue Engineering, University of Nottingham, 3Laboratory of Biophysics and Surface Analysis, University of Nottingham

Summary

ويمكن إدراج حيويا درجة الحموضة استجابة nanosensors سول جل في بولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) (PLGA) السقالات electrospun. السقالات الإبلاغ الذاتي المنتجة يمكن استخدامها لرصد الوضع الطبيعي من الظروف microenvironmental في حين زرع الخلايا على السقالة. هذا هو مفيد مثل بناء الخلوية 3D يمكن رصدها في الوقت الحقيقي من دون إزعاج التجربة.

Abstract

ويعتقد أن زراعة الخلايا في 3D على السقالات المناسبة لتقليد بشكل أفضل في الجسم الحي المكروية وزيادة التفاعلات خلية خلية. يمكن أن ينجم عنها من بناء الخلوية 3D غالبا ما تكون أكثر ملاءمة لدراسة الأحداث والتفاعلات الجزيئية خلية خلية من التجارب المماثلة درس في 2D. لخلق 3D الثقافات الفعال مع بقاء الخلية عالية في جميع أنحاء سقالة الشروط الثقافة مثل الأكسجين ودرجة الحموضة ضرورة أن يكون للرقابة بعناية كما التدرجات في تركيز تحليلها يمكن أن توجد في جميع أنحاء بناء 3D. نحن هنا وصف الطرق إعداد حيويا درجة الحموضة استجابة nanosensors سول جل وإدماجها في بولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) (PLGA) السقالات electrospun جنبا إلى جنب مع إعدادها لاحقة للثقافة خلايا الثدييات. السقالات استجابة درجة الحموضة يمكن استخدامها كأدوات لتحديد درجة الحموضة microenvironmental ضمن بناء الخلوية 3D. وعلاوة على ذلك، ونحن من التفصيل تسليم الحموضة nanose استجابةnsors على البيئة داخل الخلايا من خلايا الثدييات الذي كان مدعوما من السقالات electrospun PLGA النمو. موقع حشوية من nanosensors استجابة درجة الحموضة يمكن أن تستخدم لرصد درجة الحموضة داخل الخلايا (PHI) خلال التجريب المستمر.

Introduction

استراتيجية رئيسية في هندسة الأنسجة هو استخدام مواد حيويا لافتعال السقالات التي تشبه الأنسجة التي أريد لها أن تحل محل وقادر أيضا على دعم نمو الخلايا وظيفة 1،2 التشكل. يوفر السقالة الدعم الميكانيكية من خلال السماح مرفق الخلية والانتشار حتى الآن يسمح الهجرة الخلية في جميع أنحاء الفجوات لبناء الخلوية 3D. يجب السقالة تسمح أيضا لنقل كميات كبيرة من المواد الغذائية وخلية لا تمنع إزالة النفايات الأيضية 3.

وقد برزت Electrospinning كوسيلة من وسائل واعدة لتصنيع السقالات البوليمرية قادرة على دعم النمو الخلوي 4-6. الألياف electrospun محبوكة المنتجة هي مناسبة لنمو الخلايا كما أنها غالبا ما تكون مسامية تسمح والتفاعل خلية خلية، وكذلك الهجرة الخلية في جميع أنحاء الفجوات لبناء الخلوية 3D 7. فمن المهم رصد بقاء الخلية أثناء رانه الفترة من الثقافة وضمان بقاء الخلية يتم الاحتفاظ في كل أنحاء لبناء 3D. على سبيل المثال، وظروف ثقافة مثل الأكسجين ودرجة الحموضة تتطلب التحكم الدقيق، وتدرجات في تركيز تحليلها يمكن أن توجد داخل بناء 3D. المفاعلات الحيوية أو نظم الارواء يمكن استخدامها لتقليد في ظروف المجراة من تدفق الخلالي ونتيجة لنقل المواد الغذائية نتيجة زيادة وإزالة النفايات الأيضية 8. مسألة ما إذا كانت مثل هذه الأنظمة وضمان ظروف microenvironmental ثابتة يمكن معالجتها من خلال تقييم المكروية الخلوية في الوقت الحقيقي.

مقاييس المكروية الأساسية التي يمكن رصدها في الوقت الحقيقي وتشمل: درجة الحرارة، والتركيب الكيميائي للخلية وسائل الإعلام، وتركيز الأكسجين المذاب وثاني أكسيد الكربون، ودرجة الحموضة، والرطوبة. من هذه المقاييس، ودرجة الحرارة يمكن رصدها بسهولة أكثر باستخدام تحقيقات في الموقع. أساليب لرصد المقاييس المدرجة المتبقية عادة فيإزالة فوالذي من قسامة لأخذ العينات وبالتالي تعكير صفو زراعة الخلايا وتزيد من خطر التلوث. يجري البحث المستمر، وأساليب الوقت الحقيقي. عادة ما تعتمد أساليب الرصد الحالي على الصكوك التي بحث جسديا بناء الخلوية مثل جهاز الحموضة أو التحقيق الأوكسجين. ومع ذلك، يمكن لهذه الأساليب تطفلا تلف بناء الخلوية وتعكر صفو التجربة الجارية. رصد موسع تركيزات تحليلها ضمن بناء 3D يمكن تمكين مراقبة الوقت الحقيقي من الجوانب البيئية المختلفة مثل نضوب المغذيات 9. هذا من شأنه أن تسمح بتقييم توريد المواد الغذائية إلى مناطق أعمق داخل الهيكل وتحديد ما إذا كان يجري إزالة النفايات الأيضية بشكل فعال 10،11. الأنظمة التي تحاول معالجة مسألة الغزو تنطوي عموما على استخدام غرفة نضح الذي يمر مستنبت من خلال كل سفينة الثقافة وأجهزة الاستشعار الخارجية لرصد درجة الحموضة والأوكسجين والجلوكوز 12. الإعادة اهتماما متزايدا في تطوير أجهزة الاستشعار التي يمكن دمجها مباشرة في سفينة الثقافة التي لا تتطلب إزالة قسامة لأخذ العينات وعلى هذا النحو من شأنه أن يوفر الرصد في الموقع.

