Summary
Biokompatible pH responsive sol-gel nanosensorer kan inkorporeres i poly (mælke-co-glycolsyre) (PLGA) Electrospun stillads. De producerede selvrapportering stilladser kan bruges til in situ overvågning af microenvironmental, men samtidig dyrkning af celler på stilladset. Dette er en fordel, da 3D cellulære konstruktion kan overvåges i realtid uden at forstyrre eksperimentet.
Abstract
Dyrkning af celler i 3D på passende stilladser menes at bedre efterligne in vivo mikromiljø og øge celle-celle interaktioner. Den resulterende 3D cellulære konstruktion kan ofte være mere relevant at studere de molekylære begivenheder og celle-celle interaktioner end lignende forsøg studeret i 2D. At skabe effektiv 3D-kulturer med levedygtighed høj celle i hele stilladset dyrkningsbetingelserne såsom ilt og pH skal nøje kontrolleres som gradienter i analytkoncentration kan findes i hele 3D-konstruktion. Her beskriver vi metoder til at forberede biokompatible pH responsive sol-gel nanosensorer og deres inkorporering i poly (mælkesyre-co-glykolsyre) (PLGA) Electrospun stilladser sammen med deres efterfølgende forberedelse til dyrkning af pattedyrceller. PH-reagerende stilladser kan anvendes som værktøjer til at bestemme microenvironmental pH inden en 3D cellulær konstruktion. Desuden er vi detalje leveringen af pH lydhør nanosensors til det intracellulære miljø af mammale celler, hvis vækst blev understøttet af Electrospun PLGA stillads. Det cytoplasmatiske placering af pH-reagerende nanosensorer kan anvendes til at overvåge intracellulære pH (pHi) under igangværende eksperimenter.
Introduction
En vigtig strategi i vævsteknik er brugen af biokompatible materialer til at fabrikere stilladser, hvis morfologi ligner det væv, at det kommer til at erstatte og er også i stand til at understøtte cellevækst og funktion 1,2. Stilladset giver mekanisk støtte ved at tillade cellebinding og proliferation tillader alligevel cellemigrering gennem mellemrummene i en 3D cellulær konstruktion. Stilladset skal også give mulighed for transport af celle næringsstoffer masse og ikke hæmme fjernelsen af metaboliske affald 3.
Electrospinning er dukket op som en lovende metode til fremstilling af polymere stilladser stand til at understøtte cellevækst 4-6. De ikke-vævede Electrospun fremstillede fibre er egnede til cellevækst, som de ofte er porøse og tillader celle-celle-interaktion samt cellemigrering gennem mellemrummene i en 3D cellulær konstruktion 7. Det er vigtigt at overvåge cellelevedygtighed under tHan periode af kultur og sikre, at cellernes levedygtighed opretholdes i hele 3D-konstruktion. For eksempel dyrkningsbetingelser, såsom oxygen og pH kræver omhyggelig kontrol som gradienter i analytkoncentrationen kan eksistere i 3D-konstruktionen. Bioreaktorer eller perfusion systemer kan anvendes til at efterligne in vivo betingelser interstitiel flow og en overførsel resultat forøgelse af næringsstoffer og fjernelse 8 metaboliske affald. Spørgsmålet om, hvorvidt sådanne systemer sikrer konstante microenvironmental forhold kan løses ved at vurdere den cellulære mikromiljø i real-tid.
Vigtige microenvironment målinger, der kan overvåges i realtid omfatter: temperatur, kemisk sammensætning af celle medier, koncentration af opløst ilt og kuldioxid, pH og fugtighed. Af disse målinger kan temperaturen lettest overvåges ved hjælp af in situ-prober. Metoder til overvågning af de resterende børsnoterede målinger almindeligt ivolve fjernelse af en portion til prøveudtagning og dermed forstyrre den celle kultur og øge risikoen forurening. Kontinuerlig, real-time metoder er der søges. Nuværende overvågningsmetoder normalt stole på instrumenter, der fysisk probe cellulær konstruktion såsom en pH-monitor eller ilt sonde. Dog kan disse indgribende metoder beskadige cellulære konstruktion og forstyrre den igangværende eksperiment. Noninvasiv monitorering af analytkoncentrationer inden for 3D-konstruktion kunne gøre det muligt real-time overvågning af forskellige miljømæssige aspekter såsom næringsstof udtynding 9. Dette ville muliggøre vurdering af næringsstofforsyning til dybere regioner i struktur og afgøre, om metaboliske affald blev fjernet effektivt 10,11. Systemer, der forsøger at løse problemet er invasiv involverer generelt brug af et perfusionskammer der passerer dyrkningsmedium gennem både kultur fartøj og til eksterne sensorer til overvågning af pH, ilt og glukose 12. Denre er voksende interesse i at udvikle sensorer, der kan integreres direkte i dyrkningsbeholderen, som ikke kræver fjernelse af en portion til prøveudtagning, og som sådan ville give in situ overvågning.