لمعالجة هذه النواقص لفي الموقع ورصد موسع الظروف microenvironmental أدخلنا الحليلة nanosensors استجابة إلى السقالات electrospun لإنتاج السقالات الإبلاغ الذاتي 13. تم إعداد السقالات التي تعمل أجهزة الاستشعار عن بعد من خلال رصد النشاط مضان من قبل، حيث كان الجهاز الاستشعار إما السقالة البوليمرية الفعلية التي أنشأتها electrospinning أو من خلال استخدام صبغ استجابة تحليلها والتي يتم تضمينها في البوليمر قبل تشكيل سقالة 14،15 . ومع ذلك، وهذه الأجهزة الاستشعار لديها القدرة على إعطاء المخرجات البصرية الخاطئة الناجمة عن تدخل محتمل من التحاليل الأخرى. استخدام جهاز الاستشعار ratiometric سوالفصل عن تلك التي أعدت في البروتوكول وصفها تحمل في طياتها احتمال للقضاء على هذه الآثار السلبية المحتملة وتوفير استجابة محددة لتحليلها في السؤال.

تم إعداد السقالات electrospun المقدمة هنا من الاصطناعية شارك في البوليمر بولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) (PLGA)، يتم اختيارهم بسبب وجود إدارة الغذاء والدواء (FDA) الموافقة، نظرا لخواصه القابلة للتحلل حيويا ومسار و سجل لدعم النمو والوظائف من مختلف أنواع الخلايا 16-18. الحليلة ratiometric nanosensors استجابة استعداد تستجيب لدرجة الحموضة. وnanosensors دمج اثنين من الأصباغ الفلورية في حيويا مصفوفة جل سول حيث الصبغة واحد، FAM تستجيب لدرجة الحموضة وغيرها، TAMRA بمثابة معيار الداخلية كما أنها ليست استجابة لدرجة الحموضة. علاوة على ذلك، مضان من كل من FAM وTAMRA يمكن تحليلها بشكل منفصل لأنها لا تتداخل بشكل كبير. تحديد نسبة EMI مضانssion كل من الأصباغ في موجات محددة يعطي استجابة درجة الحموضة مستقلة عن الظروف البيئية الأخرى. السقالات الإبلاغ الذاتي يمكن أن تسمح تقييم تكرار درجة الحموضة في الموقع وفي الوقت الحقيقي دون تعطيل نموذج 3D المتقدمة. لقد أثبتنا أن هذه السقالات هي قادرة على دعم مرفق الخلية والانتشار وتبقى استجابة لتحليلها في السؤال. حركية الحمضية من المنتجات في بنيات هندسيا يبقى سلوكه وعلى هذا النحو باستخدام السقالات استجابة درجة الحموضة يمكن أن يسهل إلى حد كبير مثل هذه الدراسات 19. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام السقالات الإبلاغ الذاتي لتطبيقات هندسة الأنسجة ويقدم الفرصة لنفهم تماما، ورصد وتحسين نمو 3D نموذج يبني الأنسجة في المختبر، وnoninvasively في الوقت الحقيقي.

كما تم تسليم nanosensors استجابة درجة الحموضة للبيئة داخل الخلايا الليفية مثقف على electrospun PLGA scaffolس. واستخدمت نسبة الانبعاثات مضان من الأصباغ لمراقبة PHI ومقارنة الإبلاغ الذاتي سقالة إدراج عنصر nanosensors درجة الحموضة. تسليم nanosensors إلى الخلايا المستزرعة في بيئة 3D قد تمكن من رصد تركيز الحليلة عميقة داخل بناء بطريقة غير تدميري. لذا nanosensors قد يكون أداة ناجعة التصوير لتقييم سلوك الخلية غير بشكل هدام في جميع أنحاء 3D يبني يسمح التحليل على المدى الطويل. يمكن فحص تركيز الحليلة من الخلايا الفردية داخل بناء 3D ضمان أنهم يتلقون تركيزات المغذيات والأكسجين الكافي. المعلمات عملية الرصد يمكن أن تساعد في تطوير تقنيات موحدة للنقل الجماعي الفعال من الأوكسجين والمواد المغذية. يمكن الجمع بين تقديم nanosensors على البيئة داخل الخلايا وإدماج nanosensors في السقالات البوليمرية للسماح بتقييم بقاء الخلية فضلا عن الأداء داخل سقالة 3D كانت constructs أثناء عملية نمو الأنسجة. هذا قد يؤدي إلى زيادة المعرفة من هذه التركيبات وتقدم في تصنيع بدائل الأنسجة ذات الصلة من الناحية البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

نظرة عامة

يصف القسم 1 إعداد الحموضة nanosensors استجابة وتوصيف استجابة nanosensor لدرجة الحموضة باستخدام الطيف مضان وحجمها باستخدام SEM.