For at imødegå sådanne mangler til in situ og ikke-invasiv monitorering af microenvironmental betingelser, vi har indarbejdet analyt responsive nanosensorer i Electrospun stilladser til at producere selvrapportering stilladser 13. Stilladser, der fungerer som detekteringsanordninger ved at overvåge fluorescens aktivitet, er blevet fremstillet tidligere, hvor affølingsanordningen var enten den faktiske polymere stillads lavet af electrospinning eller ved anvendelse af en analyt reagerende farvestof, som er inkorporeret i polymeren forud for stillads dannelse 14,15 . Men disse følere har potentiale til at give fejlagtige optiske udgange forårsaget af mulig interferens fra andre analytter. Anvendelsen af en ratiometrisk detekteringsanordning such som dem, der fremstilles i den beskrevne protokol har potentiale til at eliminere disse mulige bivirkninger og give en reaktion specifik for analysanden pågældende.
De Electrospun stilladser præsenteres her, er blevet fremstillet af den syntetiske co-polymer poly (mælkesyre-co-glykolsyre) (PLGA), som er udvalgt på grund at have Food and Drug Administration (FDA) godkendelse på grund af dets biologisk nedbrydelige og biokompatible egenskaber, og et spor referat af støtte væksten og funktionen af forskellige celletyper 16-18. De forberedte ratiometrisk analyt responsive nanosensorer er lydhøre over for pH. Nanosensorerne optage to fluorescerende farvestoffer i en biokompatibel sol-gel-matrix, hvor et farvestof, FAM reagerer på pH og den anden TAMRA fungerer som en intern standard, da det ikke reagerer på pH. Endvidere fluorescensen af både FAM og TAMRA kan analyseres separat som de ikke i væsentlig grad overlapper. At bestemme forholdet mellem fluorescens emission begge farvestoffer ved specifikke bølgelængder giver en pH-reaktion uafhængig af andre miljøforhold. De selvrapportering stilladser kan tillade gentagelse vurdering af pH in situ og i real-tid uden at forstyrre den udviklede 3D-model. Vi har vist, at disse stilladser er i stand til at understøtte cellefastgørelse og spredning og forblive lydhør over for analysanden pågældende. Kinetikken af sure biprodukter i manipuleret konstruktioner forbliver understudied og som sådan ved hjælp af pH-reagerende stilladser kan i høj grad lette sådanne undersøgelser 19. Desuden er brugen af selvrapportering stilladser til vævsdyrkningsapplikationer præsenterer mulighed for fuldt ud at forstå, overvåge og optimere væksten af 3D-modellen vævskonstruktioner in vitro, noninvasively og i real-tid.
De pH responsive nanosensorer er også blevet leveret til det intracellulære miljø af fibroblaster dyrket på electrospun PLGA stilladsetds. Forholdet mellem fluorescensemission fra farvestofferne blev anvendt til at overvåge pHi og sammenlignet med en selvstændig rapportering stillads Omfattende pH nanosensorer. Leveringen af nanosensorer til celler dyrket i et 3D-miljø kunne muliggøre overvågning af analytkoncentrationen dybt i konstruktionen på en destruktiv måde. Derfor nanosensorer kan være en levedygtig billedbehandling værktøj for ikke-destruktivt vurdere celle adfærd i 3D konstruktioner tillader langsigtet analyse. Screening analysandkoncentrationen af de enkelte celler inden for en 3D-konstruktion kunne sikre, at de modtager tilstrækkelige koncentrationer af næringsstoffer og ilt. Overvågning procesparametre kunne bidrage til udviklingen af standardiserede teknikker til effektiv masse transport af ilt og næringsstoffer. Leveringen af nanosensorer til det intracellulære miljø og inkorporering af nanosensorer til polymere stilladser kunne kombineres for at muliggøre vurdering af celleviabilitet samt stillads resultater inden 3D constructs under vævsvækst processen. Dette kan føre til øget viden om disse konstruktioner og fremskridt i fremstilling af biologisk relevante væv erstatninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Oversigt
Afsnit 1 beskriver fremstillingen af pH-reagerende nanosensorer og karakterisering af nanosensor reaktion på pH ved hjælp af fluorescens spektrometri og deres størrelse ved hjælp af SEM.
Afsnit 2 beskriver fremstillingen af Electrospun polymerskeletter og karakterisering af deres morfologi og størrelse ved hjælp af SEM. Afsnit 2 beskriver også fremstillingen af selvrapportering stilladser, som er Electrospun stilladser med inddragelse af pH-reagerende nanosensorer. De resulterende selvrapportering scaffolds er kendetegnet ved SEM at vurdere, om nogen morfologiske ændringer i Electrospun fibre har fundet sted. Den fluorescens fra selvrapportering stilladser som følge af de indarbejdet nanosensorer vurderes af konfokal mikroskopi.
Afsnit 3 beskriver den kultur af celler på den electrospun stillads og selvrapportering stillads. De stilladser steriliseres først i preparation til cellekultur, hvorefter stilladserne vurderes at afgøre, om sterilisation og kulturen af celler påvirker fluorescens evne af selvrapportering stillads. Protokollen beskriver også levering af nanosensorer til celler, der er dyrket på Electrospun stillads. LysoTracker farvestof bruges til at sikre, at der ikke er taget i cellulære sure rum nanosensorer.
1.. Forberedelse og analyse af pH Responsive Sol-gel Nanosensorer
1.1 Forberedelse af pH Responsive Sol-gel Nanosensorer
Bemærk: Denne forberedelse skal udføres i et stinkskab.
- Forbered fluoroforer til anvendelse inden for pH Nanosensorerne ved at opløse 5 - (and-6)-carboxyfluorescein, succinimidylester (FAM-SE) (1,5 mg) i dimethylformamid (DMF) (1 ml) i en rundbundet kolbe, og 6-carboxytetramethylrhodamin , succinimidylester (TAMRA-SE) (1,5 mg) i DMF (1 ml) i en anden rundbundet kolbe.Tilsæt 3-aminopropyltriethoxysilan (APTES) (1,5 ml) til hver kolbe og omrøres under en tør nitrogenatmosfære (21 ° C) i 24 timer i mørke, dvs wrap prøverne i folie.
- Læg begge de ovennævnte farvestoffer (250 pi) til en blanding af ethanol (6 ml) og ammoniumhydroxid (30 vægt%, 4 ml) indeholdt i en rundbundet kolbe, og der omrøres i 1 time (21 ° C).
- Tilsæt langsomt tetraethylorthosilicat (TEOS) (0,5 ml) til blandingen, omrøring fortsættes i yderligere 2 timer. Blandingen vil slå uklar. Nanosensorerne kan opsamles ved roterende fordampning. Nanosensorer kan opbevares i et hætteglas ved 4 ° C til fremtidig brug.
ADVARSEL: videre håndtering af nanosensorer i deres tør form skal udføres i et stinkskab eller i tilfælde af vejning dem resten skal vedlægges, for eksempel i en Weighsafe.
1.2 Nanosensor Reaktion på pH
- Forbered Sørensens fosfatbuffer løsninger lige fra pH 5,5-8,0 ved mixing specifikke forhold af monobasisk natriumphosphat (0,2 M) og dibasisk natriumphosphat (0,2 M) stamopløsninger. Kontroller endelige pH-værdi ved hjælp af et pH-meter. Foretag eventuelle mindre justeringer af pH ved hjælp af natriumhydroxid (NaOH) (4 M) eller saltsyre (HCl) (2 M).
- Suspender pH Nanosensorerne i pH-buffere (5 mg / ml) ved først at holde beholder indeholdende nanosensor løsning på en vortex i 3 minutter og derefter nedsænke fartøjet i et ultralydsapparat, indtil opløsningen bliver uklar (ca. 5 min.) Gentag disse trin for fuldt ud at suspendere nanosensorer i opløsning.
- Placer den første løsning til et optisk kuvette og bruge excitationsbølgelængder af 488 nm for 5 - (and-6)-carboxyfluorescein (FAM) og 568 nm for 6-carboxytetramethylrhodamin (TAMRA). Saml emissionsbølgelængderne ved 500-530 nm for FAM og 558-580 nm for TAMRA ved hjælp af en fluorescens spektrometer.