يصف القسم 2 إعداد السقالات electrospun البوليمر وتوصيف مورفولوجيا وحجمها باستخدام SEM. يصف القسم 2 أيضا إعداد السقالات الإبلاغ الذاتي التي هي السقالات electrospun مع إدراج nanosensors استجابة درجة الحموضة. وتتميز الناتجة السقالات الإبلاغ الذاتي عن طريق وزارة شؤون المرأة لتقييم ما إذا كان أي تغيرات شكلية في ألياف electrospun حدث. يتم تقييم مضان من السقالات الإبلاغ الذاتي الناتجة عن nanosensors أدرجت بواسطة المجهر متحد البؤر.

يصف القسم 3 ثقافة الخلايا على سقالة electrospun والسقالة الإبلاغ الذاتي. يتم تعقيم السقالات الأولى في preparatايون للثقافة الخلية التالية التي يتم تقييمها السقالات لتحديد ما إذا كان التعقيم وثقافة من الخلايا تؤثر على القدرة مضان من السقالات الإبلاغ الذاتي. يصف البروتوكول أيضا تسليم nanosensors للخلايا التي يتم زرعها على السقالات electrospun. يستخدم Lysotracker صبغ لضمان أن لم تؤخذ nanosensors في مقصورات الحمضية الخلوية.

1. إعداد وتحليل درجة الحموضة المستجيبة Nanosensors سول هلام

1.1 إعداد الحموضة المستجيبة Nanosensors سول هلام

ملاحظة: هذا الإعداد يجب أن يؤديها في غطاء الدخان.

  1. إعداد fluorophores للاستخدام داخل nanosensors درجة الحموضة عن طريق إذابة 5 - (و6) carboxyfluorescein، succinimidyl استر (FAM-SE) (1.5 ملغ) في ثنائي ميثيل (DMF) (1 مل) في جولة القاع قارورة و6 carboxytetramethylrhodamine ، استر succinimidyl (TAMRA-SE) (1.5 ملغ) في DMF (1 مل) في جولة أخرى القاع قارورة.إضافة 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) (1.5 مل) إلى كل قارورة ويقلب تحت جو النيتروجين الجاف (21 درجة مئوية) لمدة 24 ساعة في الظلام أي التفاف العينات في احباط.
  2. إضافة كل من الأصباغ أعلاه (250 ميكرولتر) إلى خليط من الإيثانول (6 مل) وهيدروكسيد الأمونيوم (30٪ بالوزن، 4 مل) الواردة في قارورة جولة القاع ويقلب لمدة 1 ساعة (21 درجة مئوية).
  3. إضافة ببطء tetraethylorthosilicate (TEOS) (0.5 مل) إلى الخليط، مواصلة التحريك لمدة 2 ساعة أخرى. سوف يتحول الخليط غائم. وnanosensors يمكن جمعها عن طريق التبخر الدوارة. ويمكن تخزين Nanosensors في قارورة زجاجية في 4 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

    تنبيه: يجب أن يتم تنفيذ مزيد من التعامل مع nanosensors في شكلها الجاف في غطاء الدخان أو في حالة وزنها لهم يجب أن يرفق التوازن، على سبيل المثال في Weighsafe.

1.2 Nanosensor الاستجابة لدرجة الحموضة

  1. إعداد الحلول سورينسن في العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة تتراوح بين 5،5-8،0 قبل للانترنتنانوغرام نسب محددة من أحادى الصوديوم الفوسفات (0.2 م) والصوديوم ثنائي القاعدة فوسفات (0.2 M) حلول الأسهم. تحقق من درجة الحموضة النهائية باستخدام الرقم الهيدروجيني متر. إجراء أي تعديلات طفيفة على الرقم الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) (4 م) أو حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) (2 م).
  2. تعليق nanosensors درجة الحموضة في مخازن درجة الحموضة (5 ملغ / مل) من خلال عقد أولا السفينة التي تحتوي على حل nanosensor على دوامة لمدة 3 دقائق ثم غمر السفينة في ultrasonicator حتى يصبح الحل جزئيا (حوالي 5 دقائق). كرر هذه الخطوات لوقف تماما nanosensors في الحل.
  3. وضع الحل الأول إلى كفيت البصرية واستخدام موجات الإثارة من 488 نانومتر لمدة 5 - (و6) carboxyfluorescein (فام) و 568 نانومتر لمدة 6 carboxytetramethylrhodamine (TAMRA). جمع موجات الانبعاثات في 500-530 نانومتر لFAM و558-580 نانومتر لTAMRA باستخدام مطياف مضان.
  4. تغيير الحلول في كفيت البصرية بحيث يمكن ملاحظة درجة الحموضة في درجة الحموضة المختلفة ومواصلة جollecting أطياف الانبعاثات.
  5. حساب نسبة ماكسيما الانبعاثات المنتجة في كل قيمة الرقم الهيدروجيني لإنتاج منحنى المعايرة.

1.3 SEM من Nanosensors

  1. وضع عينة من nanosensors على الكربون المغلفة الإلكترون المجهر كعب وتفل معطف مع الذهب لمدة 5 دقائق تحت جو الأرجون.
  2. مراقبة عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM). خلال التصوير ضبط المسافة العمل، والجهد والتكبير للحد من شحن الإلكترون (الشكل 1).

2. إعداد وتحليل PLGA السقالات

2.1 Electrospinning السقالات PLGA

  1. في غطاء الدخان حل بولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) (PLGA) في ثنائي كلورو ميثان (DCM) (20٪ (وزن / وزن)) مع البيريدينيوم فورمات (PF) (1٪ (ث / ث)). وضع الحل في حقنة 10 مل مع إبرة حادة 18 G التعبئة وتناسب بشكل آمن إلى ضخ حقنة.
  2. تنأى طرف الإبرة 20 سم بعيدا عن 20سم × 15 سم الألومنيوم لوحة جمع.
  3. نعلق القطب من امدادات الطاقة عالية الجهد لغيض من حقنة والأرض على لوحة جمع الألومنيوم.

    وينبغي توخي الحذر حيث يستخدم الجهد العالي أي تتحول دائما على التيار الكهربائي من قبل التعامل مع أي من المعدات electrospinning: تنبيه.
  4. تقديم الحل باستخدام معدل تدفق مستمر من 3.5 متر / ساعة على 12 كيلو فولت لمدة 2 ساعة. سوف Electrospinning باستخدام هذه الظروف تعطي عمق السقالة من حوالي 60 ميكرون.
  5. ترك السقالة في غطاء الدخان لمدة 24 ساعة للسماح بقايا المذيبات تتبخر.

2.2 درجة الحموضة Electrospinning المستجيبة PLGA السقالات

  1. إعداد السقالات دمج الحموضة nanosensors تستجيب كما هو موضح في القسم 2.1 ولكن مع تعديل مضيفا nanosensors إلى حل البوليمر (5 ملغ / مل). تعليق nanosensors في حل PLGA بمساعدة ultrasonication (حوالي 5 دقائق) قبل لوضع في حقنة 10 مل.

2.3 SEM من PLGA سقالة ودرجة الحموضة سقالة المستجيبة

  1. وضع عينة من السقالة PLGA أو درجة الحموضة سقالة تستجيب على الكربون المغلفة الإلكترون المجهر كعب والمضي قدما كما هو موضح لوزارة شؤون المرأة من nanosensors (الشكل 1).

2.4 معايرة درجة الحموضة سقالة المستجيبة

  1. وضع عينة من درجة الحموضة سقالة تستجيب إلى لوحة الثقافة 35 مم وتزج في المحاليل المناسبة.
  2. على المجهر متحد البؤر استخدام الأرجون ليزر 488 نانومتر لإثارة FAM و568 نانومتر ليزر كريبتون لإثارة TAMRA داخل nanosensors. مراقبة الانبعاثات مضان لدرجة الحموضة السقالات استجابة في 500-530 نانومتر لFAM و558-580 نانومتر لTAMRA. (الشكل 2). استخدام المسح المتتابع لتجنب مجموعة من موجات الإثارة.

3. الثقافة الخلية على PLGA السقالات والشدات درجة الحموضة المستجيبة PLGA

ntent "> ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ التالية في خزانة ثقافة الخلية.

3.1 إعداد PLGA سقالات للثقافة الخليوي

  1. خفض درجة الحموضة أو PLGA السقالات PLGA استجابة إلى 2 سم 2 قطعة.
  2. تعقيم السقالات بواسطة تشعيع مع الأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء على مسافة 8 سم لمدة 15 دقيقة كل جانب.
  3. نقل السقالات لوحة الثقافة 12 جيدا ووضع حلقة من الصلب على القمة. إضافة محلول البنسلين / الستربتوميسين (5٪ ت / ت) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى داخل وخارج حلقة من الصلب، واحتضان بين عشية وضحاها (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). ملاحظة تم تصنيعها في حلقة من الصلب في جامعة نوتنغهام، وأبعاد التالية: 2 سم القطر الخارجي، 1 سم القطر الداخلي، عمق 1 سم.
  4. إزالة الحل تعقيم وغسل مع برنامج تلفزيوني.
  5. إضافة خلية سائل الإعلام والثقافة إلى الداخل (500 ميكرولتر) وخارجها (500 ميكرولتر) من حلقة من الصلب، ومكان في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2
  6. إعداد تعليق خلية وتنفيذ عدد خلايا باستخدام مقايسة الاستبعاد التريبان الأزرق.
  7. إنشاء تعليق خلية لتحقيق عدد الخلايا من 1 × 10 6 خلية / مل.
  8. إزالة وسائل الإعلام من داخل وخارج الحلبة الصلب.
  9. استبدال مع prewarmed سائل الإعلام والثقافة الخلية على السطح الخارجي للحلقة من الصلب (1 م).
  10. إضافة 300 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى داخل الحلبة الصلب - لوحة الصخور الوراء وإلى الأمام بلطف لتوزيع الخلايا.
  11. وضع لوحة الثقافة خلية في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) - مرفق الخلية يجب حدثت في غضون 24 ساعة، ولكن لا تزال ثقافة لطالما يتطلب التجربة - منعش وسائل الاعلام كل 2-3 أيام.