- Skift løsningerne i den optiske kuvette, således at pH kan observeres ved forskellige pH-og fortsætte collecting emissionsspektrene.
- Beregn forholdet mellem emission maxima ved hvert pH-værdi til at frembringe en kalibreringskurve.
1.3 SEM af Nanosensorer
- Placer en prøve af nanosensorer på en kulstof belagt elektronmikroskop stub og sputter frakke med guld i 5 min under en argon atmosfære.
- Observere ved scanning elektronmikroskopi (SEM). Under billeddannelse justere arbejdsafstand, spænding og forstørrelse for at minimere elektron opladning (figur 1).
2. Forberedelse og analyse af PLGA Stilladser
2.1 Electrospinning PLGA Stilladser
- I et stinkskab opløse poly (mælkesyre-co-glycolsyre) (PLGA) i dichlormethan (DCM) (20% (vægt / vægt)) med pyridinium-formiat (PK) (1% (vægt / vægt)). Placer opløsning i en 10 ml sprøjte med en 18 G stump fyld nål og sikkert fit til sprøjtepumpe.
- Afstand nålespidsen 20 cm væk fra en 20cm x 15 cm aluminium indsamling plade.
- Fastgør elektrode af høj spænding strømforsyning til spidsen af sprøjten og jorden til aluminium indsamling plade.
ADVARSEL: Der skal udvises forsigtighed, da højspænding anvendes, dvs altid slå strømforsyningen fra, før håndtering af enhver af electrospinning udstyr. - Leverer løsningen ved hjælp af en konstant strømningshastighed på 3,5 m / time ved 12 kV i 2 timer. Electrospinning hjælp af disse forhold skal give et stillads dybde på cirka 60 um.
- Lad stilladset i et stinkskab i 24 timer for at tillade opløsningsmiddelresten fordampe.
2.2 Electrospinning pH Responsive PLGA Stilladser
- Forbered stilladser inkorporerer pH responsive nanosensorer, som beskrevet i afsnit 2.1, men med den modifikation at tilføje nanosensorer til polymeropløsningen (5 mg / ml). Suspendere nanosensorer i PLGA løsning med bistand af ultralydsbehandling (ca. 5 min) forud at placere ind i en 10 ml sprøjte.
2.3 SEM PLGA Stillads og pH Responsive Scaffold
- Placer en prøve af PLGA stillads eller pH lydhør stillads på en kulstof belagt elektronmikroskop stub og fortsæt som beskrevet for SEM af nanosensorer (Figur 1).
2.4 Kalibrering af pH-Responsive Scaffold
- Placer en prøve af pH lydhør stillads i en 35 mm kultur tallerken og læg det i passende bufferopløsninger.
- På en konfokal mikroskop bruger en 488 nm argon laser til at ophidse FAM og en 568 nm krypton laser til at hidse TAMRA inden for nanosensorer. Overhold fluorescensemissionen for pH responsive stilladser ved 500-530 nm for FAM og 558-580 nm for TAMRA. (Figur 2). Brug sekventiel scanning for at undgå samling af excitationsbølgelængder.
3. Cell Culture upon PLGA stilladser og pH Responsive PLGA stilladser
ntent "> Bemærk: Følgende skal udføres i en cellekultur kabinet.3.1 Udarbejdelse af PLGA Stilladser for Cell Culture
- Skær PLGA eller pH responsive PLGA scaffolds i 2 cm2 stykker.
- Steriliser stilladser ved bestråling med ultraviolet (UV) lys ved en afstand på 8 cm i 15 minutter hver side.
- Overfør stilladser til en 12-brønds kultur tallerken og læg en stålring på toppen. Tilsæt en opløsning af Penicillin / Streptomycin (5% v / v) i phosphatpufret saltvand (PBS) på indersiden og ydersiden af stålring, inkuberes natten over (37 ° C, 5% CO 2). Bemærk stålring blev fremstillet ved The University of Nottingham og har følgende dimensioner: 2 cm ydre diameter, 1 cm indvendig diameter, 1 cm dybde.
- Fjern steriliserende opløsning og vaskes med PBS.
- Tilføj cellekulturmedier på indersiden (500 ul) og uden (500 ul) af stålring, sted i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2
- Der fremstilles en cellesuspension og udføre en celletælling under anvendelse af et Trypan Blå udelukkelse assay.
- Opret en cellesuspension for at opnå et celleantal på 1 x 10 6 celler / ml.
- Fjern medier fra indersiden og ydersiden af stålring.