3.2 Nanosensor التسليم إلى الخلايا المستزرعة على PLGA سقالة

  1. خلايا البذور على PLGA السقالة كما هو موضح في القسم 3.1. لهذه الدراسة على PLGA سقالة فارغة (لا إحتوىnanosensors نينغ) كان يستخدم بسبب تداخل الانبعاثات مضان عند التصوير.
  2. وضع الخلية سقالة المصنفة في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لمدة 72 ساعة للسماح للخلايا أن تنمو وتهاجر في جميع أنحاء سقالة قبل nanosensor التسليم.
  3. قبل nanosensor تسليم غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وتغيير وسائل الإعلام من وسائل الإعلام ثقافة القياسية لوسائل الإعلام الحرة والمضادات الحيوية في الدم، واحتضان (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لمدة 1 ساعة. ملاحظة: وسائل الإعلام ثقافة القياسية ل3T3 الخلايا ويتألف من التعديل المتوسطة النسر Dulbecco وتستكمل مع الجنين العجل المصل (10٪ (V / V))،-L الجلوتامين الحل (2 ملم)، البنسلين / الستربتوميسين (1٪ (V / V)) .
  4. خلال فترة الحضانة إعداد معقدة nanosensor-الحويصلية بواسطة sonicating لفترة وجيزة nanosensors (5 ملغ) مع Optimem (50 ميكرولتر) لإنشاء حل A.
  5. إنشاء الحل B عن طريق إضافة Lipofectamine لعام 2000 (5 ميكرولتر) إلى Optimem (45 ميكرولتر)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  6. إضافة الحلA إلى B الحل، يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتشكيل حل C الذي هو مجمع nanosensor-الحويصلية.
  7. إضافة الحل C (100 ميكرولتر) إلى الخلايا واحتضان (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لمدة 3 ساعة.
  8. إزالة الخلايا السقالات المصنفة من الحاضنة، ووسائل الإعلام نضح ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة برنامج تلفزيوني (1 مل) للسماح التصور الخلية الحية بواسطة المجهر متحد البؤر. ملاحظة: تم استخدام برنامج تلفزيوني في هذا البروتوكول بحيث الفينول المؤشر الأحمر موجودة في خلية ثقافة وسائل الإعلام لم تسبب تألق ذاتي وأيضا بسبب معايرة في درجة الحموضة المختلفة والتي يتم تنفيذها. ومع ذلك الفينول وسائل الإعلام الحرة الحمراء يمكن استخدامها لتحليل المدى الطويل الثقافات الخلية.
  9. تزج الخلية سقالة المصنفة في مخازن درجة الحموضة المختلفة ورصد استجابة nanosensors المرتبطة الخلايا.
  10. رصد PHI عن طريق تحديد نسبة كثافة مضان من FAM وTAMRA من خلال مراقبة مضان المجهري متحد البؤر باستخدام (فيقوإعادة 3).

3.3 Nanosensor الموقع داخل خلايا الثدييات

  1. احتضان الخلايا مع nanosensors تحتوي فقط الصبغة FAM كما هو موضح في القسم 3.2 (وذلك لأن الانبعاثات مضان من TAMRA في نفس المنطقة الطيفية كما LysoTracker الأحمر). إعداد هذه nanosensors كما هو موضح في القسم 1.1 ولكن مع إغفال إعداد وإضافة TAMRA.
  2. بعد فترة التسليم nanosensor تمييع LysoTracker الأحمر محلول المخزون إلى 50 نانومتر.
  3. إضافة قسامة من محلول مخفف (2 ميكرولتر) إلى الخلايا المستزرعة على السقالات PLGA.
  4. احتضان الخلايا مع LysoTracker الأحمر لمدة 1 ساعة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
  5. بعد فترة الحضانة إزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) قبل تغيير وسائل الإعلام لبرنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) (2 مل) استعدادا للعرض باستخدام متحد البؤر المجهري. ملاحظة: يمكن استخدام الفينول وسائل الإعلام الحرة حمراء بدلا من برنامج تلفزيوني.
  6. إضافة وصمة عار النووية ذراعQ5 إلى برنامج تلفزيوني وبالتالي فإن تركيز النهائي هو 5 ميكرومتر واحتضان مع الخلايا لمدة 3 دقائق (37 درجة مئوية 5٪ CO 2). فإنه ليس من الضروري تغيير وسائل الاعلام بعد فترة الحضانة مع Draq5.
  7. استخدام الليزر 488 نانومتر الأرجون لإثارة FAM nanosensors فقط، والكريبتون الليزر 568 نانومتر لإثارة LysoTracker الأحمر و 633 نانومتر الهيليوم / نيون ليزر لإثارة حامل اللون Draq5 ومراقبة مضان في 500-530 نانومتر، 580-600 نانومتر، 650 -750 نانومتر على التوالي (الشكل 3). استخدام المسح المتتابع لتجنب مجموعة من موجات الإثارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تميزت توزيع حجم الرقم الهيدروجيني nanosensors استجابة استعداد باستخدام SEM، حيث تم قياس سكان nanosensors تصوير وجدت لديك أبعاد نانومتر في نطاق 240-470 نانومتر (الشكل 1A). تحقيق قطره ضيقة وصغيرة معقول يتسق مع استخدام أسلوب ستوبر لإعداد النانوية. فقد وجد أن استخدام بيئة درجة الحموضة الأساسية خلال تجميع الجسيمات النانوية أي النانوية إعدادها باستخدام أسلوب ستوبر، يسمح مراقبة جيدة من حجمها، في حين إعداد باستخدام الظروف الحمضية تنتج التشتت واسعة في حجم الجسيمات. وتظهر الميكروسكوب SEM ممثل الألياف electrospun PLGA ملفقة باستخدام الطرق الموضحة في الشكل 1B مما يدل على أن السقالة PLGA أنتجت يتكون من ألياف محبوكة عرض الحد الأدنى من الديكور أو الكسر حيث لديهم ألياف أبعاد نانومتر. الشكل 1C الشكل 1B، توفر الميكروسكوب SEM دليل الجمعيات nanosensor على السطح من الألياف إلا أنها قد كما أن تدمج داخل الألياف السقالة، يمكن إجراء دراسات تدهور هذه السقالات السقالات / nanosensor بها بالتعاون مع وزارة شؤون المرأة و / أو متحد البؤر المجهر لتحديد ما إذا كان هذا يؤثر على أداء nanosensor.

تم التحقق من قدرة nanosensors للاحتفاظ نشاطهم البصرية التالية إدماجها في الألياف PLGA عن طريق فحص السقالات الإبلاغ الذاتي باستخدام متحد البؤر المجهري. الإبقاء على القدرة على البقاء بصريا ونشطة كيميائيا عندما تدمج الألياف السقالة قد تمكن تركيزات تحليلها ليتم رصدها. أظهرت مضان المنبعثة من nanosensors أن nanosensors صetained نشاطهم البصرية وترتبط مع ألياف السقالة. مضان المنبعثة من FAM الأصباغ (الخضراء) وTAMRA (الأحمر) تأسست في nanosensors استجابة درجة الحموضة هو مبين في الأرقام 2A و 2B على التوالي. هذا هو نتيجة الإيجابية التي تجعل من الممكن لتركيزات الحليلة أن يتم رصدها في الموقع. كما أنها المرة الأولى التي أدرجت nanosensors ratiometric نشطة ضوئيا إلى ألياف سقالة PLGA باستخدام عملية electrospinning. بعد أن أكد أن nanosensors يمكن تصور باستخدام المجهر مضان بعد التأسيس إلى ألياف PLGA، تم التحقق من الاستجابة للتغيرات في nanosensor تركيز الحليلة. تخبط السقالة في مخازن مختلفة من درجة الحموضة أدى إلى تغيير كثافة مضان من صبغ FAM بينما مضان المنبعثة من الإشارة صبغ TAMRA لم تتغير بشكل ملحوظ. نسبة كثافة الفلورسنت من كلا الأصباغ يمكن استخدامها لهمزفوسي منحنى المعايرة كما هو مبين في الشكل 2C. منحنى المعايرة لnanosensors تقييم وحده، وعندما تدمج electrospun PLGA السقالة هو للمقارنة ويوضح أن nanosensors الاحتفاظ نشاطهم البصرية التالية إدماجها في السقالات الإبلاغ الذاتي. تم تقييم قدرة السقالة الإبلاغ الذاتي للاستجابة عكسية لقيم درجة الحموضة مختلفة بغمر بالتناوب السقالة في مخازن مع قيم درجة الحموضة من 5.5 و 7.5. تم العثور على العودة إلى الوراء لتكون جيدة جدا كما هو مبين في الشكل 2D حيث السقالة الإبلاغ الذاتي يمكن أن تستجيب للعديد من التغيرات الدورية في درجة الحموضة. لم يتم إجراء دراسات على المدى الطويل لتقييم تأثير تدهور PLGA على إدماج nanosensor؛ يعتقد أن لأن nanosensors توفير استجابة ratiometric فإن كمية nanosensors الحالي لن يؤثر على النتيجة.

تم تسليم الحليلة nanosensors استجابة باستخدام liposomآل كيل ترنسفكأيشن على البيئة داخل الخلايا الليفية 3T3 الذي كان مدعوما من السقالات PLGA فارغة النمو. إظهار الصور المجهري متحد البؤر من الخلايا الليفية 3T3 مثقف على السقالات PLGA الفارغة التي nanosensors ترتبط مع الخلايا الليفية مع مضان احظ من FAM وTAMRA هو مبين في الأرقام 3A وباء على التوالي. تتراكب مضان من هذه القنوات يدل على أن مضان من الأصباغ اثنين وشارك المترجمة، مما يدل على أن ظلت الأصباغ شرك داخل المصفوفة nanosensors 'حيويا (كما هو مبين من قبل مضان الأصفر في الشكل 3C). يعتقد أن nanosensors أن يكون ضمن السيتوبلازم من الخلايا الليفية 3T3 وليس الواردة في مقصورات الحمضية كما يتضح من عدم وجود مضان المترجمة المشترك من FAM فقط nanosensors وLysotracker صبغ الأحمر هو مبين في الشكل 3D. كثافة مضان من درجة الحموضة nanosensors تستجيب تقديمتم رصد إد ل3T3 الخلايا الليفية في حين تعرض الخلايا للتغيرات في درجة الحموضة والنتائج التي تظهر في الشكل 3E. الرسم البياني يوضح أن تنتج الخلايا المستزرعة على PLGA سقالة electrospun حافظت على PHI في نطاق 6،8-7،0.

الشكل 1
الشكل 1. الميكروسكوب SEM من nanosensors والألياف PLGA والسقالات الإبلاغ الذاتي. (أ) الرقم الهيدروجيني استجابة nanosensors سول هلام تظهر نانومتر الجزيئات كروية الحجم (B) PLGA electrospun الألياف محبوكة الألياف حيث التشكل هو العادية مع الحد الأدنى من الديكور وكسور (C) ودرجة الحموضة استجابة السقالات الإبلاغ الذاتي حيث nanosensors يمكن ملاحظة أن يبرز من يبقى PLGA التشكل بعد الألياف مقارنة مع السيطرة PLGA الألياف التي لا تحتوي على نانوensors. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 2