- Udskift med forvarmet cellekulturmedier på ydersiden af stål ring (1 m).
- Der tilsættes 300 pi af cellesuspensionen til indersiden af stålring - sten plade frem og tilbage forsigtigt, cellerne.
- Placer celledyrkningspladen i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) - bør cellevedhæftning har fundet sted i 24 timer, dog dyrkes så længe eksperimentet kræver - forfriskende medierne hver 2-3 dage.
3.2 Nanosensor Levering til celler dyrket på PLGA Scaffold
- Seed celler på PLGA stillads, som beskrevet i afsnit 3.1. For denne undersøgelse en tom PLGA stillads (ikke contaiNing nanosensorer) blev anvendt på grund af overlapning af fluorescensemission når billeddannelse.
- Anbring cellen seeded stilladset i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 72 timer for at tillade celler at vokse og migrere hele stilladset før Nanosensor levering.
- Før Nanosensor levering vaske cellerne med PBS og ændre medier fra standard dyrkningsmedier til antibiotika og serum frie medier, inkuberes (37 ° C, 5% CO 2) i 1 time. Bemærk: standard dyrkningsmedier til 3T3-celler består af Dulbeccos Modified Eagle-medium suppleret med føtalt kalveserum (10% (v / v)), L-glutamin-opløsning (2 mM), penicillin / streptomycin (1% (v / v)) .
- I løbet af inkubationstiden forberede nanosensor-liposomkomplekset ved kortvarigt sonicating nanosensorer (5 mg) med Optimem (50 ul) til at oprette løsning A.
- Lav opløsning B ved tilsætning af Lipofectamine 2000 (5 pi) til Optimem (45 ul), inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Tilføj løsningA til opløsning B, og der inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter til dannelse af opløsning C, der er nanosensor-liposom-komplekset.
- Tilsættes opløsning C (100 ul) til celler og inkuberes (37 ° C, 5% CO2) i 3 timer.
- Fjern cellen podet stilladser fra inkubatoren, aspiratprøver medier og vaskes to gange med PBS før tilsætning af PBS (1 ml) for at give levende celler visualisering ved konfokal mikroskopi. Bemærk: PBS blev anvendt i denne protokol, så phenolrød indikator til stede i cellekultur medier ikke forårsager autofluorescens og også fordi en kalibrering ved forskellige pH blev udført. Men phenolrødt frie medier kan anvendes til længere sigt analyse af cellekulturer.
- Fordyb cellen seedede stillads i buffere af forskellig pH og overvåge respons nanosensorer forbundet med cellerne.
- Overvåg pHi ved at bestemme forholdet af fluorescensintensiteterne fra FAM og TAMRA ved at observere fluorescens under anvendelse af konfokal mikroskopi (FiguAd 3).
3,3 Nanosensor Placering inden pattedvrceller
- Cellerne inkuberes med nanosensorer, der kun indeholder FAM farvestof, som beskrevet i afsnit 3.2 (dette er fordi fluorescensemissionen af TAMRA er i samme spektrale område som lysoTracker rød). Forbered disse nanosensorer, som beskrevet i afsnit 1.1, men med udeladelse af at udarbejde og tilføje TAMRA.
- Efter nanosensor leveringsperioden fortynde lysoTracker Red stamopløsning til 50 nm.
- Der tilsættes en portion af den fortyndede opløsning (2 pl) til celler dyrket på PLGA stillads.
- Inkubér cellerne med lysoTracker Rød for 1 time (37 ° C, 5% CO 2).
- Efter inkubationsperioden fjernes mediet og vaskes cellerne to gange med PBS (pH 7,4), før der skiftes mediet til PBS (pH 7,4) (2 ml) som forberedelse til visning ved hjælp af konfokal mikroskopi. Bemærk: phenolrødt frie medier kan anvendes i stedet for PBS.
- Tilsæt nukleare pletten DraQ5 til PBS, så slutkoncentrationen er 5 uM og inkuberes med cellerne i 3 minutter (37 ° C 5% CO 2). Det er ikke nødvendigt at ændre medierne efter inkubationsperioden med DRAQ5.
- Brug en 488 nm argon laser til at ophidse FAM kun nanosensorer, en 568 nm krypton laser til at vække lysoTracker Rød og 633 nm helium / neon laser til at vække DRAQ5 chromofor og observere fluorescens ved 500-530 nm, 580-600 nm, 650 -750 nm (figur 3). Brug sekventiel scanning for at undgå samling af excitationsbølgelængder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Størrelsesfordelingen af de fremstillede pH responsive nanosensorer blev karakteriseret ved hjælp af SEM, hvor populationen af nanosensorer afbildet blev målt og fundet at have nanometer dimensioner i området fra 240 til 470 nm (figur 1A). Opnåelsen af en smal og forholdsvis lille diameter er konsekvent med at bruge Stöber metode til at forberede nanopartikler. Det har vist sig, at anvendelse af en basisk pH-miljø under syntesen af nanopartikler, dvs nanopartikler fremstillet ved hjælp af Stöber metode tillader god kontrol af størrelse, hvorimod præparat anvendelse af sure betingelser, producerer en bred dispersion i partikelstørrelse. Repræsentative SEM micrographs af PLGA Electrospun fibre fremstillet under anvendelse af de beskrevne metoder er vist i figur 1B viser, at den producerede PLGA stillads består af ikke-vævede fibre, der udviser minimal beading eller brud, hvor fibrene har nanometer dimensioner. Figur 1C figur 1B, SEM micrographs dokumentere nanosensor sammenslutning på overfladen af fibrene, men de kan også indarbejdes i skafottet fibre, kan nedbrydning undersøgelser af disse stillads / nanosensor stilladser udføres i samarbejde med SEM og / eller konfokal mikroskopi at afgøre, om dette påvirker nanosensor ydeevne.
Evne til nanosensorer til at bevare deres optisk aktivitet efter inkorporering i PLGA fibre blev verificeret ved at undersøge selvrapportering stilladser ved hjælp af konfokal mikroskopi. Bevarelse af evne til at forblive optisk og kemisk aktive, når de inkorporeres i stillads fibre kunne gøre det muligt analytkoncentrationer skal overvåges. Den fluorescens udsendt fra nanosensorer viste, at nanosensorer retained deres optisk aktivitet og er forbundet med skafottet fibre. Fluorescens udsendt fra farvestofferne FAM (grøn) og TAMRA (rød) inkorporeret i pH responsive nanosensorer er vist i figur 2A og 2B. Dette er et positivt resultat, der gør det muligt for analytkoncentrationer kan overvåges in situ. Det er også første gang, at optisk aktive ratiometriske nanosensorer er blevet indarbejdet i PLGA stillads fibre ved hjælp elektrospinningsprocessen. Efter at have bekræftet, at de nanosensorer kan visualiseres ved hjælp af fluorescens mikroskopi efter inkorporering i PLGA fibre blev nanosensor reaktion på ændringer i analytkoncentrationen verificeret. Nedsænkning stilladset i buffere med forskellig pH resulterede i en ændring i fluorescensintensitet fra FAM farvestof, mens fluorescens, der udsendes af TAMRA henvisning farvestof ikke væsentligt ændret. Forholdet mellem fluorescerende intensitet af begge farvestoffer kan anvendes til proUCE en kalibreringskurve som vist i figur 2C. Kalibreringskurven for nanosensorer vurderes alene, og når de indgår i Electrospun PLGA stillads er sammenlignelige, og viser, at de nanosensorer bevarer deres optisk aktivitet efter inkorporering i selvrapportering stillads. Evne til selv-rapportering stillads til reversibelt at reagere på forskellige pH-værdier blev vurderet ved skiftevis at nedsænke stilladset i puffere med pH-værdier på 5,5 og 7,5. Reversibilitet blev fundet at være meget god, som vist i figur 2D, hvor den selv-rapportering stillads kan opfylde talrige cykliske ændringer i pH. Langsigtede undersøgelser er ikke blevet udført for at vurdere effekten af PLGA nedbrydning på nanosensor inkorporering, og det menes, at fordi nanosensorer giver en ratiometriske reaktion mængden af nanosensorer tilstedeværende vil ikke påvirke resultatet.
Analytspecifikke responsive nanosensorer blev leveret ved hjælp af et liposomal transfektion agent til det intracellulære miljø 3T3 fibroblaster hvis vækst blev understøttet af tomme PLGA stillads. Konfokal mikroskopi billeder af 3T3 fibroblaster dyrket på tomme PLGA stilladser viser, at nanosensorer er forbundet med fibroblastceller med fluorescens observeret fra FAM og TAMRA vist i figur 3A og B hhv. Overlejre fluorescens fra disse kanaler viser, at fluorescens fra de to farvestoffer er co-lokaliseret, hvilket tyder på, at farvestofferne har været indkapslet i Nanosensorerne 'biokompatibel matrix (som afbildet ved gul fluorescens i figur 3C). Nanosensorerne menes at være inden for cytoplasmaet i 3T3 fibroblaster og ikke indeholdt i sure rum som vist ved manglen på co-lokaliseret fluorescens fra FAM kun nanosensorer og lysoTracker Red dye afbildet i figur 3D. Fluorescensintensiteten pH responsive nanosensorer levereed til 3T3 fibroblaster blev overvåget, mens cellerne blev udsat for ændringer i pH, hvis resultater er vist i figur 3E. Den producerede graf viser, at celler dyrket på den electrospun PLGA stillads har opretholdt en pHi i intervallet 6,8-7,0.
Figur 1. SEM micrographs af nanosensorer, PLGA fibre og selvrapportering stillads. (A) pH responsive sol-gel nanosensorer viser sfæriske nanometer størrelse partikler (B) PLGA Electrospun nonwoven fibre, hvor fibermorfologi er regelmæssig med minimal beading og brud (C) pH responsive selvrapportering stilladser, hvor nanosensorer kan observeres at være stikker ud fra PLGA endnu fibermorfologi stadig sammenlignes med kontrol PLGA fibre, der ikke indeholder nanosSensorer. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Konfokal mikroskopi billeder af pH responsive selvrapportering stilladser, hvor fluorescens kan observeres fra nanosensorer forbundet med PLGA stillads fibre. (A) FAM (grøn) pH lydhør farvestof og (B) TAMRA (rød) reference farvestof. (C) Kalibrerings grafer af pH responsive sol-gel nanosensorer og pH responsive stilladser demonstsats, at den optiske og kemiske reaktion af nanosensorer ikke er blevet påvirket, når de indgår i PLGA stillads fibre. (D) reversibilitet af selvrapportering stillads udføres ved at nedsænke stilladset i alternative pufferoploesninger pH 5,5 og pH 7,5. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Konfokal mikroskopi billeder af celle internaliseret nanosensorer og grafer af pH og Phi respons. Fluorescens fra de internaliserede nanosensorer (A) FAM (grøn) (B) TAMRA (rød) (C) co-lokalisering af fluorescens fra FAM og TAMRA (gul) ( D) FAM kun nanosensorer (grøn) leveret til 3T3 fibroblaster kulturd upon PLGA stillads med DRAQ5 (magenta) mærkning af kernen og lysoTracker Red (rød) mærkning af lysosomer. Den fluorescens af FAM og lysoTracker rød er ikke co-lokaliseret derfor viser, at det er usandsynligt, at nanosensorer er blevet internaliseret i cellulære sure rum (E) PHI målinger fra nanosensorer leveret til 3T3 fibroblaster dyrket på en tom PLGA stillads i forhold til pH-kalibrering en pH-sensing stillads uden dyrkning af celler. Dette viser også, at pH-målinger udført ved hjælp af de internaliserede nanosensorer er ikke sure, da de celler dyrket på den electrospun PLGA stillads har opretholdt en pHi i intervallet 6,8-7,0. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vævsmanipulering aspirerer til at skabe biologiske erstatninger, der kan bruges både som in vivo som in vitro vævsmodeller og i væv substitutionsterapi til at reparere, udskifte, vedligeholde eller forbedre funktionen af et bestemt væv eller organ. Syntetiske erstatninger har været brugt i mange år til at erstatte eller hjælp reparation af væv, men disse ofte mislykkes på grund af dårlig integration med værten væv og / eller infektion, som i sidste ende fører til afvisning eller yderligere revision kirurgi. Generering levende væv i laboratoriet før implantation kan behandle spørgsmålet om at opnå fuld integration og mindske behovet for en revision kirurgi. Men for dette mål skal realiseres passende in vitro formering og manipulation af celler i 3D-konstruktioner bør kobles sammen med passende fysiske konditionering af væv in vitro. Dette kan opnås på en række måder, det ene er at fortsætte forskningen i den grundlæggende biologiinvolveret, men også at forske i teknik og produktion spørgsmål i forbindelse med produktion af syntetiske erstatninger. Det er denne sidstnævnte spørgsmål, at den beskrevne protokol har til formål at bidrage.