الشكل 2. الصور المجهري متحد البؤر من درجة الحموضة استجابة السقالات الإبلاغ الذاتي حيث يمكن ملاحظة مضان من nanosensors المرتبطة الألياف سقالة PLGA. (A) FAM (الأخضر) الصبغة استجابة درجة الحموضة و (ب) TAMRA (الحمراء) الصبغة المرجعية. (C) الرسوم البيانية معايرة درجة الحموضة استجابة nanosensors سول جل ودرجة الحموضة السقالات استجابة demonstمعدل أن الاستجابة البصرية والكيميائية للnanosensors لم يتأثر عندما تدمج داخل الألياف سقالة PLGA. (D) الانعكاسية من السقالة الإبلاغ الذاتي التي يقوم بها تخبط السقالة في المحاليل البديلة من درجة الحموضة 5.5 و 7.5 درجة الحموضة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 3
الرقم 3. الصور المجهري متحد البؤر الخلية nanosensors والرسوم البيانية من درجة الحموضة والاستجابة PHI المنضوية. الإسفار من nanosensors المنضوية (A) FAM (الأخضر) (B) TAMRA (أحمر) (C) شارك في توطين مضان من FAM وTAMRA (أصفر) ( D) FAM nanosensors فقط (الأخضر) تسليمها للثقافة 3T3 الخلايا الليفيةد على PLGA السقالة مع Draq5 (أرجواني) وسم نواة وLysoTracker الأحمر (الأحمر) وضع العلامات من الجسيمات الحالة. وfluoresence من FAM وLysotracker أحمر لا تشارك المترجمة بالتالي مما يدل على أن من غير المرجح أن nanosensors تم المنضوية في مقصورات الحمضية الخلوية القياسات (E) PHI مأخوذة من nanosensors تسليمها إلى الخلايا الليفية 3T3 مثقف بناء على PLGA سقالة فارغة مقارنة لمعايرة درجة الحموضة من سقالة درجة الحموضة الاستشعار دون ثقافة الخلايا. هذا يوضح أيضا أن قياسات درجة الحموضة تنفيذها باستخدام nanosensors المنضوية ليست حمضية مثل الخلايا المستزرعة على electrospun PLGA سقالة حافظت على PHI في نطاق 6،8-7،0. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هندسة الأنسجة يطمح لخلق بدائل البيولوجية التي يمكن استخدامها على حد سواء كما في الجسم الحي في المختبر مثل نماذج الأنسجة والعلاج في استبدال الأنسجة لإصلاح، استبدال، والحفاظ على أو تعزيز وظيفة الأنسجة أو عضو معين. وقد استخدمت البدائل الاصطناعية لسنوات عديدة لاستبدال أو إصلاح الأنسجة المساعدات ولكن غالبا ما تفشل هذه بسبب ضعف الاندماج مع النسيج المضيف و / أو عدوى، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى رفض عملية جراحية أخرى أو المراجعة. توليد الأنسجة الحية في المختبر قبل الزرع قد تناول مسألة تحقيق الاندماج الكامل وتقلل من الحاجة لإجراء عملية جراحية المراجعة. ومع ذلك، لهذا الهدف أن يتحقق ينبغي أن يقترن المناسبة نشر في المختبر، والتلاعب في الخلايا داخل بنيات 3D مع تكييف المادية المناسبة من الأنسجة في المختبر. ويمكن تحقيق ذلك في عدد من الطرق واحد يجري لمواصلة البحث في البيولوجيا الأساسيةتشارك ولكن أيضا للبحث في قضايا الهندسة والتصنيع المتعلقة بإنتاج البدائل الاصطناعية. هذا هو المسألة الأخيرة التي وصفت البروتوكول يهدف إلى المساهمة.

الاستخدام المقصود من السقالات PLGA صفها هو توفير الدعم المؤقت لخلايا الثدييات لمساعدة نموها إلى بنية ذات الصلة من الناحية البيولوجية. إدماج nanosensors الحليلة استجابة في السقالات PLGA قد تسمح تركيزات الحليلة المحلية التي يتعين رصدها في جميع أنحاء بناء 3D أثناء عملية نمو الأنسجة. استخدام الرقم الهيدروجيني السقالات استجابة يمكن أن تسمح بتحديد ما إذا كانت حمضية من المنتجات المنتجة ويحط السقالة وتنمو الخلايا يتم إزالة بشكل فعال من خلال بناء 3D. هذا هو خطوة نحو معالجة النقص الحالي في عملية الرصد والتحكم في عمليات تجديد الأنسجة في المختبر. استخدام السقالات التي يتم الاستشعار عن أنفسهم الأجهزة قد تمكن فيالوضع الطبيعي، في الوقت الحقيقي لتقييم microenvironmental. رصد المكروية بناء دون الإضرار الأنسجة أمر ضروري، وسوف تسمح عملية الرصد في جميع مراحل الإنتاج الأنسجة.

تم تقييم قدرة ودرجة الحموضة سقالة استجابة المنتجة للإبلاغ عن تركيز الحليلة المحلية من خلال مراقبة الانتاج مضان من nanosensors باستخدام متحد البؤر المجهري. تم إجراء تجربة معايرة لالسقالة درجة الحموضة الاستشعار عن بعد وأثبتت مماثلة لتلك التي من nanosensors استجابة درجة الحموضة لم تدرج في ألياف PLGA. القدرة على إنتاج منحنى المعايرة يدل على أن تبقى nanosensors تستجيب للتغيرات في درجة الحموضة عندما تدمج السقالة البوليمر وأيضا أن عملية تعقيم السقالات لم يسبب أي آثار ضارة على قدرة الاستشعار من nanosensors درجة الحموضة. علاوة على ذلك، تم تسليم nanosensors على البيئة داخل الخلايا من الخلايا المستزرعة على السقالات PLGA وهريمكن رصدها ه استجابة للتغيرات الخلوية في PHI. واستخدمت نسبة كثافة مضان من FAM وTAMRA لمراقبة PHI ومقارنة سقالة استجابة درجة الحموضة، مما يشير إلى أن الخلايا الليفية 3T3 حافظت على PHI في نطاق الأس الهيدروجيني 6،8-7. وأشار الليفية التفقيس 3T3 transfected مع nanosensors مع وصمة عار النووية Draq5 أن غالبية الخلايا المرتبطة nanosensors لم تقع في المنطقة النووية. لا تظهر موقع Nanosensor أن يكون في حدود مقصورات الحمضية مثل الإندوسومات أو الجسيمات الحالة على النحو الذي يحدده احتضان nanosensor transfected الخلايا الليفية 3T3 مع LysoTracker الأحمر، حيث سيتم يصور شارك في توطين FAM وLysoTracker الأحمر بواسطة بكسل الصفراء في الصور متحد البؤر. يمكن أن دراسات أخرى مثل تحليل من قبل انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) وتحديد العلامات البيولوجية لاستيعاب مسارات تحقق هذا أبعد من ذلك. بالإضافة إلى ذلك، دراسات طويلة الأمد مثل حل متحد البؤر المجهري الوقتيمكن تحديد مصير طويلة الأجل من nanosensors داخل الخلايا مثقف على السقالات الإبلاغ الذاتي. إذا كانت nanosensors ليتم تسليمها إلى أنواع الخلايا الأخرى ثم ينبغي تحديد مواقعها نتيجة قد لا تكون هي نفسها كما هو موضح هنا.