Den påtænkte anvendelse af de beskrevne PLGA stilladser er at give en midlertidig støtte til pattedyrceller for at hjælpe deres vækst i en biologisk relevant struktur. Inkorporering af analyt responsive nanosensorer i PLGA stilladser kunne give lokale analytkoncentrationer skal overvåges gennem et 3D-konstruktion i vævet vækstproces. Brugen af pH-responsive stilladser kan tillade bestemmelse af, hvorvidt sure biprodukter fremstillet som skafottet nedbrydes og cellerne vokser bliver effektivt fjernet fra et 3D-konstruktion. Dette er et skridt i retning af at løse den nuværende mangel på proces overvågning og kontrol af in vitro vævsregeneration processer. Udnyttelsen af stilladser, der er sig selv sensing enheder kan aktivere isitu, real-time microenvironmental vurdering. Overvågning af konstruktionen mikromiljø uden at beskadige vævet er afgørende og vil give procesovervågning i alle faser af væv produktion.
Evnen af den producerede pH reagerer stillads til at rapportere den lokale analytkoncentration blev vurderet ved at overvåge fluorescens-output fra de Nanosensorerne hjælp af konfokal mikroskopi. En kalibrering Forsøget blev udført for pH sensing stillads og viste sammenlignelig med pH-reagerende nanosensorer ikke er indarbejdet i PLGA fibre. Evnen til at frembringe en kalibreringskurve viser, at de nanosensorer forblive lydhør over for ændringer i pH når de indgår i polymer stillads, og også, at processen med sterilisering af stilladser ikke få negative konsekvenser for sensing evne pH nanosensorer. Desuden blev nanosensorer leveret til det intracellulære miljø af celler dyrket på PLGA scaffolds Wherkan overvåges e cellulære respons på ændringer i pHi. Forholdet fluorescensintensiteterne fra FAM og TAMRA blev anvendt til at overvåge pHi og sammenlignet med en pH-reagerende stillads, hvilket tyder på, at 3T3 fibroblastceller har opretholdt en pHi i pH-intervallet 6,8-7. Inkubering 3T3 fibroblaster transficeret med nanosensorer med nukleare pletten DRAQ5 indikerede, at størstedelen af celle associerede Nanosensorerne ikke var placeret i den nukleare region. Nanosensor placering ikke synes at være inden for sure rum såsom endosomer eller lysosomer som bestemt ved at inkubere nanosensor transficerede 3T3-fibroblaster med lysoTracker Rød, hvor co-lokalisering af FAM-og lysoTracker Red ville blive afbildet af gule pixel i konfokale billeder. Yderligere undersøgelser såsom analyse af transmissions elektron mikroskopi (TEM) og identifikation af biologiske markører for internalisering veje kunne bekræfte dette yderligere. Hertil kommer, langsigtede undersøgelser såsom tidsopløst konfokal mikroskopikunne bestemme den langsigtede skæbne nanosensorer inden celler dyrket på selvrapportering stillads. Hvis nanosensorer skulle leveres til andre celletyper, så deres placering skal identificeres som resultat ikke kan være den samme som vist her.
Brugen af selvrapportering stilladser har potentiale til noninvasively overvåge microenvironmental forhold inden manipuleret væv konstruktioner. Har evnen til at udføre målinger på stedet kunne gøre det muligt at optimere væksten af 3D vævskonstruktioner in vitro-invasivt og i realtid. Det cytoplasmatiske placering af pH-reagerende nanosensorer kan anvendes til at overvåge pHi under igangværende eksperimenter. Nanosensorerne leveret til det indenlandske miljø af celler eller selvrapportering stilladser kan både bruges i statiske eller dynamiske vævsdyrkningssystemer og kan føre til fastlæggelse af de dyrkningsbetingelser, der kræves for optimal vækst af manipuleret væv konstruktioner ivitro. Yderligere udvikling kan føre til en on-line system, der fungerer på næringsstof udtynding sikre en ensartet forsyning af næringsstoffer og ilt i hele konstruktionen, i sidste ende giver en meget reproducerbar metode til dyrkning af væv konstruktioner.
De beskrevne protokoller har forberedt stilladser med en passende størrelse til at tillade billeddannelse ved hjælp af konfokal mikroskopi dog at muliggøre større 3D konstruktioner, der skal afbildes multi-foton excitation kan være nødvendigt at tillade billeddannelse inden dybere konstruktioner. Den optiske udstyr, der anvendes som mikroskopet linse bør vælges til at bestemme den optimale arbejdsafstand for linsen og konstruktionen dimensioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Finansiering fra BBSRC er venligst anerkendt (tilskud nummer BB H011293 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N.
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