استخدام السقالات الإبلاغ الذاتي لديها القدرة على رصد noninvasively الظروف microenvironmental داخل الأنسجة المهندسة ويبني. يمكن أن لديها القدرة على أداء القياسات الموقعية تمكين تحسين نمو الأنسجة يبني 3D في المختبر وnoninvasively في الوقت الحقيقي. موقع حشوية من nanosensors استجابة درجة الحموضة يمكن استخدامها لمراقبة PHI خلال التجريب المستمر. وnanosensors تسليمها إلى البيئة الداخلية للخلايا أو السقالات الإبلاغ الذاتي يمكن استخدامها على حد سواء في إطار نظم زراعة الأنسجة ساكنا أو متحركا ويمكن أن يؤدي إلى تحديد شروط الثقافة اللازمة لنمو الأنسجة المهندسة الأمثل ليبني فيالمختبر. مزيد من التطوير يمكن أن يؤدي إلى نظام على الانترنت التي تعمل على نضوب المغذيات ضمان إمدادات ثابتة من المواد المغذية والأكسجين في جميع أنحاء بناء، مما يتيح في نهاية المطاف طريقة استنساخه للغاية لثقافة بنيات الأنسجة.

وقد أعدت بروتوكولات وصف السقالات ذات أبعاد مناسبة للسماح باستخدام التصوير المجهري متحد البؤر ولكن، لتمكين أكبر 3D يبني ليمكن تصوير متعدد الفوتون الإثارة قد تكون مطلوبة للسماح التصوير داخل بنيات أعمق. وينبغي اختيار المعدات البصرية المستخدمة مثل العدسة المجهر لتحديد مسافة العمل الأمثل للعدسة وأبعاد بناء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

ومن المسلم به بتمويل من BBSRC التفضل (عدد المنح BB H011293 / 1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Fisher 32221
Anhydrous dimethylformamide (DMF) Sigma 270547
Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution Alfa Aesar 35574 diluted to 30% (v/v) with pure water
TEOS Sigma 13190-3
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma A3648
5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) Invitrogen C1311
6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) Invitrogen C1171
Sodium phosphate monobasic (0.2 M) Sigma Aldrich S-9638
Sodium phosphate dibasic (0.2 M) Sigma Aldrich S-0876
NaOH Sigma Aldrich S8045
Trypsin/EDTA Sigma Aldrich T4174
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P0781
PBS Sigma Aldrich D8537
DMEM Sigma Aldrich D6046
FBS Source Bioscience Batch-213-101992
L-Glutamine Sigma Aldrich G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Optimem Invitrogen 11058-021
LysoTracker Red Invitrogen L-7528
Draq5 Biostatus Ltd DR50050
Nitrogen gas BOC
DCM Sigma Aldrich 320269
TFA Sigma Aldrich T6508
Confocal microscope Leica TCS-SP equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens
UV light UVLS28 UVP, USA
Stirrer plate SB161-3 Jencons-PLS
pH meter Jenway model 3510
Rotary Evaporator Buchi Rotary Evaporator R200
Centrifuge (nanosensors) Hermle Z300
Centrifuge (cell culture) Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo
Vortex Whirlimixer Fisherbrand
Ultrasonicator FB11021 Fisherbrand
Aluminum sheet Nottingham University
35mm cell culture plate Iwaki 3000035
10 ml syringe Becton Dickenson
3T3 Fibroblast cells European Collection of Cell Cultures
PLGA Lakeshore Biomaterials 7525 DLG 7E
Pyridinium formate Sigma Aldrich P8535
Trypan blue Sigma Aldrich T8154
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S9638
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S5136
HCl Sigma Aldrich 320331

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
  2. Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
  3. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
  4. Li, D., Xia, Y. N. Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel? Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).
  5. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
  6. Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
  7. Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
  8. Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
  9. Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
  10. You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
  11. Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).
  12. Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
  13. Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
  14. Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
  15. Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
  16. Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
  17. Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
  18. Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
  19. Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 81، مواد حيويا، Nanosensors، سقالة، electrospinning، ثقافة الخلية 3D، PLGA
سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harrington, H., Rose, F. R. A. J.,… More

Harrington, H., Rose, F. R. A. J., Aylott, J. W., Ghaemmaghami, A. M. Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture. J. Vis. Exp. (81), e50608, doi:10.3791/50608 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter